蛋白质和核酸的含量测定方法课件
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浙科版高中生物学必修1精品课件 第1章 第2节 第3课时 检测生物组织中的糖类和蛋白质,核酸
2.核酸的功能 (1)DNA中储藏的信息控制着细胞的所有活动,并且决定着 细胞和整个生物体的遗传特性。 (2)RNA是合成蛋白质所必需的。
生物科学的迅速发展为各个领域的技术进步奠定了坚实的 基础,如刑事案件中的“指纹”技术和医疗领域中的“亲子鉴定” 技术。请根据所学知识分析在“指纹”和“亲子鉴定”中发挥作 用的物质是什么?
3.下列样液与本尼迪特试剂混合后,在热水浴条件下不产生红 黄色沉淀的是( ) A.发芽小麦研磨液40 ℃恒温10 min之后的上清液 B.白萝卜匀浆 C.蔗糖溶液 D.10%的葡萄糖溶液 答案:C
解析:发芽小麦研磨液40 ℃恒温10 min之后的上清液中含有 葡萄糖、麦芽糖等还原糖,与本尼迪特试剂混合,在热水浴条 件下能产生红黄色沉淀。白萝卜匀浆中含有葡萄糖等还原糖, 与本尼迪特试剂热水浴加热后能产生红黄色沉淀。蔗糖溶液 中只含蔗糖,而蔗糖是非还原糖,所以与本尼迪特试剂热水浴 加热条件下不产生红黄色沉淀。
蛋白质的检测中,双缩脲试剂B如果加入过量,结果会怎样? 提示:会与试剂A反应,使溶液呈蓝色,进而掩盖实验生成的 紫色。
二、核酸 1.元素组成及基本单位:核酸由 C、H、O、N、P 五种元素组成,其基本单位为 核苷酸 。组成核酸的小分 子物质包括 五碳糖 、 磷酸基团 和 含氮碱基 。其 中,五碳糖有两种,即 脱氧核糖 和 核糖 ;含氮碱基有五 种,即 腺嘌呤(A) 、 鸟嘌呤(G) 、 胞嘧啶(C) 、 胸腺嘧啶(T) 和 尿嘧啶(U) 。 2.种类 核酸包括核糖核酸(即 RNA )和脱氧核糖核酸(即 DNA )。
(2)实验检测试剂的使用 双缩脲试剂的使用:先加试剂A(0.1 g/mL的NaOH溶液)2 mL, 再加试剂B(0.01 g/mL的CuSO4溶液)5滴,注意加入试剂B时, 要少量,若过量,试剂B会与试剂A反应,使溶液呈现蓝色进而 掩盖实验生成的紫色。
分光光度法检测蛋白质含量课件
实验考试
实验课成绩
平时表现
实验测验
原理
实验报告 ----格式 结果
操作考试
分析
第六页，本课件共有36页
实验报告网上提交
实验报告采取网上提交的方式，实验报告提交时间设定为3天，即本次实 验结束后第三天晚上12点之前提交，过期无法再提交，本次实验报告则记为0分。
尽早提交报告，不要等到最后期限，有时系统不稳定，可能提交不上去。
紫外光区 可见光区 红外光区
第十一页，本课件共有36页
如何定性？
—利用吸收光谱曲线鉴定化合物
吸收光谱曲线：
以不同波长的单色光作为入射光，测定某 一溶液的吸光度，以波长为横轴，吸光度 为纵轴作图，得到溶液的吸收光谱曲线。
每种物质有其特征性的吸收光谱，故可作
为定性分析的依据。
第十二页，本课件共有36页
（二）标本测定：取标本1.0ml，加入生理盐水3.0ml，测A280标准曲线上读出浓度。
第三十四页，本课件共有36页
小鼠肝脏组织总蛋白的提取
1. 颈椎脱臼处死小鼠，剪开腹部，取出肝脏组织，置于平皿中用 PBS清洗。
2. 称取100mg肝组织，剪碎，并转移到匀浆器中。
3. 将1mL 预冷的裂解缓冲液加入匀浆器中，冰浴条件下充分研磨。将 组织研磨液转移到1.5mL的离心管中。
关于分光光度法检测蛋白质含量
第一页，本课件共有36页
生物化学与分子生物学实验
实验室规则 实验室安全及防护 实验室常用玻璃仪器 实验考试
第二页，本课件共有36页
实验室规则
