原料药中残留溶剂限度的确定方法
气相色谱法测定原料药中的残留溶剂
气相色谱法测定原料药中的残留溶剂发布时间：2021-09-25T00:47:37.013Z 来源：《探索科学》2021年8月下16期作者：高倩魏浩明闫志营[导读] 建立气相色谱法测定原料药中的残留溶剂乙腈的分析方法，并对该方法进行相关的方法学研究及验证，充分保证了分析方法的准确性。
方法：色谱条件以聚乙二醇为固定液的毛细管柱（如Agilent DB-WAX，30m×0.32mm×0.5μm，或极性相近）为色谱柱；起始温度35℃，维持5分钟，以每分钟10℃的速率升温至200℃，维持2分钟；进样口温度为250℃；检测器为氢火焰离子化检测器（FID）；检测器温度为250℃；载气为氮气；载气流速为每分钟2.0ml；分流比为10:1；顶空瓶平衡温度80℃，平衡时间30分钟。
河南新天地药业股份有限公司高倩魏浩明闫志营河南省许昌市 461500[摘要]：建立气相色谱法测定原料药中的残留溶剂乙腈的分析方法，并对该方法进行相关的方法学研究及验证，充分保证了分析方法的准确性。
方法：色谱条件以聚乙二醇为固定液的毛细管柱（如Agilent DB-WAX，30m×0.32mm×0.5μm，或极性相近）为色谱柱；起始温度35℃，维持5分钟，以每分钟10℃的速率升温至200℃，维持2分钟；进样口温度为250℃；检测器为氢火焰离子化检测器（FID）；检测器温度为250℃；载气为氮气；载气流速为每分钟2.0ml；分流比为10:1；顶空瓶平衡温度80℃，平衡时间30分钟。
[关键词]：气相色谱法；乙腈；乙醇；残留溶剂；乙腈是合成原料药及医药中间体的常用溶剂，是一种无色液体，极易挥发，有类似于醚的特殊气味，有优良的溶剂性能，能溶解多种有机、无机和气体物质。
有一定毒性，与水和醇无限互溶。
乙腈能发生典型的腈类反应，并被用于制备许多典型含氮化合物，是一个重要的有机中间体。
根据原料药中残留溶剂的研究，我们分别从专属性、检测限、定量限、线性和范围这三个方面，对样品中的乙腈的残留进行研究分析，确定残留溶剂的检测方法快速简单、准确可靠。
USP(467)有机挥发性杂质—残留溶剂的限制
USP（467）有机挥发性杂质—残留溶剂的限制基于药典的要求，残留溶剂在此定义为有机挥发性化学物，它用于生产药物赋形剂，或药品制备过程中，通过规范的生产技术，不能将残留溶剂完全除去，在合成原料药或生产赋形剂过程中，选择适当的溶剂可提高产量或决定药物的外观，如晶型、纯度和溶解度。
因此，有机溶剂是合成过程的关键因素。
本章的指导原则不是指谨慎地用于赋形剂的溶剂，也不是溶剂化合物。
然而，在这样的产品中溶剂的含量应该被测定和判断。
因为残留溶剂不能提供药物功效，因此应去除所有的残留溶剂，更进一步的可能以符合产品规范，GMP或者基本质量要求。
原料药中残留溶剂的含量级别不能高于安全数据支持的残留溶剂级别。
已知溶剂可导致不可接受的毒性应避免在生产中使用，除非有特别的证明它的使用是合理的（一类溶剂）。
一些有较弱毒性的溶剂（二类）应限制使用，以保护病人出现潜在的不利影响。
低毒性溶剂清单不完整，其他可能使用的溶剂，以权威组织机构的批准为准，将会在清单中依次列入。
原料药，赋形剂和药品中残留溶剂的测试，应当在生产或者纯化过程中进行，它在生产或者纯化过程中出现的残留溶剂的测试才是必要的。
虽然生产商会选择性地测试药品，会使用各个成分中残留溶剂水平累积方法计算总残留溶剂水平，如果计算的结果等于或低于本章指导原则建议的溶剂水平，不用进行再测试。
如果高于规定的水平，应进行检测，以确定是否降低制备过程相关溶剂的量，使之在可接受量范围内。
如果一种残留溶剂在药品生产中出现，也应当进行检测。
一类一类残留溶剂（表1）不应该在原料药、赋形剂和药品生产中使用，因为这些溶剂是不可接受的毒性物质，且对环境有不良影响。
但是，如果使用一类溶剂，应根据表1限定它们的量，除非有独立专文支持。
表1中的三氯乙烷是环境有害物，≤1500PPM的限量是安全数据。
当在原料药、赋形剂和药品生产中使用一类溶剂，指导原则要求任何必要的地方，都要有对残留溶剂鉴别、控制和数量测试的方法的描述，除非引入适当的验证程序，这种程序应该符合在相关独立专文中的USP标准，见ICH。
残留溶剂检查方法的选择和验证要点
