我国水产疫苗的现状及应用前景

1 我国水产疫苗的现状及应用前景 李博 12级海资 学号：12060011009 指导老师：周丽教授 摘要 随着养殖密度的增加，养殖环境发生变化，水产动物重大疾病的暴发频

率越来越高。水产疫苗不仅可以有效地预防这些疾病，也是目前解决病毒病问题的唯一特效手段。在查阅大量养殖文献和成果的基础上，对我国水产疫苗的的研究现状，包括水产疫苗的分类、接种方式及我国常见的水产疫苗进行了综述，提出了我国水产疫苗的发展建议。 关键词 水产疫苗 现状 前景

我国是水产养殖大国。水产养殖业蓬勃发展，其中养殖品种多种多样，技术含量不断提高。但由于养殖观念落后和鱼病研究相对滞后，大多数疫苗处于空白状态，治疗上仍以化学疗法为主。其中抗生素和化学药物的滥用已导致病原菌的严重耐药，并对生态环境造成巨大压力，同时危及消费者的身体健康，并直接影响到我国的国民生产总值。特别是我国加入W T O后，以出口为导向的水产品面临极大的技术壁垒。要解决目前现状根本措施是在引进国外适用疫苗的同时，尽快研制适合我国养殖品种流行疾病的疫苗，开发新的接种技术，提高免疫接种的可操作性。本文就目前我国水产养殖渔用疫苗的现状及新技术的应用进行综述。

1. 目前我国与西方发达国家在水产疫苗研究上的差距 国际上对鱼类免疫的研究始于2O世纪30 ～40年代，70年代中期，世界各国普遍开展鱼用疫苗的研制。至 2006 年，据不完全统计，针对 24 种不同的水产病原，一些国家或地区准发许可证的疫苗已超过 10多种，在鱼类病害的防治中发挥了极其重要的作用,大大减少了抗菌素等化学药物在养殖鱼类方面的使用量。其中欧、 美国家占大多数。亚洲已有几种疫苗在临床使用，但仅有3 种商品化的疫苗 ：虾副溶血弧菌疫苗(V ibrogen —S )，对虾多价菌苗(简称 P.M.B.疫苗)和鳗弧菌菌苗。日本有 3 种疫苗获得许可证，澳大利亚仅一种疫苗获得许可证 。 我国在鱼病防治方面主要采用化学药物，渔用疫苗普及率很低。而欧洲是使用鱼类疫苗较早的地区之一。早在 1990 年英国和挪威就用疖疮病的疫苗，目前由于90 ％以上的养殖鱼类注射了疫苗，大量减少了抗生素在水产养殖业中的使用，显著提高了养殖鱼类的商品价值。以挪威虹鳟鱼养殖为例， 1984 年虹鳟鱼产量 5 .5万t， 用药量为48. 8t， 到了 1994 年虹鳟鱼产量达到24.9万t，而当年用药量 1. 4t，基本达到健康养殖的要求，这种进步很大程度归功于渔用疫苗的开发和应用。 2

从目前世界各国养殖情况及面临的问题来看，亚洲急需疫苗有嗜水气单胞菌、点状气单胞菌、柱状菌病、虹彩病毒病、单殖吸虫病毒、粘细菌感染、原虫病、伪结核病、海虱感染侵袭、链球菌感染、河纯弧菌病、病毒性出血败血症、鱼类病毒感染病等十多种病的疫苗 。美国急需对虾细菌性传染病、细菌性肾病、冷水鱼疫苗、柱状菌病、爱德华氏菌、原虫病、立克次氏体、水霉病、海虱感染侵袭等病害疫苗。而澳洲及欧洲目前未出现急需疫苗 。

