内毒素检测进展讲解

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MB－80内毒素测定系统
内毒素 葡聚糖
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仪器概述
MB－80内毒素定量测定系统是专门用于定量测 定药品、生物制品、血液制品、医疗器械及食品 中的内毒素含量，更重要的是在临床上用来测定 病人各种体液中细菌内毒素的含量水平，以诊断 及鉴别诊断内毒素血症及感染的类型和程度，也 作为观察内毒素血症疗效的重要指标。
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结合免疫鲎试验法（Immunolimulus, IML）
以 广 泛 交 叉 反 应 性 抗 LPS － McAb （ Wn1222-5 ） 来捕获LPS，再与鲎试剂反应，可定量检测样本中 肠 杆 菌 科 细 菌 感 染 所 释 放 的 LPS ， 敏 感 性 可 达 100pg/ml。该法以抗LPS单克隆抗体为探针使内毒 素血症检测特异性得以改善，且不受标本浊度、放 置时间、抑制因子等非特异性因素的影响，但仍不 能避免鲎试剂自身因素的影响。
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鲎试验
鲎试验（LT）检测LPS机理是LPS通过激活C、B 因子、前凝固酶而使可凝蛋白变成凝固蛋白，形成 肉眼可见的胶冻状物，通过比浊，对LPS进行半定 量或定量检测。该法简单、无需特殊设备、耗费少、 敏感性较好，可检测出0.01~1ng/ml的LPS，但易受 多种因素的影响。
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①标本颜色的深浅可使敏感性偏低；②受血浆中 LPS抑制因子的干扰；③非特异性凝血酶、凝血活 酶、核糖核酸酶、胰蛋白酶等均可使鲎变形细胞溶 解物产生假阳性反应；④LT法的标准化问题（目前 国际尚无统一标准）。
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毛细管电泳法
LPS是缺乏有旋光力的基团，检测其未衍化的状 态比较困难。硼酸盐可与LPS分子的二乙基结合使 其旋光力增强，采用UV活性多粘菌素B与LPS形成 复合物或荧光素异硫基氟酸盐标记LPS亦可达到目 的。方法是将处理过的标本吸入毛细管，用标准磷 酸盐缓冲液（100mg/ml）做电泳，6min内即可完成 检测。此法敏感性为35pg/ml，但电泳的条件不易掌 握，且易受某些技术因素或固有误差的影响，目前 尚难以推广应用。
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ELISA法
利用多粘菌素B ﹑L－聚组氨酸及广谱交叉反应 性的抗LPS－McAb与LPS有广泛的结合能力的特点， 用其包被微量反应板，加入待检样品，再加抗LPS 单克隆抗体（McAb），通过酶标二抗的显示来定 量测定LPS，该法敏感性不高（0.5ng/ml），与LT 法的相当,但定量准确性高于LT法。
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检测原理 主要原理与鲎试验的反应原理相同：利用革
兰氏阴性菌脂多糖激活酶反应主剂A中的相应因 子后形成凝固蛋白，根据其引起的浊度变化对革 兰氏阴性菌脂多糖浓度进行定量测定。
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三、内毒素检测的临床意义
正常参考值：正常人血浆内毒素含量<10pg/ml。
革兰阴性菌败血症的诊断:通过测定人血浆中
脓毒综合征 （发热、低温、心动过速、尿少、酸中毒、低血压）
DIC
内毒素休克
MOSF（多器官功能衰竭）
死亡
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内毒素的生物学效应
发热反应 白细胞反应 内毒素血症（ETM）与内毒素休克（ETS） 弥漫性血管内凝血（DIC）
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二、内毒素的检测
目前内毒素检测的方法主要有：
鲎试验 ELISA法 结合免疫鲎试验法（IML） 自动化动力学方法 化学发光法 光纤维生物传感法 毛细管电泳法
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自动化动力学方法
该方法先用KOH的复合碱试剂在微量反应板上对 血浆标本进行预处理，以去除或灭活其中的干扰因 子及酶抑制物，再直接加入对LPS高度特异的产色 鲎试剂（Endospecy），随后启动动态显色测定程 序，检测仪自动绘制30min内的各孔反应曲线，根 据标准曲线计算出样本中的LPS浓度。
LPS-LBP （LPS结合蛋白）
LPS-SCO14 （细胞膜上的受体）
信号传递
信号传递
CD14+细胞 （Mф ，PMN，单核核细胞）
CD14－细胞 （上皮细胞等）
吞噬作用 杀菌活性
一级介质释放
粘附分子表达→细胞反应
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TNF、IL-1 IL-6、IL-8
急性炎症
瀑布样反应，全身炎性反应综合症
PG、TXA、LTC、PAG、C5a、O2-、NO，弹力酶 （二级介质）
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光纤维生物传感法
利用短波光纤维生物传感器检测LPS，最低敏感 性为10ng/ml，可在30s内完成。其原理是共价结合 于光纤维探针表面上的多粘菌素B可选择性地结合 荧光标记的LPS，未标记的LPS在竞争试验中根据 已标记的LPS产生的荧光强度得以定量检测。此法 不仅应用于临床而且还可应用于环境中LPS的检测， 该法虽快速简便，但敏感性不如IML法和ELISA法。
内毒素检测进展及临床意义
第四军医大学西京医院检验科细菌室 樊新
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内毒素（Endotoxin, ET）是革兰氏阴性 细菌细胞壁的主要成分，其化学成分为脂多 糖 （ Lipopolysaccharide ， LPS ） ， 由 类 脂 A 、 核心寡聚糖O及多糖侧链组成。
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一、内毒素的产生，作用机理及 生物学效应
内毒素的产生
以往认为ET作为细胞壁的结构成分只有在菌体 死亡或人工裂解时才能释放出来。但近年来发现 革兰氏阴性杆菌在细菌对数生长期或细菌营养缺 乏时也可以以“出疱疹”的方式被释放ET。
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ET的入血外源性输入
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内毒素的作用机理
LPS
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该方法对LPS的定量范围为10~100pg/ml。反应中 所用产色鲎试剂不含G因子，因此可避免与标本中 存在的真菌发生凝固作用而出现非特异性反应，其 优点还体现在标本先用碱处理，从而克服了鲎试剂 内的一些影响因素。
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化学发光法
利用CR1和CR3受体诱导中性多核粒细胞中的氧 化产物作为检测平台，依靠LPS－LPS抗体复合物 使全血中的中性粒细胞所释放的氧化物质，引起补 体调理酵母多糖，导致发光物质（CL）氧化而发光， 通过仪器光学系统检测发光的强度而定量测定血中 的内毒素，对LPS定量范围为20~200pg/ml。该法对 大多数革兰氏阴性杆菌的LPS有广泛的反应性，而 对革兰氏阳性菌、曲霉菌等无反应，可望成为临床 诊断内毒素血症的有用工具。