残留溶剂检查方法的选择和验证要点一、概述药物中的残留溶剂系指在原料药或辅料的生产中，以及制剂制备过程中使用的，但在工艺过程中未能完全去除的有机溶剂。
按有机溶剂的毒性和对环境的危害，ICH将有机溶剂分为避免使用、限制使用、低毒和毒性依据尚不足四种情况。
因残留溶剂会影响产品的安全性，故需对其进行研究。
二、残留溶剂检查方法的选择残留溶剂的测定一般采用气相色谱法，推荐使用毛细管色谱柱-顶空进样系统，当然也可以使用普通填充柱，溶液直接进样方法。
对不宜采用气相色谱法测定的含氮碱性化合物，如N-甲基吡咯烷酮等可采用其它方法，如离子色谱法等。
测定残留溶剂应从以下几个方面考虑：确定被测的有机溶剂、选择合适的色谱柱、制备供试品溶液和对照品溶液、选择合适的进样方法和满足检测灵敏度要求的检测器，下面分别进行介绍：1、确定被测的有机溶剂根据制备工艺确定被测有机溶剂的范围。
通常应对制备工艺过程中使用的二类以上溶剂和重结晶用溶剂，以及根据工艺特点要求的其它溶剂进行残留量的研究。
建议对合成最后三步使用的三类溶剂也进行研究，这样能更好地对未知峰进行归属；对制剂过程中使用的有机溶剂也建议考察其残留情况，特别是缓、控释微丸包衣过程使用的有机溶剂更应引起注意。
残留溶剂的限度要求同ICH的规定。
2、选择合适的色谱柱按照相似相溶的原理选择色谱柱。
毛细管柱有极性柱、非极性柱、弱极性柱和中等极性柱。
填充柱有高分子多孔小球或涂渍适宜固定液的填充柱。
测定含氮的碱性有机溶剂时，由于普通气相色谱仪的不锈钢管路、进样器衬管等对有机胺等含氮的碱性化合物具有较强的吸附作用，致使其检出的灵敏度降低。
通常采用弱极性色谱柱或经碱处理过的色谱柱分析含氮的碱性有机溶剂，如果采用胺分析专用柱进行分析，则效果更好。
3、供试品和对照品的制备顶空进样方法通常以水为溶剂，对于非水溶性的药物，可采用DMF、DMSO或其他适宜溶剂。
溶液直接进样方法用水或合适的溶剂溶解样品。
制备供试品的溶剂的选择应兼顾供试品和被测有机溶剂的溶解度，且所用溶剂应不干扰被测有机溶剂的测定。
残留溶剂的控制
顶空分析的优越性
Benefits of headspace analysis
原理： principle 将含有挥发性组分的样 品置于密闭系统中，在 一定温度下使样品中的 挥发性组分在气-液或气固两相甚至气-液-固三相 中的分配达到平衡，然 后取凝聚相上端的气体 送入气相色谱仪进行分 析。
优点
为什么建立极性相反的两个色谱系统？
1.4 1.2 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0.0 0.0
1X 2.0 4.0 6.0
1.2 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0.0 0.0
logTr
logTr
1X 1.0 2.0 3.0 4.0
在非极性的SPB-1柱上，分子连接性指数1X 与GC保留值有 较好的相关性；在极性的HP-FFAP柱上，分子连接性指数 与GC保留值没有相关性。提示非极性固定液与溶质的相互 作用主要取决于非极性结构色散力的大小；在极性固定液上， 除了色散力之外，还有偶极和诱导作用 。
GC method with compacted column could be used for process control in manufactures
其它色谱方法，如HPLC法测定吡啶、离子色谱法测定N-甲基吡咯烷酮 等，可作为气相色谱法的重要补充；
Some chromatographic methods such as HPLC for determining Pyridine, ion chromatography for N-Methylpyrrolidone，could be an important supplement of GC
Identical Limit with ICH
检测方法推荐采用顶空毛细管气相色谱法
原料药溶剂残留分析方法验证8大项
原料药溶剂残留分析方法验证
1.专属性：a、保留时间和相对保留时间，同一次检验误差可接受范围为±2%（具体怎么做呢？）b、分离度（这个药典上有说明）
