第4章 体细胞胚胎发生
Chapter4体细胞胚胎发生
植物细胞的群体培养比较困难，受到溶氧 量、营养供给、对剪切力的适应性差等方 面的限制，目前还没有比较成熟的技术体 系。
2、意义：P81 、意义：P81 ① ② ③ ④ ⑤ ⑥
3、局限性： ①贮藏困难：易萌发，易脱水； ②成本较高：生产规模小、技术不成熟； ③体cell无性系变异：优良性状丢失； ③体cell无性系变异：优良性状丢失； 体cell无性系变异：在不施加任何选择压的情 cell无性系变异：在不施加任何选择压的情 况下，由离体的体细胞产生再生植株所表 现的变异。
（2）、生产应用： ①快繁 ②脱毒 单cell培养 cell培养 ③细胞培养 cell群培养 cell群培养 ④人工种子 次生产物 人工改良
三．长期培养物形态发生潜力的 丧失
有些愈伤组织或悬浮培养物起初具有器官 发生或胚胎发生的潜力， 发生或胚胎发生的潜力 ， 但经过反复继代 保存之后喧种形态发生能力常常逐渐下降， 保存之后喧种形态发生能力常常逐渐下降 ， 有些甚至完全损失。 为了解释这种现象， 有些甚至完全损失 。 为了解释这种现象 ， 现在有三种假说。 现在有三种假说。
Chapter 5 体细胞胚胎发生
概念 形成及结构 发生途径 影响因子 人工种子
体细胞胚胎的概念 胚胎：自然状态下，高等植物的胚胎是受精 胚胎：自然状态下，高等植物的胚胎是受精 作用后由雌雄配子结合而成的合子发育而 来的，称为合子胚。 来的，称为合子胚。 1、合子胚（生命周期） 合子胚（生命周期） 2、非合子胚 i、无融合生殖胚 ii、体细胞胚（组培周期） ii、体细胞胚（组培周期）
胚状体与合子胚的比较
合子胚 质量 来源 胚柄 形态 胚状体 萌发率高，质量 萌发率低，质量 好 差 受精卵 体细胞 or 离体生殖细胞 有，明显 即使有也不明显 固定，体积相对 复杂，常有两个 较小 以上的子叶体积 相对较大 低 高
第4章 器官发生与体细胞胚胎发生
胚状体与不定芽的区别
• 胚状体在组织学上具备以下和不定芽不同的三个特征：
• ①最根本的特征是具有两极性，即在发育的早期阶段， 从其方向相反的两端分化出茎端和根端，而不定芽或
不定根都为单向极性。
• ②胚状体的维管组织与外植体的维管组织无解剖结构 上的联系，而不定芽或不定根往往总是与愈伤组织的
要的。
胚状体与合子胚的比较
质量 来源
合子胚
胚状体
萌发率高，质量 萌发率低，质量
好
差
受精卵
体细胞
胚柄
有，明显
即使有也不明显
形态 变异率
固定，体积相对 复杂，常有两个
较小
以上的子叶体积
相对较大
低
高
（三）影响体细胞胚胎发生的 因素
1．生长调节物质
• （1）生长素类：