提前5分钟到实验室，不能迟到、早退、旷课，每迟到、早退一次 扣1分，每旷课一次扣5分。
禁止在实验室内吃食品，如有违反者按迟到处理。 上课必须穿隔离衣，不能穿拖鞋和吊带背心，否则禁止进入实验室。 实验期间手机必须设置在振动上，上课期间如急需接、打电话请到走廊上
【优】核酸含量测定最全PPT资料
纸擦净，溶液尽量加到试管下部，标准溶液要求用差量法。 6. 漩涡混合器的使用：用点动档，试管竖直或稍倾斜垂直向
下用力。 7. 测定吸光值时，用一个比色杯装去离子水调节分光光度计
零点，另一个比色杯按照从低浓度到高浓度的顺序测定， 不用润洗，切忌甩比色杯，将蓝色溶液撒在仪器和地面上。
12
思考题
0
8
3. 测定总磷量和回收率（与2同时进行）
7（空白） 8（样品） 9（标准）
定容溶液/mL
1.5
1.5
0.15
dH2O/mL 定磷试剂/mL
0
0
1.35
1.5
1.5
1.5
用漩涡混合器混匀，45℃恒温水浴保温25分钟
A660(1)
A660(2)
A660平均值
A660平均值—空白
0
9
数据处理
▪ 关于空白： 1—6号管用于绘制定磷标准曲线，1号管作
15mL ▪ 定磷试剂：含硫酸、钼酸铵、，浅黄色，如果变绿
则不能使用,每组用100mL烧杯取70mL
5
实验步骤
1. 核酸样品用硫酸消化，将有机磷转 化成无机磷；
2. 制定定磷标准曲线； 3. 测定回收率和样品总磷量。
6
1. 样品消化（每两组或三组做一份）
消化管1Βιβλιοθήκη 23RNA/mL
0
1
0
标准磷原液/mL
((23)) 计计算算R样N品A总量R磷：N量总 A：磷(量 g/mL) 1回 x.5收 5 0率 H(紫在用核二应酵要标5在(漩 定核核43%3))外标去酸苯。母求准标涡磷酸酸P，样计每(吸 准 离 样 胺 R试 磷 准 混标 样 样M即品算N人o收曲子品法剂原曲合 准品品1ARR3取μO法线水用：及液线器 曲用用NN样g11AA：上作硫D所：上的 线硫硫R品08含量N)支N利查为酸有含查使 的酸酸溶4AA量：试用出空消器磷出用 制消消液中磷：管核样白化皿量样： 定化化：的相，酸品，，清为品用 （，，2脱当0按在将洁点每将将(61(0氧于xx600照))有，动 人有有200μ核和和16n0g0下机不档 做机机0m/糖标标.μmn表测g磷含， 一磷磷m在准准L/Mm平处定转磷试 份转转酸磷磷oL2行有吸化；管 ）化化性((Oyy操吸光3))成竖 成成溶的的•作收值无直 无无液含含M：高机或 机机中磷磷o峰O磷稍 磷磷转量量3，；倾 ；；（化((μμ操斜钼为gg))作。。垂蓝ω简-直）羟便向-γ，-下酮受用基蛋力戊白。醛质，和利核用苷二酸苯的胺干试扰剂影反响应。，除脱氧木糖和阿拉伯糖外其他糖类无此反
下用力。 7. 测定吸光值时，用一个比色杯装去离子水调节分光光度计
零点，另一个比色杯按照从低浓度到高浓度的顺序测定， 不用润洗，切忌甩比色杯，将蓝色溶液撒在仪器和地面上。
12
思考题
0
8
3. 测定总磷量和回收率（与2同时进行）
7（空白） 8（样品） 9（标准）
定容溶液/mL
1.5
1.5
0.15
dH2O/mL 定磷试剂/mL
0
0
1.35
1.5
1.5
1.5
用漩涡混合器混匀，45℃恒温水浴保温25分钟
A660(1)
A660(2)
A660平均值
A660平均值—空白
0
9
数据处理
▪ 关于空白： 1—6号管用于绘制定磷标准曲线，1号管作
15mL ▪ 定磷试剂：含硫酸、钼酸铵、，浅黄色，如果变绿
则不能使用,每组用100mL烧杯取70mL
5
实验步骤
1. 核酸样品用硫酸消化，将有机磷转 化成无机磷；
2. 制定定磷标准曲线； 3. 测定回收率和样品总磷量。
