皱纹盘鲍(Haliotis discushannai Ino)胚胎RNA分离和cDNA文库构建
鲍分子遗传学研究进展
*国家自然科学基金项目(30231013)和福建省自然科学基金项目(B0110036)资助收稿日期:2005-04-08 改回日期:2005-05-16鲍分子遗传学研究进展*黎中宝(集美大学水产学院 厦门 361021)摘 要 阐述了近年来鲍分子遗传学方面的研究进展,总结了核型分析、等位酶、微卫星和小卫星、随机扩增多态性DNA 、限制性片断长度多态性、线粒体DNA 、表达序列标签研究和基因序列等技术在鲍种群遗传多样性、遗传分化、遗传结构及种质鉴定等方面的应用。
并指出今后应加强鲍蛋白质组学、功能基因组学、遗传连锁图谱、数量性状基因座和标记辅助选择等方面研究。
关键词 鲍 分子遗传学 等位酶 微卫星和小卫星 基因序列Adv ances in molecular genetics of abalone .LI Zhong -Bao (School of Fisheries ,Jimei University ,Xiamen 361021,China ),CJEA ,2006,14(1):16～20Abstract The advances in molecular genetics of abalone are stated .Genetic markers in molecular genetics of abalone in -clude karyotype analysis ,allozyme ,microsatellite and minisatellite ,RAPD ,RFLP ,MtDNA ,ESTs and gene sequence markers .The application of these markers has made a good progress in investigations of genetic diversity ,genetic differen -tiation ,genetic structure ,species and strain identification in abalone .It will be strengthened in aspect of proteomics ,function genomics ,genetic linkage maping ,quantitative trait loci (QT L )and marker -assisted selection (MAS )in abalone .Key words Abalone ,Molecular genetics ,Allozyme ,Microsatellite and minisatellite ,Gene sequence (Received April 8,2005;revised May 16,2005)鲍为海产“八珍”之首,属名贵海珍品,经济价值高,是极为重要的养殖对象。
皱纹盘鲍三倍体生长的初步研究
皱纹盘鲍三倍体生长的初步研究
孙振兴;宋志乐;李诺;赵玉山;关向华
【期刊名称】《海洋湖沼通报》
【年(卷),期】1992()4
【摘要】将用低温休克法和细胞松弛素B诱导法,获得的皱纹盘鲍(Haliotis discus hannai Ino)三倍体诱导群与二倍体的个体,在室内同样条件下饲育,对其生长情况进行了比较,结果表明:(1)三倍体与二倍体的当年稚鲍在壳长和体重的增长上无明显差异。
(2)三倍体与二倍体的2龄鲍,在第二年前期生长无明显差异,但从第二年后期开始,三倍体的壳长、体重增长逐渐优于二倍体。
(3)统计学分析表明,三倍体与二倍体的3龄鲍在体重、软体部和足肌的增长方面,存在着明显差异。
(4)在室内饲育19个月的鲍,三倍体诱导群的壳长比二倍体大10.2％,体重比二倍体大20.1％,足肌湿重比二倍体大17.6％。
【总页数】6页(P70-75)
【关键词】皱纹盘鲍;三倍体;生长
【作者】孙振兴;宋志乐;李诺;赵玉山;关向华
【作者单位】山东省水产学校;烟台市芝罘区水产局
【正文语种】中文
【中图分类】Q959.4
【相关文献】
1.药物诱导皱纹盘鲍三倍体作用机理研究 [J], 李霞;王子臣;张国范;毛连菊;李雅娟;常亚青;高悦勉;胡庆杰
2.杂色鲍与皱纹盘鲍、盘鲍杂交的初步研究 [J], 柯才焕;田越;周时强;李复雪
3.三倍体皱纹盘鲍(Haliotis discus Hannai)性腺发育的生物学研究 [J], 李霞;阎松;张国范;王子臣
4.人工诱导皱纹盘鲍三倍体的研究 [J], 孙振兴;宋志乐
5.提高皱纹盘鲍稚鲍越冬成活率与加速生长的初步研究 [J], 聂宗庆;季梅芳
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3种鲍基因组DNA多态性的RAPD分析
第18卷第3期大连水产学院学报Vol.18No.3 2003年9月J OURNAL OF DAL IAN FISHERIES UN IV ERSIT Y Sep.2003文章编号:1000-9957(2003)03-0191-06 3种鲍基因组D NA多态性的RAPD分析邢荣莲1, 丁 君1, 滕利平2, 常亚青1, 宋林生3(1.大连水产学院农业部海洋水产增养殖学与生物技术重点开放实验室,辽宁大连116023;2.大连老虎滩 海洋公园,辽宁大连116013;3.中国科学院海洋研究所实验海洋生物学开放实验室,山东青岛266071)摘要:利用随机扩增多态DNA技术检测了中间鲍Haliotis midae、皱纹盘鲍Haliotis discus hannai和九孔鲍Haliotis diversicolor supertexte3种鲍基因组DNA的多态性,初步进行了分子水平上的分类研究。
经24个随机引物扩增,共得到376条多态性片段,片段长度为250～2500bp。
根据片段的共享度计算出平均遗传距离指数,并采用U PGMA和NJ两种聚类分析方法进行处理得到系统树。
在U P2GMA聚类中,中间鲍与九孔鲍先聚在一起,有较近的亲缘关系,其次是皱纹盘鲍,而它们之间的遗传距离相差不大,NJ聚类图上就反映出3种鲍聚为3类,所以两种聚类分析结果基本一致,与它们形态上存在明显差异的结果基本吻合,说明RAPD技术可以作为鲍种质鉴定和分类的一种有效、简便的辅助手段。
关键词:RAPD;鲍;基因组DNA;亲缘关系中图分类号:Q789 文献标识码:A鲍是一种具有很高经济价值的贝类,一些渔业经济比较发达的国家对鲍的养殖越来越重视,将鲍作为优良的水产增养殖生物之一,列为其“栽培渔业”、“蓝色牧场”等渔业工程项目的重要支柱产业[1]。
了解鲍的种类及分类是养鲍业发展的前提,以往多数学者使用的分类依据,主要是根据其形态方面的某些特征来确定。
皱纹盘鲍三倍体诱导条件及其室内饲育试验
皱纹盘鲍三倍体诱导条件及其室内饲育试验
孙振兴;李诺