• 我们以离体培养条件下胡萝卜的体细胞胚胎发生的诱导过程来进 行分析（教程P99），在离体条件下胡萝卜体细胞胚的发育是一 个包括两个步骤的过程，每个步骤需要一种不同的培养基。愈伤 组织的建立和增殖所需要的是一种含有生长素的培养（增殖培养 基），通常所用的生长素是2，4-D，浓度范围0.5—1mg/L。在这 样一种培养上，愈伤组织的若干部位分化形成分生细胞团，称作 “胚性细胞团”。在增殖培养基上反复继代，胚性细胞团的数量 不断增加，但并不出现成熟的胚。然而，如果把胚性细胞团转移 到一种生长素含量很低或完全没有生长素的培养（成胚培养基） 上，它们就能发育为成熟的胚。看来，在增殖培养基中生长素的 存在，对于胚性细胞团后来在成胚培养基上发育为胚是必不可少 的。边疆保存在无生长素培养基中的愈伤组织不能形成胚。在这 个意义上，可把增殖培养基看成是体细胞胚胎发生的：诱导培养 基：，而把每个胚性细胞团看成是一个无结构的胚。
植物体细胞胚胎发生
植物体细胞胚胎发生正常情况下，植物胚胎发生是指受精后的一系列连续过程，即从合子（受精卵）到成熟胚的发生、发育的有规律变化，这种情况下形成的胚成为合子胚。
在离体培养条件下，植物离体培养的细胞、组织、器官也可以产生类似胚的结构，其形成也经历一个类似胚胎的发生和发育过程，这种类似胚的结构称为胚状体。
成熟的胚状体可以像合子胚一样长出根、芽，萌发再生植株。
植物离体培养细胞产生胚状体的过程称为体细胞胚胎发生，植物体细胞胚胎发生具有普遍性，已从200多种植物上观察到胚状体的发生，包括被子植物几乎所有重要的科和一些裸子植物。
在被子植物上，不仅能够从根、茎、叶、花、果实等器官的组织培养物中诱导产生二倍性胚状体，还能从花粉、助细胞和反足细胞中诱导产生单倍性胚状体，从胚乳细胞中诱导产生三倍性胚状体。
一、植物体细胞胚胎发生过程（一）体细胞胚胎发生过程虽然不同种类的植物体细胞胚胎发生的主要发育阶段的分划是不一致的，但一般可分为胚性愈伤组织诱导、体细胞胚胎诱导、体细胞胚胎早期分化发育、体细胞胚胎成熟、体细胞胚胎萌发和成苗五个阶段。
在双子叶植物上，体细胞胚胎发生经过原胚、球形胚、心形胚、鱼雷形胚和成熟胚阶段；在乔本科植物的成熟体细胞胚上，可以清楚的看到胚特有的结构，即盾片、胚芽鞘和胚根等。
体细胞胚与愈伤组织的维管系统没有连接，最后会从培养物的表面脱落下来。
（二）胚性和非胚性细胞或愈伤组织生理状态的差异胚性和非胚性细胞或愈伤组织生理状态有明显差异。
胚性细胞是一类独特的细胞，它与分生组织类似，通常较小，近圆形，具有较大的核和核仁并能高度染色，胞质浓厚。
多数典型的胚性愈伤组织的外表呈松脆颗粒状。
胚性与非胚性细胞或愈伤组织相比，DNA、RNA以及蛋白质的合成更为活跃，表现为含量和种类的增加、淀粉和可溶性糖含量增加、内源多胺含量升高、活性氧水平提高、同工酶谱和内源激素合成有明显变化等。
如胡萝卜胚性愈伤组织的淀粉含量高出非胚性愈伤组织的15～40倍，挪威云杉非胚性愈伤组织的乙烯生成速率比胚性愈伤组织高19～117倍，龙眼胚性愈伤组织的内源多胺和激素水平都高于非胚性愈伤组织。
第4章-胚胎培养PPT演示课件
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复习思考题：
1、植物胚胎培养分为哪些类型？各有何种特点 和要求？
2、胚胎培养有何意义？
3.花器官培养通常指花的哪些部分培养?常用的 基本培养基是什么?
4.在进行幼胚培养时，由于幼胚过小而分离困 难，可采取什么途径解决?