2.精密度（是否取6份对照品依次进样，看被测残留溶剂色谱峰RSD＜10%？系统精密度，方法精密度各应怎么做？中间精密度：不同仪器、不同操作人员、不同时间，应该取几台仪器，几个操作人员，几个不同时间做？）
3.检测线
4.定量限（3、4两项中不同浓度梯度的样品，每个浓度需要配几分平行样品测？）
5.线性（应满足哪些数据要求？）
6.线性范围（5、6有什么不同？线性范围需要做几个点，一般范围取残留限量的多少范围内做？）
7.回收率（准确度）（取100%浓度，进六个平行样；或者取80%，100%，120%每个浓度各进3个平行样？哪种方案更好？）
8.耐用性（GC应具体做哪几个参数，参数变化范围在预定值的多大范围内做，结果在统计学上应满足何中要求）
1.专属性：可以用空白与样品的合样，不必用保留时间
2.精密度：总样品检样量多余3个，够算RSD值就可以了
3.检测限：可以用信噪比3：1的浓度作为检测限
4.定量限：不用做。
5.线性：至少5个，满足你的检测时上限和下限就行
6.现行范围：满足回收率合格，且适用
7.回收率：选80%，100%，120%为好
8.耐用性：改变检测器温度，分流比，柱温，样品存放时间及温度等。
残留溶剂的测定方法
• （2）配制浓度的确定 • 限度检查：对照品溶液浓度一般配制成要求的限度浓
度即可。 • 定量测定：对照品溶液的浓度应根据被测样品中残留
溶剂的实际浓度而定。浓度相差最好不超过两倍为宜。 必要时，应重新调整 。 • 药典上规定供试品取样量为0.1～1g，最好不超过0.5g， 取样量越大，灵敏度越高，但回收率越不容易符合要 求。
▪ 缺点：需要特定的顶空进样装置，成本较高，对沸点 较高的溶剂检测灵敏度不够，一般多应用于沸点100℃ 以下的溶剂
• 现一般采用自动顶空进样器
（2）直接进样
• 指将样品定量溶解于适当溶剂中,准确量取适量注入气 相色谱仪测定溶剂残留量的进样方法。进样体积一般 为2μL 以下。本法为通常采用的方法,适用于受热不易 分解的样品
通风的主要目的是为了置换室内的空气， 改善室内空气品质，是以建筑物内的污染物 为主要控制对象的。
根据换气方法不同可分为排风和送风。排 风是在局部地点或整个房间把不符合卫生标 准的污染空气直接或经过处理后排至室外； 送风是把新鲜或经过处理的空气送入室内。
对于为排风和送风设置的管道及设备等装 置分别称为排风系统和送风系统，统称为通 风系统。
• 2.进样方式 （1）顶空进样 • 顶空进样又分为溶液顶空和固体顶空。一般采用溶液
顶空，就是将样品溶解于适当溶剂中,置顶空瓶中保温 一定时间,使残留溶剂在两相中达到气液平衡,定量取气 体进样测定。
▪ 优点：在较低温度下进行，避免组分分解；减少溶解 样品的溶剂量和样品本身对色谱系统的干扰和污染， 缩短分析时间，增加色谱柱的寿命。
（二）.如何根据已有的方法进行残留溶剂 的检测？
• 1.根据质量标准确定实验方案
• 主要是实验条件的选择（选择测定方法，选择色谱柱、 检测器、进样器等，选择合适的检测方法）
化学药品溶剂残留研究探讨
溶剂残留分析方法的选择与 建立
残留溶剂分析方法
干燥失重法、热重测定法
非专属性 多种溶剂混合只能得到所有 残留溶剂的总量 水分也会干扰测定
紫外、红外光谱法
检测灵敏度低,干扰因素多
残留溶剂
测定方法
专属性 良好的分离能力 高灵敏度
检测灵敏度低
核磁共振光谱法
气相色谱法
ICH及各国药典推荐使用的方法
气相色谱法
准确度
中间精密度
耐用性
专属性
要求空白无干扰、各溶剂峰之间的分离 度因符合要求
检测限与定量限
检测限：根据信噪比（S/N）≈3的相应
浓度确定
定量限：根据信噪比（S/N）≈10的相应 浓度确定
线性与范围
线性和范围：在LOQ浓度至不低于150%指标浓
度的范围内取几个浓度点进行研究。线性关系
以测得的响应信号（峰面积）对被分析物浓度
A
B
不超过10g，就无需进一步计算。综合以上情况并考虑限度表示方式是目前更为简便可
直接进样溶媒
水、合适的有机溶媒或混合液。对于非 极性色谱柱，水对柱有影响，会缩短柱的使 用寿命。
温度的选择
色谱柱：初温应接近样品中最轻组分的沸点，而终温则取 决于最重组分的沸点，升温速率则要依样品的复杂程度。 进样口：一般接近沸点最高的组分，但要低于易分解组分 的分解温度。常用的条件是200 ～ 250℃。 检测器：原则是避免流出色谱柱的组分冷凝。FID检测器
