结核分枝杆菌最新检测技术
肺结核实验室检测方法金标准
肺结核实验室检测方法金标准
肺结核实验室检测的金标准是基于培养和鉴定结核分枝杆菌。
以下是具体步骤：
1.痰液样本收集：患者需要提供早晨醒来时的深咳痰液样本，
以获得有效的细菌数量。
2.痰液预处理：痰液样本经过预处理，包括离心和去除杂质。
这一步通常包括液体化和浓缩痰液。
3.痰液培养：将预处理后的痰液接种到培养基上，通常是液体
培养基。
培养基中的结核分枝杆菌将逐渐增殖形成菌落。
4.鉴定：通过常规培养、染色和生化试验等方法，鉴定已培养
的菌落是否为结核分枝杆菌。
5.药敏试验：对已鉴定的结核分枝杆菌进行药敏试验，以确定
哪些药物对其具有抗菌作用，从而为治疗方案的选择提供依据。
此方法被认为是金标准，因为它能够准确检测到结核分枝杆菌，并且可以确定其对药物的敏感性，为结核病的诊断和治疗提供可靠的结果。
但是，该方法需要相对较长的时间（通常需要几周）来进行培养和鉴定，因此在临床实践中可能需要其他更快速的检测方法来尽早确诊结核病。
结核杆菌抗体测定结果
结核杆菌抗体测定结果随着亚健康慢慢的侵袭了我们的国家，大家开始诚惶诚恐的注意保重自己的身体了。
锻炼身体，吃东西补身体这些就先不说了。
为了防止疾病悄悄的侵袭我们健康的体魄，基本上大家每一年都做至少一次两次的体检，以此来发现身体的问题，好及时的进行治疗。
那其中就有一项结核杆菌。
接下来就介绍一下结核杆菌抗体的测定结果。
目前，检测结核分枝杆菌的常见方法是直接涂片抗酸染色、痰结核菌常规培养和生物芯片蛋白技术。
与抗酸染色法、痰结核菌常规培养法比较，生物蛋白芯片技术具有检测速度快，敏感性和特异性高的特点。
对诊断结核杆菌感染、动态观察结核病患者的疗效有良好作用。
生物蛋白芯片技术检测结核分枝杆菌抗体。
较敏感、特异性强又纯化的抗原为细胞壁的脂阿拉伯甘露糖(LAM)、16kDa蛋白和38kDa蛋白。
LAM是构成结核分枝杆菌细胞壁的重要组成成分，其特异性强，能刺激结核感染者产生抗体;16kDa蛋白是有潜力的免疫诊断抗原;38kDa蛋白为脂蛋白。
其与细胞膜或菌体表面的脂肪结构相连。
对小儿来说，只要感染过结核菌，结核抗体试验就呈阳性反应，它只是诊断结核感染的一个参考，不能说一定就是结核病。
国人大多年长儿及成人感染过结核菌，绝大多数人是不发病的。
这和儿科结核菌素试验(PPD)检查一样，也是诊断结核病的一个参考，结核菌素试验是在皮内注射0.1ml的药液，48-72小时看结果，PPD试验也只有强阳性(需配合临床表现和胸片等其他检查)才有意义。
如呈阴性反应，就说明没感染结核菌;弱阳性和阳性反映，也只能说明感染了结核菌，不能确诊为结核病。
临床发现，LAM、38 kDa抗体检出率可能与年龄增加、机体抵抗力或免疫力下降有关。
其结果随结核病患者的年龄增加而升高，因此采用生物蛋白芯片技术联合检测3种结核抗体，可提高其诊断结核的敏感性和特异性，也可作为结核病的血清学诊断方法之一。
研究证实，门诊及住院结核病患者痰抗酸染色阳性患者的LAM、16 kDa、38 kDa抗体检出率均较高，而经过治疗的患者的3种结核抗体检出率均较低。
ELIspot技术检测结核分枝杆菌感染检测原理
ELIspot技术检测结核分枝杆菌感染检测原理检测原理是：机体感染结核分枝杆菌后，存在于血液中的特异性效应T淋巴细胞会在再次接触结核分枝杆菌特异抗原时，产生和分泌IFN-γ，通过检测能够释放IFN-γ的T淋巴细胞数量，用于结核分枝杆菌感染及结核病的辅助诊断。
该检测方法相对于结核菌素试验，具有更高的特异性。
由于结核菌素试验中用的结核菌素是从结核分枝杆菌中提取的非种属特异的性分子，因此存在与卡介苗（BCG）的交叉，接种过BCG的人群即使没有感染结核也可能会出现结核菌素试验阳性。
而ELIspot检测所用的结核分枝杆菌特异抗原与BCG抗原无交叉，不受BCG接种的影响，未接种BCG和接种BCG的人群均可用该法进行结核病感染的筛查和结核病的辅助诊断。