【期刊名称】《水产学报》
【年(卷),期】1993(017)003
【摘要】皱纹盘鲍(Haliotis discus hannai)是我国重要的海洋经济贝类之一,近年来北方沿海已开展了人工养殖。
但普通二倍体鲍需生长3—4年才能达到商品规格,养殖周期长。
由于三倍体的不育性,其能量可全部用于生长,这对改善鲍的生长,缩短养殖周期有着积极的意义。
有关鲍三倍体的研究起步较晚,在国外,Arai等[1986]。
【总页数】6页(P243-248)
【作者】孙振兴;李诺
【作者单位】不详;不详
【正文语种】中文
【中图分类】S968.329
【相关文献】
1.几种规格皱纹盘鲍的饲育密度对生长的影响 [J], 李昌达;许曹鲁;陈秋萍;林振士;苏友山
2.二倍体和三倍体皱纹盘鲍精子发生过程的超微结构 [J], 阎松;李霞;张国范
3.皱纹盘鲍陆上养成条件的研究—I几种规格鲍饲育密度对生长的影响 [J], 苏浩;蒋辰鸣
4.皱纹盘鲍（Haliotis discus hannai Ino）亲鲍室内人工促熟培育的初步试验 [J],
刘永襄;高绪生;刘永峰
5.西盘鲍与皱纹盘鲍渔排养殖对比试验 [J], 沈明峰
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皱纹盘鲍工厂化育苗技术
皱纹盘鲍工厂化育苗技术
刘从德
【期刊名称】《水产养殖》
【年(卷),期】1999(000)001
【摘要】利用坑道培育和海捕的皱纹盘鲍亲体，进行人工催产，授精；以高密度
集中培育浮游幼虫；用以舟形藻，卵形藻和菱形藻为主的底栖硅藻作为开口饵料，进行稚鲍前期培育；以幼鲍专用饲料作稚鲍后期饵料，进行稚鲍后期流水平面培育。
１９９６年在８ｍ＾２的采苗水面培育出壳长１．０￣１．２ｃｍ的稚鲍２．４万个，１９９７年在５０ｍ＾２的采苗水面培育出壳长１．０￣１．７ｃｍ的幼鲍１６万个。
【总页数】1页(P3)
【作者】刘从德
【作者单位】连云港市连岛镇人民政府
【正文语种】中文
【中图分类】S968.325
【相关文献】
1.杂色鲍与皱纹盘鲍、盘鲍杂交的初步研究 [J], 柯才焕;田越;周时强;李复雪
2.西盘鲍与皱纹盘鲍渔排养殖对比试验 [J], 沈明峰
3.皱纹盘鲍（Haliotis discus hannai Ino）工厂化育苗技术的研究 [J], 潘智韬;程国宝;施维德
4.皱纹盘鲍养殖技术——皱纹盘鲍网箱养殖技术 [J], 王路平
5.皱纹盘鲍养殖技术——皱纹盘鲍网箱养殖技术 [J], 王路平
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皱纹盘鲍4个养殖群体杂交子代生长与存活状况比较
中国水产科学 2018年5月, 25(3): 536-545 Journal of Fishery Sciences of China研究论文收稿日期: 2017-09-04; 修订日期: 2017-10-26.基金项目: 山东省农业良种工程项目(2017LZQC009).作者简介: 江海林(1992–), 女, 硕士研究生, 专业方向为贝类遗传育种. E-mail: hailinchiang@ 通信作者: 冯艳微, 助理研究员, 研究方向为贝类遗传育种. E-mail: fywzxm1228@DOI: 10.3724/SP.J.1118.2018.17315皱纹盘鲍4个养殖群体杂交子代生长与存活状况比较江海林1, 2, 冯艳微1, 刘春廷1, 2, 姜绪1, 刘相全11. 山东省海洋资源与环境研究院, 山东省海洋生态修复重点实验室, 山东 烟台 264006;2. 上海海洋大学 水产与生命学院, 上海 201306摘要: 为利用杂种优势培育皱纹盘鲍(Haliotis discus hannai )优良新品种, 本研究以4个不同养殖群体[黄岛(HD)、荣成(RC)、日本(JP)、大连(DL)]的皱纹盘鲍为亲本, 设计4×4完全双列杂交, 建立了4个自交家系和12个正反杂交家系, 在利用微卫星标记进行亲子鉴定的基础上, 对各家系的F 1在1、5、13、17月龄时的生长性状、杂种优势率、生长速度和存活情况进行比较, 分析杂交效应。
结果表明, 在各个生长阶段均有部分杂交家系与自交家系相比表现出显著的生长优势; HDRC 、HDDL 和JPDL 家系的生长速度较高; HDDL 、HDJP 、RCDL 、JPRC 及RCHD 家系有着较高的存活率; 在杂种优势方面, HDRC 、HDDL 与DLHD 家系在各生长参数与生长速度上有明显的杂种优势, HDDL 、RCDL 、DLHD 家系在存活率上表现出明显的杂种优势。
皱纹盘鲍眼部组织的显微及亚显微结构观察
皱纹盘鲍眼部组织的显微及亚显微结构观察高霄龙;张墨;李贤;宋昌斌;刘鹰【摘要】采用组织学和电镜的方法，对皱纹盘鲍(Haliotis discus hannai Ino)的眼部组织进行了光镜和电镜观察，以期为进一步从分子生物学角度解析鲍对光照的生理响应机制提供组织学与细胞学基础。
结果发现，眼部组织由外至内依次为视网膜色素上皮细胞层、外核层、光感受器内节、内核层、黑色素颗粒沉积层、视觉纤维层。
组织表面布满乳头状突起，每一乳状突起的顶端均具有一簇或两簇纤毛环。
疏松结缔组织和平滑肌纤维等是组织内的主要成分，结缔组织间分布的胶原纤维等对保持细胞的弹性和韧性具有重要的作用。
研究结果显示了鲍的眼部组织在感受和辨识外界光环境因子中的重要作用，也为鲍养殖生产中的光环境因子优化和调控、深入探讨鲍对光照的生理应答机制提供了形态学依据。
%Light is a key environmental factor that influences the growth, culture and survival of aquatic organisms. In the present study, the eye tissues ofHaliotis discus hannaiIno were observed under the light microscope, scan-ning electron microscope and transmission electron microscope to provide an enhanced histological and cytologi-cal basis for analysis of the physiological response mechanism of abalone to light from the perspective of mo-lecular biology. Findings show that the eye tissues, from the outside to the inside, are: retinal pigment epithelium, outer nuclear layer, inner segment, inner nuclear