6
1. 样品消化（每两组或三组做一份）
消化管1Βιβλιοθήκη 23RNA/mL
0
1
0
标准磷原液/mL
((23)) 计计算算R样N品A总量R磷：N量总 A：磷(量 g/mL) 1回 x.5收 5 0率 H(紫在用核二应酵要标5在(漩 定核核43%3))外标去酸苯。母求准标涡磷酸酸P，样计每(吸 准 离 样 胺 R试 磷 准 混标 样 样M即品算N人o收曲子品法剂原曲合 准品品1ARR3取μO法线水用：及液线器 曲用用NN样g11AA：上作硫D所：上的 线硫硫R品08含量N)支N利查为酸有含查使 的酸酸溶4AA量：试用出空消器磷出用 制消消液中磷：管核样白化皿量样： 定化化：的相，酸品，，清为品用 （，，2脱当0按在将洁点每将将(61(0氧于xx600照))有，动 人有有200μ核和和16n0g0下机不档 做机机0m/糖标标.μmn表测g磷含， 一磷磷m在准准L/Mm平处定转磷试 份转转酸磷磷oL2行有吸化；管 ）化化性((Oyy操吸光3))成竖 成成溶的的•作收值无直 无无液含含M：高机或 机机中磷磷o峰O磷稍 磷磷转量量3，；倾 ；；（化((μμ操斜钼为gg))作。。垂蓝ω简-直）羟便向-γ，-下酮受用基蛋力戊白。醛质，和利核用苷二酸苯的胺干试扰剂影反响应。，除脱氧木糖和阿拉伯糖外其他糖类无此反
蛋白质的测定课件参考.ppt
1.装水至 2/3 容积 处，加甲 基橙数滴 及硫酸数 毫升以保 持酸性
4.NaOH 溶液
4.5.6 5.水洗漏 步操 斗数次 作要 6.夹好漏斗 迅速 夹，水封。
2.管下端 插入液面 下(瓶内先 装硼酸液 及混合指 示剂2滴)
7.水蒸气蒸馏至指示剂变绿色 开始计时，蒸馏10min，将管
8.吸收液用0.01000mol/L HCl标准溶液滴定至
总蛋白质含量 氨基酸组成 蛋白质的营养价值
精选课件
2
5、蛋白质的测定方法
利用蛋白质共性的方法
凯氏定氮法 杜马斯法
福林酚法
利用特定氨基酸残基法
染色法
精选课件
3
第二节 蛋白质的定性测定
一、蛋白质的一般显色反应
电泳或纸层析之后用一些染料与蛋白质结合并 变色。书中列举了 5 种染料。
二、复合蛋白质的显色反应
第一节 概述
1.蛋白质的元素组成（The elements of protein）
▪ C：50-55% N：15-18% O：20-23%
▪ H：6-8% S：0-4%
▪ 微量元素：P、Fe、Zn、Cu
2、基本结构单位：氨基酸
3、蛋白质的变性作用。
精选课件
1
4、蛋白质分析的重要性
▪ 生物活性测定 ▪ 功能性质调查 ▪ 营养标签
精选课件
17
操作方法
▪ 1、制作标准曲线 取10支干试管分成两组，按下表平行操作：
0ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
1
2
3
4
标准蛋白液/ml
0.2 0.4 0.6 0.8
蛋白浓度 /(mg/ml)
2.0 4.0 6.0 8.0
蒸馏水/ml
4.NaOH 溶液
4.5.6 5.水洗漏 步操 斗数次 作要 6.夹好漏斗 迅速 夹，水封。
2.管下端 插入液面 下(瓶内先 装硼酸液 及混合指 示剂2滴)
7.水蒸气蒸馏至指示剂变绿色 开始计时，蒸馏10min，将管
8.吸收液用0.01000mol/L HCl标准溶液滴定至
总蛋白质含量 氨基酸组成 蛋白质的营养价值
精选课件
2
5、蛋白质的测定方法
利用蛋白质共性的方法
凯氏定氮法 杜马斯法
福林酚法
利用特定氨基酸残基法
染色法
精选课件
3
第二节 蛋白质的定性测定
一、蛋白质的一般显色反应
电泳或纸层析之后用一些染料与蛋白质结合并 变色。书中列举了 5 种染料。