目前应用的ELIspot检测试剂盒是由英国Oxford Immunotec公司生产的T-SPOT®TB试剂盒。
其检测方法如下：1.抗体包被将适量人IFN-γ抗体预先包被于96孔ELIspot板上。
2.标本采集及准备采集8小时内的肝素抗凝血，用Ficol离心分离外周血单核细胞（PBMC），用细胞培养液洗涤2次后，重悬于细胞培养液中。
3.细胞计数及稀释用台盼蓝染色计数法对PBMC细胞悬液计数，将细胞悬液浓度调整至2.5×105个细胞/100μl。
4.抗原刺激及孵育每个待检样本均需设阳性对照孔、阴性对照孔和检测孔。
阳性对照孔加入植物血凝素（PHA）作为阳性刺激抗原，阴性对照孔不加任何抗原刺激，检测孔加入结核特异性抗原。
若有几个特异性抗原进行分别刺激，检测孔可根据需要设置多个孔。
向阳性、阴性对照孔及检测孔内各加入100μl的PBMC细胞悬液，将ELIspot板置于37℃5%CO2培养箱内静置孵育16～20小时。
孵育期间不能移动ELIspot板，必须保证板静置不动。
5.斑点显色及计数弃除板内的细胞培养液，每孔加入200μl的PBS缓冲液洗涤3～5次，弃净板内的液体，向每孔加入100μl稀释好的生物素标记抗体，37℃孵育1小时。
《结核分枝杆菌和人类免疫缺陷病毒感染双向筛查技术应用专家共识》(2024)要点
《结核分枝杆菌和人类免疫缺陷病毒感染双向筛查技术应用专家共识》（2024）要点1 TB/HIV双向筛查技术手段1.1 在HIV感染者/AIDS患者中开展活动性TB/结核感染筛查目前WHO推荐用于HIV感染者/AIDS患者活动性TB筛查的方法有TB症状筛查、CXR、C-反应蛋白（CRP）检查、尿脂阿拉伯甘露聚糖抗原侧流（LF-LAM）免疫检测以及MTB 分子快速诊断方法。
我国工作实施方案中还要求对于HIV感染者/AIDS患者定期进行TB 病原学检查。
1.1.1 TB症状筛查我国对于感染HIV病毒的人群（PLHIV）的TB症状筛查主要基于门诊随访时的问卷调查，筛查症状包括：咳嗽、咳痰持续2周以上；痰中带血、反复发热持续2周以上；反复夜间出汗、无法解释的体重明显下降、经常容易疲劳或呼吸短促、淋巴结肿大。
1.1.2 胸部影像学检查胸部影像学检查是筛查、诊断或排除活动性肺结核的重要手段之一。
胸部影像学检查包括CXR、胸部CT断层扫描等，是普及性较广的一种检测手段。
1.1.3 TB细菌学检查TB细菌学检查是诊断活动性肺结核的重要检测方法，主要包括痰涂片和痰培养，临床上广泛用于一般人群肺结核的诊断和鉴别诊断。
目前尚无其他检测手段能代替痰培养作为TB实验室确诊的“金标准”。
1.1.4 快速分子生物学检查随着核酸检测技术的迅速发展，快速分子生物学检测已广泛应用于TB诊断，国外研究显示其在HIV感染者/AIDS患者中开展结核筛查也具有较高的灵敏度和特异度。
1.1.5 CRP检查CRP是一种非特异性的炎性标志物，与机体的感染或应激状态相关。
CRP检测简便、价廉、易操作，是POCT的常用项目，普及性高。
1.1.6 LF-LAM免疫检测我国尚未引进该项技术。
1.1.7 结核感染检查WHO和我国推荐用于HIV感染者/AIDS患者LTBI筛查的方法有结核菌素皮肤试验（TST）、γ-干扰素释放试验（IGRA）和基于结核分枝杆菌抗原的皮肤试验（TBST）。
结核分枝杆菌耐药检测技术选择——分子线形探针方法
2
1、单耐药：结核病患者感染的结核杆菌体外被证实对 一种一线药物抗结核药物耐药。 2、多耐药：结核病患者感染的结核杆菌体外被证实对 不同时包括异烟肼、利福平在内的一种以上的一线抗 结核药物耐药。 3、耐多药（MDR－TB）：结核病患者感染的结核杆 菌体外被证实至少对异烟肼、利福平耐药。
2222
核酸DNA提取-痰