layer, melanin granules sediment and optical fiber layer. Connec-tive tissue mainly exists between the epithelium and the outer nuclear layer, and a portion of the connective tissue nucleus is a darker color. The optical fiber layer mainly comprises the light red reticular nervefibers which gradually become dense from the outside to the inside. The front ends of eye tissues are cylinder-shaped with an obvious circular depression, in which the reticular nerve fibers are mostly found. The surface of the eyestalk com-prises a large number of reticular fibers where the cavities of various sizes are densely distributed. The surfaces of eye tissues are covered with papillae and the top of every papilla has one or two clusters of ciliary rings. The ex-istence of desmosomes between adjacent cells can be clearly seen, and these can limit the expansion of cells and closely link them. Nucleiare found in various shapes and the double-layer nucleus is tightly enveloped by the cell membrane, which contains euchromatin and a few heterochromatin. Myofibrils are widely distributed and are composed of a large number of myofilaments closely arranged along the myofibrils; however, no obvious connec-tion is formed between them. Loose connective tissue, smooth muscle fiber and others are main components in the tissues. Collagenous and other types of fibers distributed between the connective tissues play a key role in main-taining the flexibility and toughness of cells. Mitochondria, Golgi apparatus and lysosomes are also widely dis-tributed in supporting cells. Amoebocytes are uniquely shaped and distributed between the loose connective tis-sues with pseudopodia and a large number of high electron density particles. Many melanin granules are densely distributed in the cytoplasm; these can prevent strong light from damaging the optical cells, and they also stabilize the internal environment of the retina. Findings demonstrate the significant role played by the optical tissues of the abalone in sensing andidentifying external light environmental factors. They also provide a morphological basis for the optimization and regulation of light environmental factors in aquaculture production, as well as an in-depth discussion of the abalone’s physiological response mechanism to light.【期刊名称】《中国水产科学》【年(卷),期】2016(023)006【总页数】8页(P1247-1254)【关键词】皱纹盘鲍;眼部组织;显微结构;亚显微结构【作者】高霄龙;张墨;李贤;宋昌斌;刘鹰【作者单位】中国科学院海洋研究所，山东青岛 266071; 中国科学院大学，北京100049; 大连海洋大学，辽宁大连 116023;中国科学院海洋研究所，山东青岛266071;中国科学院海洋研究所，山东青岛 266071; 海洋生态养殖技术国家地方联合工程实验室，山东青岛 266071;中国科学院半导体研究所，北京 100083;中国科学院海洋研究所，山东青岛 266071; 大连海洋大学，辽宁大连 116023; 海洋生态养殖技术国家地方联合工程实验室，山东青岛 266071【正文语种】中文【中图分类】S968皱纹盘鲍(Haliotis discus hannai Ino)是中国重要的海产经济贝类,Gao等[1]研究发现红、橙光下鲍的生长、摄食等均显著优于短波长的蓝、绿光组。
温度骤变对皱纹盘鲍与西氏鲍及其杂交群体的热休克蛋白表达影响