二、复合蛋白质的显色反应
第一节 概述
1.蛋白质的元素组成（The elements of protein）
▪ C：50-55% N：15-18% O：20-23%
▪ H：6-8% S：0-4%
▪ 微量元素：P、Fe、Zn、Cu
2、基本结构单位：氨基酸
3、蛋白质的变性作用。
精选课件
1
4、蛋白质分析的重要性
▪ 生物活性测定 ▪ 功能性质调查 ▪ 营养标签
精选课件
17
操作方法
▪ 1、制作标准曲线 取10支干试管分成两组，按下表平行操作：
0ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
1
2
3
4
标准蛋白液/ml
0.2 0.4 0.6 0.8
蛋白浓度 /(mg/ml)
2.0 4.0 6.0 8.0
蒸馏水/ml
2024届高三一轮复习生物第3讲蛋白质和核酸课件
（蛋白质的空间结构没有发生变化）
蛋白质在高浓度盐溶液中析出，而DNA是在低浓度盐溶液 中析出，盐析为可逆过程。
五、蛋白质的变性和盐析
3.蛋白质的水解：
在蛋白酶作用下，肽键断裂，蛋白质分解为短肽和氨基酸。 水解和脱水缩合的过程是相反的。
肽键的断裂需要蛋白酶或肽酶水解。
易错辨析
（1）细胞内蛋白质发生水解时，通常需要另一种蛋白质的参与。
五、蛋白质的变性和盐析
1.蛋白质的变性：
过酸、过碱、重金属盐或高温会使蛋白质的 空间结构 遭到破 坏，使酶永久失活，但肽键 并未断裂 ，依然能和双缩脲试剂发生 紫色反应；低温不会破坏蛋白质的空间结构，只是抑制其功能。
应用 ①鸡蛋、肉类煮熟后由于高温使蛋白质分子的空间结构变得伸展、松散，
易于被蛋白酶水解，因而易于消化。 ②经过加热、加酸、加酒精等引起细菌和病毒的蛋白质变性，
2.(源于必修1 P22图2－6)胰岛素在核糖体上合成后还不具有降低血 糖的生物学活性，请从蛋白质的结构方面分析原因：
核糖体上合成的多肽需经内质网、高尔基体加工后才具备 一定的空间结构，从而成为有活性的蛋白质。
3.(源于必修1 P23“与生活的联系”)熟鸡蛋更容易消化的原因是： 高温使蛋白质分子的空间结构变得伸展、松散，容易被蛋
赖氨酸为必需氨基酸，人体不能合成，只能从食物中摄取才 能保证正常生命活动，玉米中不含赖氨酸，因此长期以玉米为 主食的人容易因赖氨酸缺乏而患病。
阐述基本原理，突破长句表达
1.(源于必修1 P21“正文”)请叙述氨基酸的结构特点： 每种氨基酸分子至少都含有一个氨基和一个羧基，并且都有一
个氨基和一个羧基连接在同一个碳原子上，这个碳原子还连接一 个氢原子和一个侧链基团。
蛋白质检测方法Ppt讲课文档
✓ ELISA 和 Western 杂交都利用抗原抗体间的分子识别作用 ，借助不同的抗体分子标记实现蛋白质的检测。
第7页，共41页。
紫外吸收法
✓ 理论基础：蛋白质分子中的酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸 残基使其在 280 nm 处具有紫外吸收， 其吸光度与蛋白质含 量成正比。 此外，蛋白质溶液在 238 nm 的吸光度值与肽键 含量成正比。 利用一定波长下蛋白质溶液的吸光度值与蛋 白质浓度的正比关系可以测定蛋白质含量。
分子的荧光被敏化增强
第21页，共41页。
✓ 基于蛋白质疏水作用： ✓ 在水介质中球状蛋白质的折叠总是倾向于把疏水性残基包埋
在分子内部而形成疏水空腔。疏水作用及亲水和疏水平衡在蛋 白质结构与功能方面起着关键作用。
✓ 利用极性敏感有机小分子荧光探针与蛋白质结合前后基于 其疏水空腔提供了一个非极性环境从而导致探针荧光性质的 改变
