多肽固相合成氨基酸树脂替代度的研究

多肽固相合成氨基酸树脂替代度的研究

孔凡琳

（江苏省徐州医药高等职业学校 江苏 徐州 221116）

摘 要： 介绍多肽固相合成中Fmoc 合成法的现状及进展，多肽类药物的作用以及发展前景，着重描述了Fmoc 固相多肽合成过程中树脂替代度的测定以及测定意义。比较以不同的投料比，不同的树脂以及不同的反应时间对替代度的影响。

关键词： 多肽；多肽类药物；固相合成；树脂；偶联反应；替代度

中图分类号：Q81 文献标识码：A 文章编号：1671－7597（2010）1010058－02

1 综述

料比分别是0.6：1和1：1，即A 反应柱内需投入氨基酸0.6mmol ，B 柱内需投入氨基酸1.0mmol 进行反应：

1.1 多肽前景

称取0.6mmolF-Pro ，0.6倍量HoBt 置于干燥洁净烧杯中，冰浴，用多肽类化合物广泛存在于自然界中，在人的生长发育，新陈代谢，疾适量DMF 溶解至澄清，倒入A 柱，通氮气搅拌使反应均匀充分，反应2小时后病以及衰老，死亡的过程中起着关键作用，是涉及生物体内各种细胞功能用茚三酮检测树脂，微呈蓝色近乎透明，抽干，DMF 、DCM 洗涤4遍，抽干，的生物活性物质。自从生物化学家用人工方法合成多肽以来[1]，伴随着分取少量树脂用甲醇收缩，干燥，抽干后置于EP 管中，标明A-1。

子生物学、生物化学技术的飞速发展，多肽的研究取得了惊人的、划时代称取1.0mmolF-Pro ，1倍量HoBt 置于干燥洁净烧杯中，冰浴，用适的进展。近年来，替代医学、天然药物、自然疗法已开始被西方社会认量DMF 溶解至澄清，倒入B 柱，加入1.5倍量的DIPCDI 溶液，通氮气搅拌使反识，美国FDA1999年开始，允许大豆蛋白制品标注可以预防心血管疾病的功应均匀充分，反应2小时后，用茚三酮检测为浅蓝近乎透明，抽干，DMF 、能，这就意味着健康与保健品将被人类社会重新认识。预防医学家告诉我DCM 洗涤4遍，抽干，取少量树脂用甲醇收缩，干燥，抽干后置于EP 管中，们，投资健康将有最少6倍的收获，把一切疾病控制在萌芽状态是健康行业标明B-1。

的重任，而多肽类生化保健品的商业化开发将是这个行业的最精彩篇章4）称取A-16.785mg ，B-19.683mg ，分别置于1mlEP 管中，加入[2]。

1mlDBLK 溶液置于振荡器中振荡20min 。

1.2 固相合成原理

5）打开UV2401分光光度计，选定检测吸光度程序，使其处于自检状固相合成的主要设计思想是[3]：先将所要合成肽链的羟末端氨基酸态，自检完毕后选择适宜波长待检。

的羟基以共价键的结构同一个不溶性的高分子树脂相连，然后以此结合在6）振荡20分钟后取出EP 管静置几分钟使树脂沉淀，溶液澄清，用移固相载体上，氨基酸作为氨基组分经过脱去氨基保护基，并同过量的活化液枪移取200ulDBLK 溶液置于10ml 比色管中，再分别移取100ulA-1、B-1上羟基组分反应接长肽链。重复（缩合－洗涤－去保护－中和和洗涤－下一清液置于另外两支10ml 比色管中，分别用DMF 加满，标明空白液、A-1、B-轮缩合）操作，达到所要合成的肽链长度；最后将肽链从树脂上裂解下1。