温度骤变对皱纹盘鲍与西氏鲍及其杂交群体的热休克蛋白表达影响梁爽;骆轩;游伟伟;柯才焕【摘要】杂交是改良种质的有效方法,杂交后代往往具有生长率、存活率、抗逆性方面的优势.为研究杂交对鲍的耐热性的影响,以皱纹盘鲍(Haliotis discus hannai)、西氏鲍(Haliotis gigantea)以及它们的正反交F1代为研究材料,以半定量PCR为研究手段研究了在梯度温度应激下,2种热休克蛋白(HSPs)在4个群体中的表达情况.实验结果表明,在正常温度下,西氏鲍具有最高的HSPs水平；在应激条件下,皱纹盘鲍的HSPs水平呈现先上升后下降的趋势,其他3个群体的HSPs水平均随温度上升而上升；在相对高温的30℃条件下,皱纹盘鲍的HSPs水平显著低于其他3个群体.本研究的结果说明,正反交F1代明显地继承了西氏鲍的耐高温能力,表现出杂种优势或中亲优势.【期刊名称】《厦门大学学报（自然科学版）》【年(卷),期】2013(052)005【总页数】6页(P697-702)【关键词】杂交;皱纹盘鲍;西氏鲍;热休克蛋白【作者】梁爽;骆轩;游伟伟;柯才焕【作者单位】厦门大学海洋与地球学院,福建厦门361102;厦门大学海洋与地球学院,福建厦门361102;厦门大学海洋与地球学院,福建厦门361102;厦门大学海洋与地球学院,福建厦门361102【正文语种】中文【中图分类】Q75鲍，隶属于软体动物门（Mollusca）、腹足纲（Gastropoda）、鲍科（Haliotidae），是一种营养价值丰富的海产品.由于鲍具有很高的经济价值，因此在我国开展了大规模的养殖，其中，皱纹盘鲍（Haliotis discus hannai，DD）是主要的养殖种类［1－2］.然而，近些年来，由于种质退化、养殖环境恶化等原因，致使鲍养殖过程中病害频繁爆发，造成了巨大的损失［1－3］.杂交，包括种内杂交和种间杂交，是改良鲍种质的有效方法，通过杂交获得的遗传子代，与亲代相比往往具有生长速度快，存活率高，抗逆性强等优点，因此杂交被广泛应用于鲍的遗传育种［4－5］.西氏鲍（Haliotis gigantea，GG）是分布于日本、韩国的重要的经济种类之一，为暖水种，被认为具有很强的抗病力［6］，骆轩等将从日本引进西氏鲍与皱纹盘鲍进行了杂交，并获得了2个杂交组合：皱纹盘鲍♀×西氏鲍♂（DG），西氏鲍♀×皱纹盘鲍♂（GD）的F1代［3］.杂交后代表现出的杂种优势得到了初步的证明［7］，然而，其杂种优势背后的分子机理尚不明确.热休克蛋白（HSPs）是一类广泛分布于动物、植物和微生物中并高度保守的蛋白，能够被热激等多种胁迫作用诱导表达，HSPs具有多种重要的生物学功能，其中包括提高动物的耐热性，HSP70和HSP90是2类重要的 HSPs［8］.本文以 DD、GG、DG和GD 4种组合为研究对象，以2种HSPs的HSP70和HSP90为分子指标，探讨了4种组合在不同温度条件处理下的2种基因的表达情况，以期为解析皱纹盘鲍与西氏鲍的杂交后代所表现出的杂种优势提供分子依据，并为鲍的杂交遗传育种技术的研究提供生物指示物.1 材料和方法1.1 实验材料实验所用2种自交群体：DD和GG，以及2种杂交群体：DG和GD均取自福建省漳州市漳浦县宏运水产公司，在实验进行前，4个群体的养殖条件一致.对每个群体均选取外形正常，活力良好，且大小相近（壳长均为（70±5）mm）的个体用于实验.将4个群体（每个群体100只）的鲍分别装入做好标签的鲍养殖笼中，等量分入3个500L的已使用高锰酸钾消毒的聚氯乙烯（PVC）桶中进行暂养，选取当时的平均环境水温21℃（11月中旬）作为暂养温度.暂养期间，每个桶均装有3／4体积的砂滤海水，使用气泵进行无间断充气，并使用加热棒（威诺，中国）和控温仪（精创，中国）进行严格控温，使温度一直处于（21±1）℃，每天全量更换预热至21℃的海水，每2天投喂新鲜的江篱菜（Gracilariaconfervoides）.经测定，暂养期间盐度稳定在33，pH稳定在7.8，及时移除暂养期间死亡的鲍，暂养时间为14d.RNA提取试剂TRIpure Isolation Reagent，购自美国Roche公司；cDNA第一条链合成试剂盒PrimeScript RT reagent kit，质粒载体 pMD19－T，PCR试剂（dNTPs，Ex－Taq，6× Loading buffer，DNA Marker），均购自大连Takara 公司；荧光定量试剂盒2×DyNAmo ColorFlash Master Mix购自美国Thermo公司；琼脂糖凝胶回收试剂盒购自中国艾德莱公司；实验所用引物为华大基因合成；感受态DH5α为实验室保存.1.2 对照组取样暂养结束后，对每个群体的鲍进行随机取样（每个群体各10只），迅速解剖并剪取约1g洁净的足部肌肉，置于干净的冻存管中，并迅速丢入液氮中速冻，然后转移至－80℃超低温冰箱中储存，作为未经温度骤变的对照组.1.3 温度应激暂养结束后，对4个群体的鲍进行温度应激，将处于21℃下暂养的4个群体的鲍，分别迅速转移至盛有24，26，28，30℃海水并充分曝气的500LPVC桶中，持续40min，应激结束后，将鲍放回盛有21℃海水的桶中进行恢复，并分别在恢复开始后的1，12，24h时进行取样（每个温度的每个群体6只），取样及保存方式同上述对照组.1.4 RNA的提取和cDNA的合成取出储存在－80℃超低温冰箱中的足肌组织，采用梯度解冻法进行解冻（－80℃→－20℃→4℃），剪取约50mg组织，置于焦碳酸二乙酯（DEPC）水处理过的1.5mL离心管中，剪成约1mm的小块，经震荡研磨仪 MM400（Retsch，德国）研磨后，按TRIpure I－solation Reagent试剂盒说明提取总RNA，然后按PrimeScript RT reagent kit试剂盒的操作说明书反转录合成cDNA第一链，cDNA产物储存在－80℃超低温冰箱中备用.1.5 荧光定量PCR根据在美国国家生物技术信息中心（NCBI）中搜索到的皱纹盘鲍的 HSP70（GI索引号：84181081），HSP90（GI索引号：261826171）基因的保守区序列，并遵循引物设计的原则，使用引物设计软件Beacon Designer 7设计2对定量引物（表1）.测定3对引物的扩增效率：同一模板经1×，5×，25×，125×，625×稀释得到5个模板后，进行定量PCR，以得到的Ct值为纵轴，模板的相对浓度为横轴，绘制标准曲线，由ABI 7500FAST软件给出扩增效率（表1）.PCR产物经过连接、克隆、测序，验证了每对引物在4个群体中都能够扩增得到唯一且序列相同的片段.以上述反转录合成的cDNA为模板，β－actin基因为内参［9］，在ABI 7500FAST荧光定量 PCR仪上进行定量PCR反应.反应体系为：1μL的cDNA模板（10倍稀释），各1μL的上下游引物（10 pmol／L），10μL的2×DyNAmo ColorF lash Master Mix，以及8μL的灭菌超纯水.反应程序设置为：95℃7min，（95 ℃ 20s，60 ℃ 60s）×35，72 ℃ 10 min，每个反应后均检查熔解曲线以确保产物单一性.每个反应均设置3个重复，每个基因的相对表达量＝2（β－actin Ct值－目标基因Ct值）.