通常设置为250 ～ 300℃。
检测器的选择
FID（火焰电离）——质量型检测器，适用于有机物 NPD（热表面电离）——氮/磷化合物 ECD（化学电离）——半选择性的检测器，适用于电负性物质（卤代
化学药物有机溶剂残留量研究技术指导原则
化学药物有机溶剂残留量研究技术指导原则指导原则编号：化学药物有机溶剂残留量研究技术指导原则（第二稿）二OO四年三月一日目录概述一、有机残留溶剂的确定（一）、通则（二）、确定进行残留量研究的有机溶剂时需要考虑的问题1、原料药制备工艺2、制剂及其临床应用特点（三）、残留溶剂分类及研究原则1、第一类溶剂2、第二类溶剂3、第三类溶剂4、第四类溶剂二．研究方法的建立及方法学验证（一）、研究方法的建立1．GC法2.其他检测方法8（二）方法学验证1．专属性2. 检测限3. 定量限4. 线性5. 准确度6. 耐用性三、研究结果的分析及质量标准的制定（一）、有机溶剂残留量表示方法1、允许日接触量2、浓度限制3．两种表示方法的比较（二）、制定质量标准的一般原则及阶段性要求1、第一类溶剂2、第二类溶剂3、第三类溶剂四．需要关注的几个问题（一）、附录中无限度规定和未收载的有机溶（二）、未知有机挥发物（三）、多种有机溶剂综合影响（四）、中间体的有机溶剂残留量（五）、制剂工艺对制剂有机溶剂残留的影响（六）、辅料有机溶剂残留的研究及对制剂的影响[附录][参考文献][起草说明][著者][概述]药物中的残留溶剂系指在原料药或辅料的生产中，以及在制剂制备过程中使用或产生的，但在工艺过程中未能完全去除的有机溶剂。
根据国际化学品安全性纲要、美国环境保护机构、世界卫生组织等一些国际组织的研究结果，很多有机溶剂对环境、人体有一定的危害，因此，为保障药物的用药安全，控制产品质量，需要进行有机溶剂残留量的研究和控制。
本指导原则是在参考人用药物注册技术要求国际协调会（International Conference on Harmonization of T echnical Requirements for Registration of Pharmaceuticals for Human Use，ICH）的有机溶剂残留量研究指导原则,美国药典（the United States Pharmacopoeia，USP）25版、英国药典(British Pharmacopoeia, BP)2002年版、欧洲药典(European Pharmacopoeia，EP)2003年版、中国药典(Chinese Pharmacopoeia, CP)2000年版相关内容的基础上，以药物研究开发本身的规律为出发点，同时结合我国药物研发的特点，通过分析、研究有机溶剂残留问题与药物的安全性、有效性及质量可控性之间的内在关系，总结形成的对有机溶剂残留问题的一般认识，希望可以帮助药物研发者科学合理的进行有机溶剂残留方面的研究，也为药物评价者提供一些指导。
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原料药中残留溶剂限度的确定方法
前言
药品的三个性质为安全、有效和质量可控。
杂质的研究应从对药品安全性和质量可控性两个方面的影响来考虑。
化学试剂作为广义概念上的杂质的一部分，也需要评估其残留对药品安全性和质量可控性的影响，其残留限度的制定也是如此。
如某化学试剂有基因警示结构，其限度应根据相应指导原则（《ICHM7》）制定。
如为无机盐，应根据无机盐的控制策略及相应指导原则制定，在API成品检测炽灼残渣，研究元素杂质（《ICHQ3D》）等。
某些有机试剂如残留溶剂中的四类溶剂的限度则应该先查找相应的安全性的数据，如动物毒理研究数据、职业环境暴露量研究数据等，然后根据安全性的数据计算相应的残留限度。
本文着重论述如何根据查到的安全性的数据计算化学试剂允许的残留限度。
通过PDE 计算限度
ICHQ3C中收载了PDE的计算方法：
PDE = NOEL x Mass Adjustment/[F1 x F2 x F3 x F4 x F5]
其中PDE为允许日暴露量，单位为mg/天；NOEL为该杂质的最大无作用的剂量，单位为mg/kg/天。
Mass Adjustment为体重调整系数，一般取为50kg。
F1…..