2 疫苗种类 2.1活疫苗 在兽医临床中有强毒苗、弱毒苗和异源苗三种，目前水产活疫苗中应用较多的是弱毒疫苗，用致病性已大为减弱的病毒减毒株或变异的弱毒株制备的疫苗，称为弱毒疫苗。弱毒苗是目前临床中使用的最广泛的疫苗种类，尽管其毒力已经减弱，但仍然保持着原有的抗原性，能够有效的刺激鱼体免疫体系的细胞免疫，并能在体内繁殖，因而可用较少的免疫剂量诱导产生很强的免疫力，且不必需添加佐剂，免疫期长，不影响动物产品（肉类）的品质。甚至有些弱毒苗可以刺激机体细胞产生干扰素，对抵抗其他野毒的感染也有很大帮助。虽然弱毒苗有上述优点，但贮存运输不方便，且保存期短。将其制成冻干苗可延长保存期，但需要在液氮中保存，因此一定程度上限制了其应用范围。该类疫苗有C C V减毒疫苗、疖疮病减毒菌苗、I—H N V 减毒疫苗以及草鱼出血病细胞培养弱毒疫苗等。 珠江水产研究所在“ 草鱼细胞灭活疫苗” 研究的基础上，应用中草药处理，使病毒致弱而研制成功的新一代预防草鱼出血病的疫苗。该疫苗的特点是用量少、效价高、保护力强、免疫产生期快、免疫期长、使用安全方便，克服了组织苗(土法疫苗)效果不稳定和细胞灭活疫苗免疫期较短的缺点。主要应用于养殖草鱼的免疫防病，使用浓度为 10，注射剂量 0.2毫升，免疫时效为1年，免疫保护率可达 90％以上。目前该疫苗已完成区域性临床试验，在广东、福建、江西、广西等部分地区进行了田间和区域试验，成活率普遍在7 0％- 9 0％。 2.2灭活疫苗 病原微生物经过理化方法灭活烈性野生型病原的感染性，却仍保持免疫原性，接种后使动物产生特异性抵抗力，称为灭活疫苗或死疫苗。灭活疫苗研制周期短，使用安全，易于保存，但由于灭活疫苗接种后不能在动物体内繁殖，因此需要接种剂量较大，免疫周期短，需要加入适当的佐剂以增强免疫效果。1969 年，珠江所最早研制成功了可大面积推广使用的组织浆灭活疫苗，也是我国水产第一个水产疫苗——草鱼土法疫苗，从根本上解决了烂鳃、赤皮、肠炎、出血等几种危害极大的草鱼暴发性流行病，使草鱼池塘养殖成活率提高到 85％以上。此后，我国又发展了多种水产组织浆灭活疫苗。 组织浆灭活疫苗的最大缺点是受病鱼供应数量的限制，即用于发病本场，难以进行大规模生产。此类疫苗一般未经注册，只能在非常情况下，经有关部门批准使用。在日本和欧美等国家，大批量的灭活疫苗产品上市，并发挥了重大作用。如日本的真鲷虹彩病毒灭活苗、蛳鱼仪溶血眭链球菌和弧菌病灭活疫苗，欧美鲑鳟养殖中常用的冷水病疫苗、V H S 疫苗、PH V疫苗以及所有的弧菌苗、爱德华氏菌苗等都属于灭活疫苗。 2.3亚单位疫苗 亚单位疫苗是去除病原体中与激发机体保护性免疫无关的甚至有害的成分 ，保留有效免疫原成分制作的疫苗。 亚单位疫苗较全病毒疫苗除去了产生不良反应的物质，副作用减少。同时，由于除了去病毒核酸，也消 3

除了潜在致癌性及回复突变的可能性。此外，疫苗以直接被合成或通过重组 D N A技术生产。 但亚单位疫苗的研制必须进行大量的前期研究工作以确定保护性抗原， 即确定该 目标抗原是否为适合于基因克隆的蛋白质 ， 并确定编码抗原蛋白的基因能否被克隆和遗传操作，以生产商业化疫苗。且亚单位疫苗在实验室取得较好的免疫效果，但提取工艺复杂，成本较高。在国家“ 863”计划的资助下，珠江所近年来分离并确认了海水鱼类致病性弧菌菌株病原弧菌 400 余株，获得了主要代表性菌株 10 余株的 4 种亚单位成份、 克隆 3 种亚单位基因并表达 ，对提取和表达的亚单位成分进行了免疫特性等分析，获取的各亚单位成份制备疫苗并进行了免疫保护陛测定，浸泡免疫保护率为 50％～86．7％。生产性应用示范试验结果显示：免疫组比对照组提高成活率5％～37．1％，免疫鱼养殖呈生长稳定、发病少等特点。 2.4生物技术疫苗 生物技术疫苗是指利用生物技术制备的分子水平的疫苗，包罗基因工程亚单位疫苗、合成肽疫苗、独特型疫苗、基因工程活载体疫苗、D N A疫苗以及转基因菌蜕疫苗等。其中基因T 程亚单位疫苗和D N A 疫苗研究较多，其他种类的生物技术疫苗在水产方面的研究进展鲜有报道基因工程亚单位疫苗指利用重组DN A技术克隆病原蛋白质基因，在不同的基因表达系统中表达，产生能诱生中和抗体的蛋白质，再经过分离纯化而制备的疫苗。目前水产养殖上在研究应用的基因工程疫苗有IH N V、IPN V、FR V、鳗鱼病毒和文蛤病毒等疫苗 ，其中传染性胰脏坏死病毒(IPN V )V P2 重组亚单位疫苗是目前唯一一个商品化的鱼用重组蛋白疫苗。目前尚不能在组织培养细咆中生产的病毒疫苗都可以通过基因工程方法生产。 多价疫苗具有生产成本低和易于大规模生产的优点， 但存在研究成本高和周期长等缺点。目前，欧美各国盛行鱼类 D N A 疫苗的研究与开发。与蛋白质疫苗相比，D N A 疫苗通过宿主细胞表达目的抗原，蛋白表达的时间持久，不仅可以诱导体液免疫 ，还可以诱导细胞免疫 ；较少受温度的影响 ；D N A 疫苗生产成本低 。并且其免疫原性单一，即只有编码所需抗原的基因被导人细胞中表达，载体本身没有免疫原性 。因此单～剂量的 D N A 疫苗可激发长时间的免疫 ，但 D N A 疫苗要进行大规模的生产应用，还需许多改进的地方 ：免疫剂量问题 ；其免疫效力不够强 ；质粒 D N A 与宿主细胞染色体是否整合 ，是否诱导宿主产生免疫耐受陛及是否诱导宿主产生抗 D N A 抗体等问题 ，现在仍然不很清楚。抗独特型抗体疫苗是免疫调节网络学说发展到新阶段的产物。抗独特型抗体疫苗的突出优点是安全 、稳定，针对性较强 ，无副作用。但免疫应答太单一 ，也是它明显的缺陷。我国的海水鱼类细菌病多联抗独特型抗体疫苗 由中国人民解放军第四军医大学和北京卓越海洋生物科技有限公司共同研制开发 ，2004 年 2 月拿到了授予发明专利权通知书，并取得 了国家新 兽药证 书 ，该 疫苗对 海水 养殖鱼类保护率可达 20％～50％。应当注意 ，由不同的方法生产的疫苗 ，或者由不同病原体制备的疫苗 ，或者同一种疫苗使用时的途径 、剂量、佐剂的使用及鱼本身的生理状况与所处的环境等不同，疫苗所产生的效果及维持这一效果的时间也不同。