表1 定量引物序列Tab.1 Primers used in RT－PCR引物名称引物序列（5′－3′）产物大小／bp扩增效率／%rtHSP70FAGGAGGAGATAGAGCGTAT 181102.270 rtHSP70RTCGGTGATGGTCTTCTTGrtHSP90FGTCTTCCCATCGTACTCTT 129 106.524rtHSP90RAAGCAAGGACTCTGTTCA β－actinF GGTATCCTCACCCTCAAGT 158 103.711 β－actinR GGGTCATCTTTTCACGGTTG1.6 数据分析实验得到的数据结果均用平均值±标准差的方式表示，所有数据均用统计分析软件（SPSS）进行统计分析.采用单因素方差分析的方法分析空白实验组中4个群体间的HSP70和HSP90表达差异；采用双因素方差分析的方法分析群体与温度这2个因素对鲍的HSP70个HSP90表达量的影响以及交互影响，并且在方差分析后进行Duncan同源性检验以及S－N－K多重比较，分析同温度下各群体之间的HSP表达差异，或者是相同群体在不同温度下的HSP表达差异.2 结果与分析2.1 对照组中4个群体的HSP70及HSP90表达4个群体：DD，GG以及2种杂交群体：DG，GD的对照组（每个群体各10只）的HSP70及HSP90相对表达量分别见图1（a）、（b），由图中可知，非应激条件下，在4个群体的肌肉组织中均能获得HSP70和HSP90的扩增产物，在4个群体间，GG的表达量最高（p＜0.05），其他3个群体则大致相同.2.2 应激组中4个群体的HSP70表达经过不同温度的应激后，4个群体中的HSP70表达情况见图2，从图中可以看出，4个群体经温度应激后，在恢复期的1h分别出现不同程度的HSP70的上调表达，而在12和24h时恢复正常值.在1h时（图2（a）），双因素方差分析表明，温度和群体对HSP70的表达均有极显著影响（表2）（p＜0.001），在24℃时，4个群体的HSP70水平没有明显的差异；在26℃时，DD的HSP70表达均显著高于GG，DG，GD 3个群体（p＜0.05）；到达28℃时，DG的HSP70表达均显著高于其他3个群体（p＜0.05）；而在30℃时，DG的HSP70表达水平最高，GG和GD则居中，DD的表达量最低（Duncan同源性检验，DG属于子集1，GG和GD属于子集2，DD属于子集3）（图2（a））.从图2（a）中可以得知，各个群体对温度应激的反应也存在差异，DD的HSP70水平随温度上升表现出先上升后下降的趋势，在28℃时候达到最高；而GG，DG，GD的HSP70水平则随温度上升而上升.在恢复期的12和24h，4个群体的HSP70水平均降至正常值. 图1 对照组中4个群体的HSP70及HSP90表达Fig.1 Expression of HSP70and HSP90in four groups at ambient temperature图2 在不同温度应激后的恢复期中4个群体的HSP70表达Fig.2 Expressions of HSP70in four groups during the recovery phase after heat shock表2 采用双因素方差分析法得到的应激后1h时温度及群体对鲍的HSP70和HSP90表达的影响Tab.2 Summary of two－way ANOVA results assessingthe effect of temperature，groups on HSP70and HSP90expression in abalone注：＊＊＊表示极显著（p＜0.001）.类型温度群体温度×群体HSP70＊＊＊＊＊＊＊＊＊HSP90＊＊＊＊＊＊＊＊＊2.3 应激组中4个群体的HSP90表达经过不同温度的应激后，4个群体中的HSP90表达情况见图3.从图中可以看出，4个群体经温度应激后的HSP90表达趋势与HSP70相似：在恢复期的1h分别出现不同程度的HSP90的上调表达，而在12和24h时恢复正常值.在1h时（图3（a）），双因素方差分析表明，温度和群体对HSP90的表达均有显著影响（表2）：在24℃时，4个群体的HSP90水平没有明显的差异；在26℃时，DD的HSP90表达均显著高于GG，DG，GD 3个群体（p＜0.05）；到达28℃时，DG 的HSP90表达均显著高于其他3个群体（p＜0.05）；而在30℃时，HSP90水平为：DG，GG，GD的区别不显著，但这三者均显著高于DD（Duncan同源性检验，DG，GG，GD属于子集1，而DD属于子集2）（图3（a））.从图3（a）中可以得知，各个群体对温度应激的反应模式各不相同：DD的HSP90水平随温度上升表现出先上升后下降的趋势，在28℃时候达到最高；而GG，DG，GD的HSP90水平则随温度上升而上升.在恢复期的12和24h，4个群体的HSP90水平均降至正常值.3 讨论水温是影响鲍生长发育的最主要的环境因子之一［10］.在一定范围内当温度升高时，鲍体内的能量代谢加速，各项生理活动加强；当温度超过一定的限度时，鲍的代谢和生理活动又会相应地减弱，甚至出现不能耐受高温而死亡的情况［7，11］.HSPs是一类广泛分布于各类生物中的高度保守的蛋白，常被作为生物响应环境胁迫（温度、盐度、重金属等等）的指示因子［12－13］，HSP70 和HSP90 是 2 类重要的 HSPs 成员［14－15］，在鲍中，它们经常随温度的变化而出现相应的表达量的变化［12，16－17］.本研究中我们观察到类似的现象：在皱纹盘鲍、西氏鲍及它们的2种杂交组合中，随着温度在一定范围内的升高，2种HSPs的HSP70、HSP90的表达都出现了显著的上调，因为HSPs的功能是通过促进正常蛋白的折叠、促进非正常蛋白的降解等作用来维持细胞内稳态［12，17－19］，因此，本研究中出现HSPs的上调表达，应该是机体为了缓解高温带来的代谢压力而做出的反应.另外，在本研究中，我们发现HSPs在4个组合的鲍中均出现了时序表达的现象：在转录水平上，HSP70和HSP90在应激后的1h出现上调表达，而在12和24h时恢复正常值.这个现象与之前的很多研究是一致的［12，17］，尽管随实验设置及实验物种的不同，HSPs表达的时序性不尽相同，但基本上都表现出先上升，后恢复的趋势.图3 在不同温度应激后的恢复期中4个群体的HSP90表达Fig.3 Expressions of HSP90in four groups during the recovery phase after heat shock杂交是广泛应用于鲍的人工养殖中的一种有效的改良种质的育种策略［5］，通过杂交获得的后代，往往具有生长快，存活率高，耐高温和疾病能力强等优点［20－21］，杂交子代的某些表现型通常优于双亲（超亲优势），或是介于双亲之间（中亲优势）［5，20－22］.在本研究中，我们观察到4个群体的HSPs表达趋势的显著不同.首先，在非应激条件下，GG的HSP70和HSP90表达量最高，而其他3个群体的表达量大致相同，这可能由于GG是温水性种类［6］，在进化过程中，由于长期处于水温较高的环境中，因此体内需要较高水平的HSPs来缓解环境带来的热压力.