凯氏定氮法由于蛋白质是体内的主要含氮物，因此，通过测 定生物样品的含氮量便可估算出样品中的总蛋白质含量 。 蛋白质含量＝含氮量 Х 6.25
此方法的测定范围为0.2～1.0 mg氮。 ✓ 优点：应用范围广，重现性好、准确度高 ✓ 缺点：局限于样品中总蛋白的检测，破坏蛋白质结构，
易受到被测样品中其它有机含氮化合物的干扰
导致在不知道蛋白质种类的情况下测量结果存在部分偏差。
第11页，共41页。
比色法-BCA法
✓ BCA （Bicinchoninic acid) 试剂的主要成分为二喹啉甲酸钠 。 ✓ BCA并不能直接与蛋白质发生化学或是物理上的反应，而是对 双缩脲反应的强化。BCA 极易与 Cu+结合形成紫色的复合物，该 复合物在 562 nm 处有最大吸收峰，对入射光的吸收程度与 Cu+ 的浓度成正比。
第7页，共41页。
紫外吸收法
✓ 理论基础：蛋白质分子中的酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸 残基使其在 280 nm 处具有紫外吸收， 其吸光度与蛋白质含 量成正比。 此外，蛋白质溶液在 238 nm 的吸光度值与肽键 含量成正比。 利用一定波长下蛋白质溶液的吸光度值与蛋 白质浓度的正比关系可以测定蛋白质含量。
分子的荧光被敏化增强
第21页，共41页。
✓ 基于蛋白质疏水作用： ✓ 在水介质中球状蛋白质的折叠总是倾向于把疏水性残基包埋
在分子内部而形成疏水空腔。疏水作用及亲水和疏水平衡在蛋 白质结构与功能方面起着关键作用。
✓ 利用极性敏感有机小分子荧光探针与蛋白质结合前后基于 其疏水空腔提供了一个非极性环境从而导致探针荧光性质的 改变
凯氏定氮法由于蛋白质是体内的主要含氮物，因此，通过测 定生物样品的含氮量便可估算出样品中的总蛋白质含量 。 蛋白质含量＝含氮量 Х 6.25
此方法的测定范围为0.2～1.0 mg氮。 ✓ 优点：应用范围广，重现性好、准确度高 ✓ 缺点：局限于样品中总蛋白的检测，破坏蛋白质结构，
易受到被测样品中其它有机含氮化合物的干扰
导致在不知道蛋白质种类的情况下测量结果存在部分偏差。
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比色法-BCA法
✓ BCA （Bicinchoninic acid) 试剂的主要成分为二喹啉甲酸钠 。 ✓ BCA并不能直接与蛋白质发生化学或是物理上的反应，而是对 双缩脲反应的强化。BCA 极易与 Cu+结合形成紫色的复合物，该 复合物在 562 nm 处有最大吸收峰，对入射光的吸收程度与 Cu+ 的浓度成正比。
蛋白质含量的测定(共4张PPT)
第三页，共4页。
样品的测定
吸取提取液和稀释250倍的血清液各1.0mL于试管中（三次重复），分别 加5.0mL试剂甲，放置10分钟后，加试剂乙0.5mL，立即混匀，恒温37度 反应20分钟，测A750的值。
管号
1 2 3
小白 菜
T或A
管号
1 2 3
血清 T或A
☆小白菜用mg／g，血清用mg／mL。
／mL）
μg
1 样品（小白菜）液的提取
其中双缩脲法和Folin-酚法
0
1.0 0
2 以1号为参比，测A750的值。
0.2 0.8 50
进—一Fo步lin掌-酚握试分剂光法光（度L法ow—ry—法求3）标和准考曲马线斯、0亮.准蓝4确法测（定Br未od知0fo.样rd6品法、）正100
4 其中双缩脲法和Folin-酚法
蓝色反应（钼蓝和钨蓝的混合物）。由于蛋白质中含有带酚基
的酪氨酸，故有此颜色反应。因此，用Folin-酚法测定蛋白质 含量灵敏度较高。
第二页，共4页。
实验步骤 1.标准曲线的制作：按下表操作
管
BSA
H2O Pr.