6%NaOH和2.94%枸橼酸钠等体积混合，配制 1%NALC前处理液。 取2ml涂阳痰标本转移到50ml离心管，加1-2倍体积前 处理液，振荡30s,静置15分钟。 加PBS到45ml，3000g离心20min。 倒掉上清，加2ml PBS混匀沉淀，分别取1ml转移到 1.5ml离心管。 取1支管12000rpm离心5min，吸弃上清。
3
耐药结核分枝杆菌机制
基因突变
结核分枝杆菌产生耐药性的主要原因
药物外排泵的影响
结核分枝杆菌细胞壁结构的改变
4
耐药产生的主要原因
微生物上，耐药性是基因突变引起药物 对突变株的效力降低造成的。 临床及管理上，不足够的或不恰当的治 疗导致结核病患者体内的耐药突变株变 成优势株。
5
中国耐药流行情况
如果不能立即实验，-20度保存。
2525
PCR扩增
每个病例取5ul DNA样本到扩增混合液中
2626
PCR扩增
痰标本和菌株用不同程序
培养标本 15 min 95℃ 30 sec95℃ 2min58℃ 25 sec 95℃ 40 sec 53℃ 40 sec 70℃ 8 min 70℃ 4℃ 24 h 1 个循环 1 个循环 20 个循环 30 个循环 1 个循环 10 个循环 直接病人标本 1 个循环 10 个循环
结核分枝杆菌镜检执行标准(一)
结核分枝杆菌镜检执行标准(一)
结核分枝杆菌镜检执行标准
引言
•结核分枝杆菌镜检是一种常用的结核病的检测方法，能够快速、简便地检测结核分枝杆菌的存在。
•为了确保该检测方法的准确性和可靠性，制定了一系列的执行标准。
标准内容
1.标本采集标准
–根据结核病患者的症状及体征，采集合适的标本进行检测。
–标本采集应遵循无菌技术，避免污染或交叉感染。
2.标本处理标准
–获得标本后，要迅速进行处理，确保标本中的结核分枝杆菌数量不发生明显变化。
–标本的处理应遵循严格的操作规程，防止污染和误诊。
3.染色方法标准
–使用适当的染色方法对标本中的结核分枝杆菌进行染色，以便于观察和鉴定。
–染色方法应符合相关的规范，并在操作过程中保持稳定且一致。
4.显微镜检查标准
–使用显微镜对染色后的标本进行观察和检查。
–操作人员应具备一定的显微镜操作技巧和解读能力，保证结果的准确性。
5.结果判读标准
–对观察到的结核分枝杆菌进行判读，并进行相应的结果记录。
–结果判读应由专业人员进行，避免误判和误诊。
总结
•结核分枝杆菌镜检的执行标准对于准确检测结核病起着重要的作用。
•只有严格遵守执行标准，才能保证结果的准确性和可靠性，提高结核病的早期诊断率。
•各医疗机构和从业人员应加强对执行标准的学习和培训，确保标准的全面贯彻。
几种常见的结核分枝杆菌快速检测方法
肺结核属于肺部慢性传染疾病，临床发病率高，该病的主要致病菌为结核分枝杆菌，病程相对较长，会向全身多个脏器累及。
菌阴肺结核指的是通过一次结核杆菌培养以及三次痰涂片检查，结果均显示为阴性的肺结核患者，具有较低的传染性。
大多数患者不了解菌阴肺结核的相关性知识，如果没有采取及时有效的诊断、治疗，患者的病情就会延误，继而转变为阳性，对患者的预后造成不利影响。
目前，临床中对于菌阴肺结核的特异性诊断措施相对缺乏，最常用的方法就是痰或呼吸道采集标本中结核分枝杆菌的检验。
近年来，结核病的发病率及死亡率呈现逐年上升的趋势。
筛选出一种能有效确诊早期结核病的检验方法十分重要。
目前临床上应用于辅助结核病诊断的检验方法以结核分枝杆菌培养和抗酸染色涂片为主，其中培养法作为结核疾病诊断的金标准具有准确性高、特异性高的优势。
结核分枝杆菌痰的分离培养，消耗时间较长，如果利用固体改良罗氏培养基进行培养，一般会需要至少20d，最长可需要60d，如果使用先进的全自动分枝杆菌进行检测，至少需要7d，至多需要20d。
实验室一般会通过痰涂片法进行检测，该方法的操作相对简单，价格较低，但是，操作费时，在基层痰检实验室涂片量过大的时候，一天内无法得到实验结果，这种现象无法满足目前的结核病防治工作。