在温度应激下，4个群体也表现出不同的HSPs表达趋势，在24℃下，4个群体的HSPs表达量没有显著的区别，说明24℃对于4个群体来说是比较适合的温度，构不成胁迫；到达26℃时，DD的HSP70和HSP90表达量出现了上调，显著高于其他3个群体，说明26℃对于DD已经是一个较高的温度，可以诱导其体内的一些应激反应，而对于其他3个群体来说尚构不成胁迫；在相对高温的情况下（28及30℃），DD的HSPs水平开始下调，而其他3个群体的HSPs水平则出现上升的趋势，说明30℃已经威胁到DD活力，使其生理活动效率降低，从而阻碍了HSPs的合成.DG在28和30℃时表现出最高的HSP70水平，而在30℃时，GD的HSP70和HSP90水平均介于GG和DD之间，由于每种鲍对于温度的耐受范围都不相同，DD和GG分属于冷水性种和暖水性种［21］，因此推测DG和GD已经继承了GG的耐高温特性，相对于DD表现出杂种优势或中亲优势.在Cheng等［19］的研究中，同样观察到在高温下，杂交群体比自交群体表现出较高HSPs水平的现象，说明杂交确实能遗传一些耐高温的特性.总的来说，4个群体在面对温度胁迫时，只有DD的HSPs水平表现出先上升，后下降的趋势，而其他3个群体的HSPs水平均随着温度的上升而上升，由于高水平的HSPs能够提高鲍应对不利环境因子对细胞内稳态的影响的能力，因此我们推测，在实际的人工养殖环境中，GG，DG，GD应对高温的能力要显著高于DD，杂交是一种行之有效的提高种质的鲍遗传育种策略.【相关文献】［1］柯才焕.我国鲍鱼养殖产业现状与展望［J］.中国水产，2013（1）：27－30.［2］王进可，严正凛.鲍养殖现状及发展趋势［J］.水产科学，2012，31（12）：749－753. ［3］骆轩，游伟伟，柯才焕，等.西氏鲍与盘鲍杂交育苗的初步研究［J］.厦门大学学报：自然科学版，2006，45（5）：602－605.［4］Elliott N G.Genetic improvement programmes in abalone：what is the future［J］.Aquaculture Research，2000，31（1）：51－59.［5］de la Cruz F L，Gallardo－Escárate C.Intraspecies and interspecies hybrids in Haliotis：natural and experimental evidence and its impact on abalone aquaculture［J］.Reviews in Aquaculture，2011，3（2）：74－99.［6］高绪生.鲍鱼［M］.沈阳：辽宁科学技术出版社，2000：10.［7］李宇亮.皱纹盘鲍与西氏鲍杂交F1代抗性相关的生理生化特性研究［D］.厦门：厦门大学，2010.［8］程培周.皱纹盘鲍热休克蛋白70基因的克隆、表达及应用［D］.青岛：中国科学院海洋研究所，2006.［9］Li J，He Q，Sun H，et al.Acclimation－dependent expression of heat shock protein 70in Pacific abalone（Haliotis discus hannai Ino）and its acute response to thermal exposure［J］.Chinese Journal of Oceanology and Limnology，2012，30（1）：146－151. ［10］游伟伟，林焕阳，骆轩，等.温度对杂色鲍不同群体生长率与存活率的影响［J］.台湾海峡，2012，30（4）：583－588.［11］聂宗庆，王素平.鲍养殖实用技术［M］.北京：中国农业出版社，2000：68.［12］Cheng P，Liu X，Zhang G，et al.Cloning and expression analysis of a HSP70gene from Pacific abalone（Haliotis discus hannai）［J］.Fish ＆ 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［18］Snyder M，Girvetz E，Mulder E.Induction of marine mollusc stress proteins by chemical or physical stress［J］.Archives of Environmental Contamination and Toxicology，2001，41（1）：22－29.［19］Cheng P，Liu X，Zhang G，et al.Heat－shock protein70 gene expression in four hatchery Pacific Abalone Haliotis discus hannai Ino populations using for marker－assisted selection［J］.Aquaculture Research，2006，37（13）：1290－1296.［20］Bartley D M，Rana K，Immink A J.The use of inter－specific hybrids in aquaculture and fisheries［J］.Reviews in Fish Biology and Fisheries，2000，10（3）：325－337. ［21］Guo e and exchange of genetic resources in molluscan aquaculture［J］.Reviews in Aquaculture，2009，1（3／4）：251－259.［22］Hulata G.Genetic manipulations in aquaculture：a review of stock improvement by classical and modern technologies［J］.Genetica，2001，111（1／2）：155－173.。
皱纹盘鲍亲鲍室内升温促熟培育报告：鲍鱼课题组
皱纹盘鲍亲鲍室内升温促熟培育报告：鲍鱼课题组
佚名
【期刊名称】《海洋水产科技》
【年(卷),期】1996(000)002
【摘要】三年的亲鲍升温促熟培养结果表明，经升温促熟后的亲鲍产卵时间可以
比自然海区提前一个月左右，培育成活率达９０５。
同时，当促熟亲鲍升温鲍升温有效积温达６００℃左右，总有效积温达８００℃左右时进行诱导产卵，可以获得雄性１００％，雌性９０％左右的诱导率。
【总页数】4页(P15-18)
【正文语种】中文
【中图分类】S968.325
【相关文献】
1.南方皱纹盘鲍亲鲍促熟技术总结 [J], 周小文