蓝色反应（钼蓝和钨蓝的混号合物）。（300μg
含量
样品（小白菜）液的提取 是一般实验室中经常使用的方法。
蛋白质含量的测定
—Folin-酚试剂法（Lowry法）和考马斯亮蓝法
（Brodford法）
一 Folin-酚试剂法（Lowry法） 目的和要求
学习Folin-酚法测定蛋白质含量的原理和方法。
进一步掌握分光光度法——求标准曲线、准确测定未知样品、正 确使用仪器
第一页，共4页。
原理
蛋白质浓度可以从它们的物理化学性质，如折射率、比重、紫 外吸收等测定而得知：或用化学方法，如定氮、双缩脲反应、 Folin-酚试剂反应等方法来求算。其中双缩脲法和Folin-酚法
蛋白质及核酸的含量测定方法
仪器及试剂
1.实验器材 离心机, 离心管,紫外分光光度计； 2.实验试剂 (1)钼酸氨—高氯酸试剂(沉淀剂)：如配 制200ml，可在193ml蒸馏水中加入 7ml高氯酸和0.5g钼酸氨。用的方法有凯氏定氮法、双 缩脲法(Biuret)、紫外吸收法、考马斯 亮蓝法(Bradford)。
凯氏定氮法_原理
蛋白质是含氮的化合物。食品与浓 硫酸和催化剂共同加热消化，使蛋白 质分解，产生的氨与硫酸结合生成硫 酸铵，留在消化液中，然后加碱蒸馏 使氨游离，用硼酸吸收后，再用盐酸 标准溶液滴定，根据酸的消耗量来乘 以蛋白质换算系数，即得蛋白质含量。 因为食品中除蛋白质外，还含有其 它含氮物质，所以此蛋白质称为粗蛋 白。
三、仪器与试剂
（一）试剂 1、硫酸铜（CuSO4· 5H20） 2、硫酸钾 3、硫酸（密度为1.8419g/L） 4、硼酸溶液（20g/L） 5、氢氧化钠溶液（400g/L） 6、0.01mol/L盐酸标准滴 定溶液。 7、混合指示试剂：0.1%甲 基红乙溶液液1份，与0.1% 溴甲酚绿乙醇溶液5份临用 时混合。
【实验原理】
核酸、核苷酸及其衍生物都具有共轭 双键系统，能吸收紫外光，RNA和 DNA的紫外吸收峰在260nm波长处。 一般在260nm波长下，每1ml含1µg RNA溶液的光吸收值为0.022~0.024， 每1m1含1µg DNA溶液的光吸收值约 为0.020，故测定未知浓度RNA或DNA 溶液在260nm的光吸收值即可计算出 其中核酸的含量。
反应机理
（二）仪器 微量定氮蒸馏装置：如图所 示。 1、电炉； 2、水蒸气发生 器（2L平底烧瓶）；3、螺 旋夹a； 4、小漏斗及棒状玻璃 塞（样品入口处）；5、反 应室；6、反应室外层； 7、橡皮管及螺旋夹b； 8、冷凝管；9、蒸馏液接 收瓶。