近些年来，随着染色技术的逐渐先进，荧光染色技术作为新型的实验手段，已经在医学科学领域中广泛应用。
目前，涂片染色法已经成为无菌体液的主要检查方法，但是，通过传统制片以及染色法的检出率相对较低，误诊率以及漏诊率较高。
主要是因为染色时制片以及标本固定环节容易出现误差，而细胞沉淀仪法、改良的抗酸染色法、萋-尼氏抗酸染色法、金胺O荧光染色法、PCR等技术的应用越来越多。
传统方法：获取痰标本后，排除口水痰，然后纳入研究范围，确认纳入的当天，需要在每份痰标本相同位置，取两份，制成痰涂片。
离心处理标本，再在洁净的玻片上涂抹沉渣，涂完一层之后，使其自然干燥，再次涂抹，形成厚涂片，先使用萋尼抗酸染色法进行染色，随后使用石炭酸复红溶液初染，再使用盐酸酒精脱色，然后用美兰复染，寻找红色区域，待涂片干燥后置于显微镜镜检，于蓝色背景中寻找红色的杆状、分枝状细菌。
分枝杆菌检测方法总结
分枝杆菌检测方法总结分枝杆菌检测方法主要有以下几种：1. 痰涂片：这是最常用的方法，优点是快速、低廉、操作简便，但无法区分死活菌，尤其是无法区分结核分枝杆菌（MTB）和非结核分枝杆菌（NTM），而且受制于痰液中分枝杆菌数量，敏感性较低，漏检率很高。
2. 结核培养：与痰涂片相比，培养法灵敏度增加了不少，结核培养阳性是诊断抗酸杆菌的金标准，但缺点在于培养时间周期过长，一般需要8周左右时间，这样很耽误医生用药和患者及时治疗。
3. 结核杆菌IgG抗体检测：感染结核分枝杆菌后，体内可产生特异性抗体。
将结核分枝杆菌抗原包被在固相载体上，与待测血清反应，血清中相应的抗体可结合于其上，再以胶体金（或酶）标记，显示反应，可检出血清中结核分枝杆菌抗体。
结核杆菌IgG抗体检测特异性较好，对于排除结核阳性有利，但无法确诊活动性结核。
4. Xpert MTB/RIF：通过检测MTB基因组中的rpoB基因及其突变情况，实现MTB核酸和利福平耐药检测的全自动实时荧光定量核酸扩增技术。
具有以下优势：特异性好，能准确区分MTB和NTM；灵敏度高，检测快速，仅需要两个小时就完成检查了；适用于各种标本，痰液、肺泡灌洗液、肺组织、脑脊液、淋巴结、关节液以及尿液等均可用于检测；同时可以检测利福平耐药，检测对一线抗结核药物利福平的耐药情况，敏感性特异性极高，可及时为临床用药提供有效参考。
5. IGRA：γ-干扰素释放试验（IGRA）是检测结核分枝杆菌（MTB）特异性抗原刺激T细胞产生的γ-干扰素（IFN-γ），以判断是否存在MTB感染。
IGRA适应证主要包括结核潜伏感染（LTBI）的诊断和活动性结核（ATB）的辅助诊断。
与结核菌素皮肤试验（TST）相比具有明显优势：特异度高，不受卡介苗接种及大多数非结核分枝杆菌（NTM）的干扰；使用单一阈值作为阳性判断标准；作为体外诊断方法，更适用于疫情检测和流行病学调查。
IGRA是世界卫生组织（WHO）推荐的用于诊断MTB感染的体外免疫学方法。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
精品课件
一般临床结核检测方法
• 1.结核的常规检测 • 2.Y-干扰素 检测技术 • 3.T-SPOT.TB检测技术 • 4.GeneXpert检测技术
精品课件
1.常规检测检测
精品课件
精品课件
谢谢！
No Image
精品课件
➢ 无交叉反应 ，故也适用于BCG接种的病人或感染非结核之 病人.
➢ 高特异性及敏感度.(>80%)
精品课件
优势
➢ 可做非肺部结核病检验 ➢ 建立一个快速且精确的检验方法（5-15分钟判读
结果） ➢ 广泛用于一般人群普查（早期诊断，早期治疗） ➢ 可做为培养确认试剂是否为结核分枝杆菌(MTB)或
非结核分枝杆菌(NTM)之区别 ➢ 评价结核临床疗效及治疗方案 ➢ 定位：筛查
精品课件
2.Y-干扰素
原理：利用T细胞对结核菌的记憶,加入结核菌抗原,产
生干扰素的多寡.判定是否为潜伏感染者.