2.皱纹盘鲍（Haliotis discus hannai Ino）亲鲍室内人工促熟培育的初步试验 [J], 刘永襄;高绪生;刘永峰
3.关于鲍鱼的养殖技术之二皱纹盘鲍稚鲍剥离后大量死亡的原因及对策的研究 [J], 张起麟;李俊;袁焰芳;宋钰;李洪文;刘光穆
4.皱纹盘鲍养殖技术——皱纹盘鲍网箱养殖技术 [J], 王路平
5.皱纹盘鲍养殖技术——皱纹盘鲍网箱养殖技术 [J], 王路平
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皱纹盘鲍表型性状与肌肉重的相关与通径分析
皱纹盘鲍表型性状与肌肉重的相关与通径分析刘贤德;张国范【期刊名称】《海洋科学》【年(卷),期】2010(034)004【摘要】选取日本岩手县×中国大连獐子岛的一个杂交家系, 随机测定132尾三年龄皱纹盘鲍(Haliotis discus hannai Ino)的壳长(x1)、壳宽(x2)、总重(x3)、壳重(x4)、软体部重(x5)及肌肉重(y) 6个指标, 计算各性状间的相关系数, 采用通径分析方法计算以表型性状为自变量, 肌肉重为依变量的通径系数、决定系数, 对各性状的影响大小进行剖分, 明确影响皱纹盘鲍肌肉重的主要表型性状, 为皱纹盘鲍选育提供理论依据和理想的测度指标.结果表明: 所测各表型性状与肌肉重之间的相关系数均达到极显著水平(P<0.01); 软体部重对肌肉重的直接影响最大(为0.512), 其次为总重, 对肌肉重的直接影响为0.484, 二者差异不显著(P＞0.05), 其他性状对肌肉重的直接影响均不大.剔除通径系数检验不显著的自变量, 利用逐步回归的方法, 建立以肌肉重为依变量的最优多元线性回归方程为:(y)=-0.381+0.239x3+0.342x5, 其调整决定系数为0.989, 表明所选性状是影响肌肉重的主要性状.【总页数】5页(P40-44)【作者】刘贤德;张国范【作者单位】中国科学院,海洋研究所,山东青岛,266071;福建省高校水产科学技术与食品安全省重点实验室,集美大学,水产学院,福建,厦门,361021;中国科学院,海洋研究所,山东,青岛,266071【正文语种】中文【中图分类】S93;Q-332【相关文献】1.皱纹盘鲍（Haliotis discus hannai Ino）数量性状的相关性与通径分析 [J], 丁君;许通;常亚青;曹学顺;张伟杰;隋国斌2.皱纹盘鲍（Haliotis discus hannai Ino）数量性状的相关性与通径分析 [J], 丁君;许通;常亚青;曹学顺;张伟杰;隋国斌;3.速冻皱纹盘鲍的肌肉营养、蛋白组成及显微结构分析 [J], 尹蕾丽;周纷;郑尧;姚林燕;王锡昌4.皱纹盘鲍(Haliotis discus hannai Ino)肌肉酶解产物制备及其免疫活性研究 [J], 任鼎鼎;黄梦怡;郑惠娜;曹文红;林海生;秦小明;章超桦5.皱纹盘鲍(Haliotis discus hannai)不同部位肌肉的蛋白分布特性 [J], 尹蕾丽;周纷;姚林燕;王锡昌因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
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第37卷 第4期2006年7月海 洋 与 湖 沼OCEANOLOGI A ET L I M NOLOGI A SI N I CAVol 137,No 14July,2006皱纹盘鲍(H a liotis discus hanna i I no)胚胎RNA 分离和c D NA 文库构建3刘 晓 赵 敏 高其康 张国范(中国科学院海洋研究所 青岛 266071)(中国科学院海洋研究所 青岛 266071;中国科学院研究生院 北京 100039)(浙江大学分析测试中心 杭州 310029) 3国家自然科学基金项目,30271018号;国家863计划项目,2004AA626070号;青岛市自然科学基金项目,03222JZP 29号资助。
刘 晓,博士,研究员,E 2mail:liuxiao@m s .qdi o .ac .cn收稿日期:2005202216,收修改稿日期:2006201222提要 从皱纹盘鲍胚胎样本中分离RNA 并构建了c DNA 文库。
分别收集孵化8、10和12h 的皱纹盘鲍胚胎,用抽滤除菌的海水反复悬浮胚胎,将这3个发育阶段的胚胎样本等量混合后用T R I Z OL 试剂提取总RNA,将提取物用酚2氯仿2异戊醇再抽提2次,分离获得高质量的总RNA 。
从总RNA 中分离mRNA,构建了皱纹盘鲍混合胚胎的c DNA 文库,未扩增胚胎文库的滴度为510×106pfu /m l,重组率为94112%,插入片段均大于400bp,7016%克隆的插入片段分布在1000—1500bp 之间,扩增后的文库滴度为3106×109pfu /m l 。
关键词 皱纹盘鲍,胚胎,c DNA 文库,基因表达中图分类号 Q132 皱纹盘鲍(Haliotis discus hannai I no )自然分布于北太平洋海区。
从上世纪80年代中期实现人工育苗以来,我国的皱纹盘鲍养殖业发展较快,现已成为重要的养殖贝类。
但目前国内外对于皱纹盘鲍的功能基因研究仍很缺乏,目前在gene bank 中公布的皱纹盘鲍核酸序列不到200条,其中多数是微卫星序列和核糖体RNA 序列。
已发布的重要功能基因有:褐藻胶裂解酶基因(Shi m izu et al ,2003)、纤维素酶基因(Suzuki et a l ,2003)、精子细胞溶素mRNA 序列(Lee et al ,1995)、卵黄膜细胞溶素受体蛋白基因(Galindo et al ,2003)、细胞色素氧化酶亚基I 编码基因(Metz et al ,1998)等。
对于功能基因尚了解很少的皱纹盘鲍来说,通过构建全长c DNA 文库进行EST 序列分析,或结合使用表达谱基因芯片等手段是分析和克隆特殊时空条件下表达的功能基因的一种可行策略。
胚胎和幼虫是贝类生活史中两个非常重要的发育阶段,在该两个阶段中分化形成了除生殖腺外的几乎所有组织和器官,因此启动多种重要器官分化的基因可能在胚胎和幼虫的不同阶段表达。
但到目前为止,有关皱纹盘鲍胚胎和幼虫阶段的基因表达研究均未见报道。
与陆生生物不同,贝类的胚胎和幼虫生活在自然水环境中;与成体阶段的材料相比,皱纹盘鲍的胚胎和幼虫样本代谢更为旺盛。
针对上述特点,作者在样本收集、RNA 分离等过程中均进行了改进,并成功构建了皱纹盘鲍不同发育阶段的胚胎c DNA 文库与幼虫c DNA 文库。
本文中作者将以皱纹盘鲍的后期胚胎c DNA 文库(Haliotis discus hannai e mbry o library,简称HD 2e mb 文库)为例报告胚胎样本收集、RNA 分离等技术。
本文中所报道的方法可为水生生物早期发育阶段的大分子分离提供技术借鉴,所构建的全胚胎c DNA 文库将为皱纹盘鲍胚胎发育过程中的基因表达及与胚胎分化相关的重要功能基因研究奠定基础。