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温度。 C.光照：通常弱光培养。光暗交替有利幼胚生
长
•25
原胚(幼胚)的培养的条件
➢ 无机氮：
包括硝酸盐、亚硝酸盐或铵盐；
➢ 渗透压：
蔗糖，8%-10%，不同发育期，渗透压不一 样，初期高（WHY）。因为自然条件下，原 胚被一ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ高渗液体包围着。
➢ 复杂的天然提取物：
椰乳 CM有促进幼胚生长和分化的作用
4.培养：
加入生长素和CTK，诱 导形成愈伤组织或胚状 体，再分化成植株。
•51
•52
二、种子培养
优点： 1.植株分化容易，无菌操作方便，
打破休眠。 2.使杂种败育种子正常萌发。
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种子结构
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培养方法：
1.种子消毒：
◇种皮厚或不饱满的用0.1%升汞浸10-20min， 或用10%次氯酸钠浸15-20min。
（2N）
•8
一.培养类型
1、离体胚培养时期 A.异养期 B.自养期
A.异养期，完全依赖于周围细胞中的代谢，而 且依赖于周围胚乳消耗的养料。B.自养期，胚 能吸收培养基中的无机盐和糖，经过自身的代 谢作用合成其生长所必需的物质。
•9
2、离体胚培养类型 ⑴成熟胚培养 ⑵幼胚培养
•10
2、离体胚培养类型
完全成熟的胚乳，生理活动很弱，在诱导脱分化前， 必须借助于原位胚的萌发，使其活化。
体细胞胚发生
植物物种和品种基因型影响 愈伤组织的分化
• 程林梅等（2001）的研究表明，利用不同 基因型大豆品种的下胚轴作外植体进行组培时， 培养基对愈伤组织的影响不明显；细胞分裂素 （KT）和NAA的配比浓度对其愈伤组织的分 化影响显著；不同基因型大豆植株再生作用差 异明显；外植体取材时间和取材部位对再生植 株的形成也具有较大的影响，再生能力最强的 取材部位时从子叶节到下胚轴6mm区段,当下 胚轴长到2~3cm时取材最佳。
2 氮源 除生长素外，培养基中氮源的形态也会影响离 体条件下的胚胎发生。只有当培养基中含有一定量 的还原态氮时，才能出现胚胎发生过程。 在以KNO3为唯一氮源的培养基上建立起来的 愈伤组织，去掉生长素后不能形成胚。然而，若在 55mmol/LKNO3的培养基中加入少量的 (5mmol/L)NH4Cl形态的氮，胚胎发生过程就会出 现。
不同浓度的激素对烟草愈伤组织的影响
愈伤分化
器官分化的植物激素控制理论
• 大量的实验结果表明：
大多数植物组织或器官的再生作用符合器 官分化的植物激素控制理论。
即：生长素与细胞分裂素的比例小时则产 生苗，比例大时则生根，而两种激素的比例适中 时，则产生无结构的愈伤组织。
器官发生途径
外植体 脱分化 愈伤组织 再分化
• 1.4.1.2位置效应
1.4.2 器官分化信息传递
1.4.2.1 胞外信号分子
• 胞外通讯信号分子又称第一信使(first messenger)。在植物细胞外的通讯信号分子，， • 如植物激素主要通过维管束系统在细胞与器官间 进行调节。它在植株的某些发育阶段，于特， • 部位发生作用。植物激素信号由位于膜或其它部 位的受体所接收，进一步直接或间接地影响： • 因表达。当植物激素以直接的形式影响基因表达 时，就会产生在转录、翻译等水平上的不同， • 应，从而控制酶的合成，影响代谢变化，最终产 生某些生理反应。