3 目前水产疫苗的发展方向 3 .1免疫新技术的应用 3 .1.1单克隆抗体技术 单克隆抗体是一个抗体产生的细胞与一个骨髓瘤 4

细胞融合而产生的杂交瘤细胞经无性繁殖而形成的细胞群，同时这些细胞将合成一种决定簇的抗体，称为单克隆抗体。优点是这些杂交细胞继承两种亲代细胞的特性，它既具有抗体细胞合成专一抗体的特性，也有骨髓瘤细胞能在体外培养增殖且永存的特性。 3 .1.2 荧光抗体技术 根据抗原抗体反应具有高度的特异性，以荧光色素作为标记物，与已知抗体结合(不影响其免疫学特性)，然后将荧光素标记的抗体作为标准试剂，用于鉴定未知的抗原，可在荧光显微镜下检查呈现荧光的抗原。特点是特异性强、速度快、敏感度高。 3.1.3 基因工程技术 基因工程技术是对DNA分子上的遗传单元(基因)进行操作，把不同来源的基因按照预先设计的蓝图，重新构成新的基因组合，再把它引入到细胞中的一种技术，从而构成具有新遗传特性的生物。其主要的优点是保证DNA小片段在新的寄主中进行扩增 。 3.1.4 酶联免疫吸附法(简称ELISA) 酶联免疫吸附法是抗原与抗体吸附于固相载体上，与酶结合，并在适当底物参与下，使基质水解而呈色，然后用分光光度计测定结果。呈色反应显示了酶的存在，从而证明发生了相应的免疫反应，所以这是一种特异而敏感的技术，可在微克或纳克水平上测定抗原或抗体。它始于1971年E ngvall的用碱性磷酸脂酶标记的 IgG 测定 IgG 的方法，随后这种方法得到迅速发展和不断完善。主要的优点是E LISA具有选择性好、灵敏度高、结果判断客观准确。 3.1.5 微胶囊技术 微胶囊技术是一种用成膜材料把固体或液体包覆形成微小粒子的技术。形成的微小粒子叫微胶囊。目前出现了纳米胶囊、脂质体、微生物以及无机材料壁材的微胶囊等微囊。特点是囊心与外界隔绝具有保护功能并且利于囊心的贮存运输。 3 .2 佐剂的应用 免疫佐剂是指与抗原同时或预先应用，能增强机体针对抗原的免疫应答能力，或改变免疫反应类型的物质。佐剂的功能可以概括为：增强抗体应答；增强疫苗的粘膜传递，增进免疫接触；增强弱免疫原的免疫原性，如高度纯化的抗原或重组抗原；减少抗原接种剂量和接种次数；促进疫苗在免疫应答能力弱的人群中的免疫效果；加快免疫应答的速度和延长持续时间；改变抗原的构型；改变体液抗体的种类和亲和性。张吉红、陆承平(2003)研究发现嗜水气单胞菌疫苗免疫银鲫，佐剂组抗体效价达1：64，相对保护率为67％；而不加佐剂免疫组抗体效价为1 ：32，相对保护率达56％，两者差异显著。 3 .3 口服疫苗的应用 水产口服疫苗现在所面临的最大问题是抗原的保护问题，核心是如何使抗原在载体和水体中具有较好的稳定性和如何在鱼体内保持抗原的完整性。因此选择合适的抗原处理方式、合理的有效剂量、适当的免疫时间、免疫程序和免疫次数等都是口服疫苗研究中亟待解决的问题。尽管目前注射型疫苗在疫苗市场中仍占主要位置，但因其在使用过程中劳动强度大、容易造成动物受伤引起感染甚至死亡等不利因素的存在，研发具有低刺激性、高敏感性、使用简便和低成本的口服疫苗是未来鱼用疫苗发展的趋势。 3 .4新型疫苗的研究推广 3 .4 .1 DNA疫苗研究 基因疫苗又称核酸疫苗，是编码免疫抗原或与免疫抗原相关因子的真核表达质粒D N A (有时也可是 R N A )。基因疫苗被宿主细胞摄取并经过转录和翻译产生抗原蛋白。抗原蛋白被注入动物体后产生特异性免疫