F5为各种修正因子，其含义与应取的值请查阅ICHQ3C相应内容，不再细述。
通过以上公式得出PDE的值之后，然后除以药品的最大日剂量，即得出该化学试剂的限度。
从LD50 计算NOEL
很多时候我们查找不到NOEL的数据，我们只能查到LD50（半数致死量）。
目前最权威的计算方法出自欧盟原料药委员会在其发布的《原料药工厂中清洁验证指南》，其中收载了由LD50计算NOEL的公式：NOEL=LD50×70/2000。
但这一公式却会误导PDE的计算，因为很多人会用这一公式计算出来的NOEL直接代入上文的公式计算PDE，却没有注意到《原料药工厂中清洁验证指南》一文中的NOEL 的单位是mg/天，而不是上文公式中的mg/kg/天。
原因就是公式中的70是欧洲人的评价体重。
所以如果需要用LD50计算NOEL用于计算PDE，则不应该乘以70，公式应该是NOEL=LD50/2000，2000是经验常数。
该公式可参见文献Layton D W，Mallon B J，RosenblattD H，et．Deriving allowable daily intakes for systemic toxicants lacking chronic toxicity data[J].Reg02 To'xicol Pharm，1983，3(1)：224。
由ppm 计算相应NOEL
有些时候我们查到的相应药理毒理研究数据（特别是某些低沸点溶剂）是研究空气中特定含量的吸入产生的效果，
其单位常见的是ppm为体积比，如何换算成mg/kg/天的单位呢？以三乙胺为例，其研究数据为大鼠每周5天，每天6小时，持续28周，NOEL为247ppm。
247ppm=247×101.19/24.45=1.02mg/L，其中101.19为三乙胺的分子量，24.45为25℃气体摩尔体积。
每天平均吸入量为1.02×6×5/24/7=0.183mg/L。
NOEL（mg/kg/天）
=0.183×290/0.425=124.9，其中290为大鼠每日吸入空气体积，0.425为大鼠平均体重。
如何确定限度
化学试剂的限度制定如上文所述应根据安全性和质量可控性两个方面综合制定，某些化学试剂的安全性非常好，如氯化钠、氨基酸之类，其限度就需要根据质量可控性的要求制定。
如上文的三乙胺，PDE（计算过程见上文PDE相关内容）为62.5mg/天，假设药物每日最大剂量为
100mg，根据PDE计算三乙胺在该药物中的限度可为
62.5%。
这明显不合理，这时应根据实际工艺可能达到的值确定一个合理的限度，即质量控制可以实现的限度，例如0.1%。
作者介绍：占小兵，2004年毕业于江西医学院药学系（现南昌大学药学院），多年从事药物研发的分析工作，现就职于上海博志研新药物技术有限公司分析部。
（化药注射剂再评价研发思路与关键技术暨原辅包新政法规解读）（凡是从
药事纵横报名，均可享受底价2200元/人，2月10日前报名缴费折上折，完成培训，药事纵横还有红包。
单独报名模块一可享受800/人，模块二享受1600/人，其它渠道均不能享受。
）（改良型创新/505（b）（2）立项研发暨中美双报研讨会邀请函）（普通渠道报名5000元/人，凡是从药事纵横报名，均可享受底价3600元/人，3月10日前报名缴费折上折，完成培训的朋友凭发票享受红包回馈。
其它渠道均不能享受。
）。