植物体细胞胚胎发生起源研究进展
体细胞通过与合子胚发生相似 的途径形成类 似合子胚
结构的过程 。在植物长期进化 的过 程中 ， 许多物种形成 了不同的无性胚胎 发生方式来克 服影响受精 的环境和 基因的因素。植物胚 胎不但可从离 体培养 的已分化的 体细胞获得 ， 而且体细胞胚胎发生过程与合子胚胎发生 过程相似 ， 所形成的胚具有类似于合子胚的极性和典型 的胚性器官 ， 如胚根 、 下胚轴和子 叶等。 自从 １５ ９ ８年 Ｓｅ ａ … 在胡萝 卜 ｔ ｒ ｗｄ 细胞悬 浮培养 中 发现体细胞胚 胎发生 以来 ， 物学家 对此 进行 了广泛 植 的研究 ， 体细胞胚 胎发 生的潜 力在 大量 的植 物 中被发
结 ， 内省 外化成 文字 ， 升 为新概念 ， 导今 后 的实 将 上 指
践， 即所谓 “ 上来 ” 如写 教 学案 例 、 浮 ， 教学叙 事 、 后 教 记等 。
●
理论 修养 ， 自己的理论水 平跟 上课 改 的步伐 。在 学 使 习中反思 自己的 观念 和 教学 实 践 ， 总结 经验 ， 出不 找
子叶 ， 下部分形成胚轴 、 根和根 分生组织 中近基原始 细 胞 。植物体细胞胚胎发生是指在离体培养条件下 植物
起源和单 细胞起 源。Ｂ ｔ ｎ等【Ｊ ｕｔ ｏ ２用果胶酶处理柑 桔的
愈伤组织 ， 细胞解离后再用微孔筛 过滤 ， 使 除去 未完全 解离的细胞 团后培养单个细胞 ， 最后得 到体细胞胚 胎 ， 由此证 明体 细胞 胚 胎来 源于 单个 细胞 。王 亚馥 等 ｌＪ ３ 发现小麦体细胞胚胎是起源 于愈伤组织表 层或近表 层
现 ， 利用其各 种不 同的器官 、 织 、 并 组 细胞 和 原生 质体
培养得到 了体 细胞 胚胎 ， 表 明植物 体细胞胚 胎 的发 这
第4章 体细胞胚胎发生
第4章体细胞胚胎发生§起源于一个非合子细胞、经过胚胎发生和胚胎发育过程形成的具有双极性的胚二、体细胞胚胎发生的例证离体条件下的体细胞胚胎发生过程最早是在胡萝卜中发现Steward等，1958）。
固体培养基上也能萌发。
中都表现了体细胞胚三、体细胞胚胎发生的方式图4.5 体细胞胚胎发生方式（左：不经过愈伤组织阶段；右：先愈伤化）4.6 菊花花瓣体细胞胚胎发生及体胚发育过程的扫描电镜观察四、体细胞胚的成熟与萌发成熟图4.7 体细胞胚的萌发五、体细胞胚与合子胚的比较双子叶植物胚胎发生：图4.8 拟南芥的胚胎发生图4.9大豆体细胞胚胎发生合子胚和不定胚一般都能发育成正常的成熟胚。
与合子胚相似，球形期后的体细胞胚呈现一种固定的极六、长期培养物形态发生潜力的丧失（一）遗传说（二）生理说（三）竞争说§一、生长调节物质在离体条件下胡萝卜体细胞胚的发育是一个包括两个步二、氮源三、其他因子1§一、人工种子的优势二、人工种子的制作流程在制造单胚人工种子的时候，主要采用诸如藻酸钠一类的水凝胶作为体细胞胚的包被）在室温下为液体，很适用于制造人工种子。
当体细胞胚与藻酸钠混合以后，再滴入内表面即可完全络合，形成一层持久的10在种皮基质中可加入一些对体细胞胚有益的物质，如能促进生长的微生物、营养物质、生长调节物质、杀虫剂，以及用于旱地播种的亲水性化合物等作为人工胚乳。
图4.11 用漏斗分离器生产藻酸钙包被的人工种子三、理想包埋介质（人工胚乳和人工种皮）条件表4.1 可用于包被体细胞胚的几种水凝胶水凝胶四、人工种子包埋方法（1本章小结五、促成体细胞胚同步发育的方法（1）在细胞培养初期，于培养基中加入DNA合成抑制剂，。