1 材料与方法111 实验材料本研究所用实验材料皱纹盘鲍(Ha liotis dis 2356 海 洋 与 湖 沼37卷cus hannai I no)亲本为采自日本岩手县海区的野生个体,体长9—11c m。
112 试剂总RNA提取采用I nvitr ogen公司生产的TR I2 Z OL试剂;mRNA分离使用Pr o mega公司的mRNA is olati on syste m I V试剂盒;全长c DNA文库构建采用Cl ontech公司的S MART c DNA L ibrary con2 structi on kit试剂盒。
113 皱纹盘鲍胚胎的培育皱纹盘鲍的胚胎培育在青岛金瀛海洋科技发展有限公司鲍鱼育苗室进行。
在常规条件下进行催产:种鲍在20℃阴干30m in后,将每个种鲍单独置于1个20L的洁净容器中,加入10L预热至23℃并经照射剂量为300mW/(h・L)的紫外线预处理海水,每30m in更换1次新鲜的紫外线照射海水,直至精子或卵子排出。
在显微镜下观察每个亲鲍所排放的配子,选取3个雄鲍的精子预先等量混合后对预先等量混合的3个雌鲍的卵子进行人工授精,10m in后用20℃新鲜海水洗卵。
此后每40m in洗卵1次,直到担轮幼虫开始上浮。
所用海水经严格净化过滤。
114 皱纹盘鲍胚胎样本的收集和保存在受精后8、10、12h分别收集皱纹盘鲍的胚胎,将胚胎转移到500m l无菌烧杯中,静置使胚胎自然沉降后尽可能除去海水,然后用100m l无菌的新鲜海水重新悬浮胚胎,重复5次。
将胚胎收集到300目尼龙筛绢网上,用500m l无菌海水冲洗,然后用预先高压灭菌处理的滤纸尽可能吸去海水。
上述操作在20℃环境下进行,海水预先平衡至20℃。
所用烧杯等玻璃器皿均经高压蒸汽灭菌,筛绢网等经无菌蒸馏水配制的70%乙醇浸泡处理,海水经0122μm微孔滤膜抽滤去除异物。
将每发育阶段各015g左右的胚胎样本分别转移到15m l无菌离心管中,按照1∶20的比例加入预冷至0℃的TR I Z OL试剂,反复颠倒离心管使胚胎细胞裂解并较好地分散于TR I Z OL试剂中,于液氮中保存。
115 胚胎细胞总RNA提取和m RNA分离总RNA的提取参照T R I Z OL试剂盒提供的方法并做如下改进:将低温保存的样本于液氮和70℃水浴中冻融2次,置于冰中迅速冷却;从3个发育阶段的冷冻样本中各取5m l,混合后再加入TR I Z OL试剂5m l并充分匀浆;匀浆液转移至50m l离心管中,加入氯仿4m l,充分振荡,静置分层后于4℃、12000r/m in离心15m in,取水相;用等体积经酸平衡的酚:氯仿:异戊醇(25∶24∶1)再重复抽提2次,取水相,加入等体积异丙醇小心混匀,-20℃过夜;次日于12000r/m in离心25m in,用70%乙醇洗涤RNA沉淀,12000r/m in离心5m in,沉淀于室温干燥、无RNA酶的水溶解后用于mRNA分离。
提取物通过紫外吸收光谱法检测后再由115%的甲醛变性凝胶电泳进行检测。
本研究中应用磁珠法分离mRNA,利用与生物素耦联的oligo(dT)与带poly A的mRNA结合,再采用抗生物素包被的磁珠吸附mRNA,如此可以一步法将具poly A的mRNA从总RNA中分离出来。
操作过程按mRNA is olati on syste m I V试剂盒说明书进行。
116 胚胎细胞c D NA合成与克隆取3μl(约1μg)的mRNA作模板,用引物1 (5π2AAG C AGTGGT AT C AACG CAG ATGG CCATT AC2 GGCCGGG23π)和引物2(5π2ATT CT AG AGG CCG AG2 G CGG CCG ACATG2d(T)30N-1N23π)由Po werScri p t T M 逆转录酶催化合成第一链c DNA;再以2μl第一链c DNA为模板,用引物2和引物3(5π2AAG C AGTG2 GT AT C AACG C AG AGT23π)在PT C2225型PCR仪上进行扩增,合成第二链c DNA。
PCR条件: 95℃,5s;68℃,6m in,共24循环。
扩增产物经过S fi I酶切、分级分离后,取115μl的c DNA与1μl 的λTri p lEx2载体于16℃连接过夜,在连接产物中加入25μl的包装蛋白进行体外包装,所得包装产物即为c DNA的未扩增文库。
按未扩增文库的滴度,在LB平板上将未扩增文库在X L12blue宿主菌中进行噬菌体文库扩增,并用噬菌体缓冲液收集扩增的噬菌体,得到扩增文库。
117 c D NA文库滴度和重组率测定从c DNA未扩增文库和扩增文库中各取1μl 噬菌体,分别用噬菌体缓冲液稀释10、100、1000倍后转染宿主菌大肠杆菌XL12blue,铺于含I PTG 和X2gal的平板上,培养过夜后计算噬菌斑的个数及蓝白斑个数,按下列公式计算未扩增文库和扩增文库的滴度(金冬雁等,1992):文库滴度(pfu/m l)=(噬菌斑数×稀释倍数)/转染的噬菌体体积。
118 c D NA插入片段的PCR分析从未扩增文库的LB平板上随机挑取17个克隆,以M13的引物(5π2CT CCG AG AT CTGG ACG AG CT2 3π和5π2T AAT ACG ACT C ACT AT AGGG23π)对每个克4期刘 晓等:皱纹盘鲍(Haliotis discus hannai I no )胚胎RNA 分离和c DNA 文库构建357 隆进行PCR 扩增,根据扩增产物的有或无及PCR产物的片断大小判断文库的重组率及c DNA 插入片段的长度、分布等整体情况。
2 结果211 皱纹盘鲍胚胎总RNA 和mRNA 的分离按T R I Z OL 试剂提供的方法从皱纹盘鲍胚胎样本中提取总RNA,用T R I Z OL 试剂抽提1次得到的总RNA 经紫外分光光度计检测,OD 260/OD 280的比值仅为1145,表明总RNA 中仍含有较多的蛋白质,用酚2氯仿2异戊醇试剂再进行2步抽提后,OD 260/OD 280的比值分别达到1183和2101。
115%的琼脂糖甲醛变性电泳结果证实,经过酚2氯仿2异戊醇试剂再次抽提后,总RNA 的质量明显提高,带型清晰,在电泳图谱上出现28S r RNA 、18S r RNA 和5S r RNA 等3条带(图1)。
图1 皱纹盘鲍胚胎样本总RNA 的甲醛变性凝胶电泳图Fig 11 For maldehyde denaturing gel electr ophoreticgraph of Pacific abal one e mbryos πt otal RNA 1.T R I Z OL 试剂提取1次的总RNA;2.酚2氯仿2异戊醇复抽1次的总RNA;3.酚2氯仿2异戊醇复抽2次的总RNA从上述总RNA 中分离获得的mRNA 经反转录成一链c DNA ,然后用长片段PCR 方法扩增获得双链c DNA 。