检测标本：血液（目前WTO已禁止使用 血液标本检测）
缺
收费标准：500-800元
点
适用于高危险人群检测. 不宜用于普 查.
操作复雜.需要专业人员及设备.
精品课件
3.T-SPOT.TB（体外酶联免疫斑点技术）
精品课件
非結核分枝桿菌 -
結核分枝桿菌 +
結核菌快速金標檢測試劑盒 簡易操作步驟
精品课件
精品课件
优势
➢ 检测结核菌分枝杆菌之特异性分泌性抗原 (Secreted specific protein )
➢ 可取代耐酸染色无法区别分枝(MTB)或非分枝结核(NTM)杆 菌之困扰.
➢ 取代现行的非特异性纯化蛋白抗原 (PPD, purified protein derivative).
操作复杂 繁琐
缺 点
三甲大型实 验室操作
收费价格： 500-800元
精品课件
4.GeneXpert检测技术
• 原理：分子生物检测技术
收费标准：约500元
缺
点
配合仪器使用，仪器需约100万元
目前普及范围小
精品课件
检出率低、费用低
检出率高、费用高
费用低、检出率高
精品课件
结核检测新技术
——结核菌分泌蛋白抗原快速检测试剂
精品课件
结核菌分泌蛋白抗原快速检测试剂（胶体金法）
原
理
敏感性 81%
是利用重组基因的技术制造结核菌的特异 性蛋 白（抗体），纯 化后包被吸附于胶 体金上，检测时，当样品有结核菌分泌性 蛋白时，先和包被的胶体金标记物结合， 产生反应。由于层析作用，其反应复合物 会沿着硝酸纤维膜向前移动。
特异性
精品课件
精品课件
注意事項
➢ 服药治疗的结核病人, 可能会因为药物抑制蛋白分泌, 所以成阴性結果 .
➢ 若是药物治疗的結核病人,进行疗程中追踪检测,成阳性反应. 应考虑可 能为抗药性病患.
➢ 对于痰液的检测, 必須使用未处理的原痰, 加入试剂盒中的样品缓冲液 后方可检测. 若是使用高浓度及高碱性的 NaOH 软化痰液, 则将破坏试 纸条中的包被抗体和胶体金, 导致错误結果.
精品课件
2014年全国法定法定传染病发病率
精品课件
煤矿行业结核比率
• 据北京京煤集团总医院结核病科孔冬青主任调查，肺结核 科住院治疗的611例煤工尘肺合并肺结核患者，经筛查， 检出痰菌阳性223例。即三分之一的人均患有肺结核。该 数据逐年递增。
精品课件
危害
精品课件
WHO对结核个案定义
• 疑似结核个案 –有呈现结核病征与症状（低烧、全身乏力或消瘦、夜 间盗汗、女性可导致月经不调或停经） –长期咳嗽超过2周
➢ 试剂盒中的样品缓冲液可以破坏菌体的蛋白酶, 使菌体失活, 但是不影
响试验結果及检测.
精品课件
胶体金免疫数字测试卡
精品课件
HR201全自动金标分析仪
特点： 定性和模拟定量检测 触控界面、操作简单 体积小、便于携带 快速精确（10秒出判读结果） 数据储存量大 内置热敏打印机 可实时打印检测结果 支持LIS系统
85.9%
痰液检测结核杆菌 染色与TB抗原快速检测试剂之比较
痰液耐酸性染色
濟南杏恩 結核菌檢測試劑盒
痰液(未經處理)
樣品緩衝液
結核分枝桿菌 +
非結核分枝桿菌 +
非結核分枝桿菌 -
結核分枝桿菌+
培養確認
固態觀看 PCR 全自動化培養儀
濟南杏恩 結核菌檢測試劑盒
培養確認
結核分枝桿菌 +
非結核分枝桿菌 -
结核分歧杆菌检测新技术
——结核菌分泌蛋白抗原快速检测
精品课件
我国流行概况
➢ 是全球22结核病高负担国家之一 ➢ 活动性肺结核病人数居世界第二，仅次于印度 ➢ 是我国重点控制疾病之一 ➢ 目前估算全国活动性肺结核病人450多万，每年新发传
染性肺结核患者150多万 ➢ 全国约45%的人受过结核菌的感染，明显高于全球水平