体细胞胚胎发生
心形胚
心形胚 原胚、球形胚、心形胚 球形胚、心形胚 原胚 原胚 原胚 原胚 球形胚、心形胚、鱼雷胚 球形胚、心形胚 胚性细胞、原胚 球形胚 原胚、球形胚、心形胚、鱼 雷胚 胚性细胞、球形胚、心形胚 胚性细胞、球形胚、心形胚 、鱼雷胚、小植株 球形胚、心形胚
第七章 植物体细胞胚胎发生
本章主要内容
体细胞胚胎的概念、特点和意义 影响体细胞胚发生的因素 体细胞胚胎发生的生物学 人工种子
一、体细胞胚胎的概念、特点和意义
概念
离体培养下没有经过受精过程，但经过胚 胎发生和胚胎发育过程所形成的类胚结构，称 为胚状体（embryoid）或体细胞胚（somatic embryo）。
饥饿；有丝分裂阻止
2、人工种子包埋
包埋材料： 海藻酸钠、明胶、果胶酸钠、琼脂、树胶
包埋方法： 液胶包埋法；干燥包埋法；水凝胶法
人工胚乳研制
木薯淀粉与海藻酸钠混合胚乳是目前比较理想 的材料，还可以在胚乳中加入激素（GA3等）、 缓释物（活性炭等）、固化剂（CaCl2等）、抗生 素、其他混合物等制作全能性人工胚乳。
人工种皮研制
壳聚糖、El-vax-4260（10％环己烷）等
三、人工种子转换实验
转换指人工种子在一定条件下，萌发、生长、 形成完整植株的过程。可以分为无菌条件下的转 换和土壤条件下的转换。
2、培养基的影响
碳源
碳水化合物的种类和浓度可以影响体细胞胚的生长 发育，蔗糖是体胚发生最有效的还原碳源。但在一些 试验中，某些糖的培养效果优于蔗糖。还可添加半乳 糖、可溶性淀粉等促进体胚的生长发育。
糖类还可作渗透调节剂对体胚发育或成熟起作用。
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第4章体细胞胚胎发生§
起源于一个非合子细胞、经过胚胎发生和胚胎发育过程形成的具有双极性的胚
二、体细胞胚胎发生的例证
离体条件下的体细胞胚胎发生过程最早是在胡萝卜中发现
Steward等，1958）。
固体培养基上也能萌发。
中都表现了体细胞胚
三、体细胞胚胎发生的方式
图4.5 体细胞胚胎发生方式
（左：不经过愈伤组织阶段；右：先愈伤化）
4.6 菊花花瓣体细胞胚胎发生及体胚发育过程的扫描电镜观察四、体细胞胚的成熟与萌发
成熟
图4.7 体细胞胚的萌发
五、体细胞胚与合子胚的比较
双子叶植物胚胎发生：
图4.8 拟南芥的胚胎发生
图4.9大豆体细胞胚胎发生合子胚和不定胚一般都能发育成正常的成熟胚。
与合子胚相似，球形期后的体细胞胚呈现一种固定的极
六、长期培养物形态发生潜力的丧失（一）遗传说（二）生理说（三）竞争说
§一、生长调节物质
在离体条件下胡萝卜体细胞胚的发育是一个包括两个步
二、氮源三、其他因子
1
§一、人工种子的优势
二、人工种子的制作流程
在制造单胚人工种子的时
候，主要采用诸如藻酸钠一类
的水凝胶作为体细胞胚的包被
）在室温下为液体，很适
用于制造人工种子。
当体细胞
胚与藻酸钠混合以后，再滴入
内表面即
可完全络合，形成一层持久的
10
在种皮基质中
可加入一些对体细
胞胚有益的物质，
如能促进生长的微
生物、营养物质、
生长调节物质、杀
虫剂，以及用于旱
地播种的亲水性化
合物等作为人工胚
乳。
图4.11 用漏斗分离器生产藻酸钙包被的人工种子
三、理想包埋介质（人工胚乳和人工种皮）条件
表4.1 可用于包被体细胞胚的几种水凝胶水凝胶
四、人工种子包埋方法（1
本章小结
五、促成体细胞胚同步发育的方法
（1）在细胞培养初期，于培养基中加入DNA合成抑制剂，。