来，经过纯化等处理，即得所要的多肽。

7）取出分光光度计中的比色皿，用超纯水洗净后用甲醇收干，使比在宏观合成过程中，每联上一个氨基酸通过什么方法来检测连接完成色皿干燥洁净，用空白液分别荡洗两支比色皿，然后倒入空白液，用擦镜度呢？一种是通过茚三酮显色反应检测，其反应原理是：前一氨基酸脱保纸擦拭干净后放入光度计，在301nm 波长下调零。

护后N 端处于裸露状态，可被茚三酮染上颜色，连接下一Fmoc 保护氨基酸8）取出一支比色皿倒去空白液，用超纯水洗净后用甲醇收干，再用后，原本裸露的N 端形成肽键，处于闭合状态，因此茚三酮染不上颜色，但A-1溶液荡洗3遍，倒入A-1溶液，用擦镜纸擦拭干净后放入光度计，在是如果前一氨基酸脱保护不完全的话同样检不出颜色，从而造成反应已完301nm 波长下测出A-1溶液的吸光度，记录数据为0.205。

全的误解。为了使检测更准确，最好的办法是采用量化检测法[4]即在氨基9）倒出比色皿中A-1溶液，用超纯水洗净后用甲醇收干，再用B-1溶酸连接过程中检测树脂替代度。

液荡洗3遍，倒入B-1溶液，用擦镜纸擦拭干净后放入光度计，在301nm 波长2 实验报告

下测出B-1溶液的吸光度，记录数据为0.338。

2.1 实验内容

10）通过替代度公式计算出A-1的替代度（Sub ）为0.198；B-1的替代实验器材：反应柱，圆底烧瓶，移液枪，万分位电子天平，UV2401分度为0.228。

光光度计等。

2.2.2 用不同树脂连接氨基酸比较替代度的差异

原料及试剂：RinkResin （产地：苏州天马）、WangResin （产地：苏1）取出1.0mmolRink 树脂装入反应柱，标号C ，1.0mmolWang 树脂装入州天马）、F-Pro-OH （脯氨酸，产地：苏州天马）、HoBt （1-羟基苯并三另一支反应柱，标号D ，用DMF 分别洗涤3遍后用DCM 溶胀20分钟，抽干。

唑，产地：苏州天马）、DMF （N 、N-二甲基甲酰胺，产地：苏州天马）、2）在C 柱中加入新配制的DBLK 溶液脱保护10-12分钟，然后用DMF 、DCM （二氯甲烷，产地：苏州天马）、DBLK （六氢吡啶+DMF ）、DIPCDI （N ，DCM 洗涤7-8遍，抽干。

N-二异丙基碳二亚胺，产地：苏州天马）等。

3）实验分两组，采用相同的投料比比较树脂替代度的差异：

2.2 实验步骤

称取1.0mmolF-Pro ，1倍量HoBt ，置于干燥洁净烧杯中，冰浴，用2.2.1 采用不同投料比较替代度的差异

适量DMF 溶解至澄清，倒入C 柱，加入1.5倍量的DIPCDI 溶液，通氮气搅拌使1）取出2.0mmolRink 树脂，平均分成两份装入两支反应柱，标号A 、其反应均匀充分，反应2.5小时后用茚三酮检测淡黄，抽干，用DMF 、DCM 洗B ，用DMF 分别洗涤4遍，用DCM 溶胀20分钟，抽干。

涤三遍，抽干，取少量树脂用甲醇干燥，收缩，置于EP 管中，标明C-1。

2）在两柱中分别加入新配制的20%DBLK 溶液，反应8-10min ，脱去树称取1.0mmolF-Pro ，1倍量HoBt 置于干燥洁净烧杯中，冰浴，用适脂上的Fmoc 保护基，然后用DMF 和DCM 洗涤7-8遍至反应柱中无游离Fmoc 及量DMF 溶解至澄清，倒入D 柱，加入1.5倍量的DIPCDI 溶液，通氮气搅拌使其DBLK 溶液，抽干。

反应均匀充分，反应2.5小时，用茚三酮检测近乎透明，抽干，用DMF 、

）此时树脂上可以连接氨基酸了，实验分两组，氨基酸与树脂的投

① ② ① ②

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