慢病毒载体构建步骤研究

一、简介 慢病毒（Lentivirus）载体是以HIV-1（人类免疫缺陷I型病毒）为基础发展起来的基因治疗载体。区别一般的逆转录病毒载体，它对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力。慢病毒载体的研究发展得很快，研究的也非常深入。该载体可以将外源基因有效地整合到宿主染色体上，从而达到持久性表达。 目前慢病毒也被广泛地应用于表达RNAi的研究中。由于有些类型细胞脂质体转染效果差，转移到细胞内的siRNA半衰期短，体外合成siRNA对基因表达的抑制作用通常是短暂的，因而使其应用受到较大的限制。采用事先在体外构建能够表达siRNA的载体, 然后转移到细胞内转录siRNA的策略，不但使脂质体有效转染的细胞种类增加，而且对基因表达抑制效果也不逊色于体外合成siRNA，在长期稳定表达载体的细胞中，甚至可以发挥长期阻断基因表达的作用。慢病毒载体能够产生表达shRNA的高滴度的慢病毒，在周期性和非周期性细胞、干细胞、受精卵以及分化的后代细胞中表达shRNA，实现在多种类型的细胞和转基因小鼠中特异而稳定的基因表达的功能性沉默，为在原代的人和动物细胞组织中快速而高效地研究基因功能，以及产生特定基因表达降低的动物提供了可能性。慢病毒作为siRNA的携带者，不但具备特异性地使基因表达沉默的能力，而且充分发挥了慢病毒载体自身所具备的优势，为基因功能的研究提供了更强有力的工具。 在所构建的siRNA表达载体中，是由RNA聚合酶Ⅲ启动子来指导RNA合成的，这是因为RNA聚合酶Ⅲ有明确的起始和终止序列，而且合成的RNA不会带poly A尾。当RNA聚合酶Ⅲ遇到连续4个或5个T时，它指导的转录就会停止，在转录产物3’端形成1~4个U。U6和H1 RNA启动子是两种RNA聚合酶Ⅲ依赖的启动子，其特点是启动子自身元素均位于转录区的上游，适合于表达～21ntRNA和～50ntRNA茎环结构（stem loop）。在siRNA表达载体中，构成siRNA的正义与反义链，可由各自的启动子分别转录,然后两条链互补结合形成siRNA；也可由载体直接表达小发卡状RNA(small hairpin RNA, shRNA), 载体包含位于RNA聚合酶Ⅲ启动子和4～5T转录终止位点之间的茎环结构序列，转录后即可折叠成具有1~4 个U 3 ’ 突出端的茎环结构，在细胞内进一步加工成siRNA。构建载体前通常要通过合成siRNA的方法，寻找高效的siRNA，然后从中挑选符合载体要求的序列，将其引入siRNA表达载体（筛选）。 二、实验流程（大致的简单过程） 慢病毒表达载体包含了包装、转染、稳定整合所需要的遗传信息。慢病毒包装质粒可提供所有的转录并包装RNA 到重组的假病毒载体所需要的所有辅助蛋白。为产生高滴度的病毒颗粒，需要利用表达载体(自己构建)和包装质粒（购入）同时共转染细胞，在293T细胞(购入)中进行病毒的包装，包装好的假病毒颗粒分泌到细胞外的培养基中，离心取得上清液后，可以直接用于宿主细胞的感染，目的基因进入到宿主细胞之后，经过反转录，整合到基因组，从而高水平的表达效应分子。  大致的实验流程： 1. 根据目的基因相关信息（序列，序列号等），构建含有外源基因或siRNA的重组载体；（即质粒构建，已构建好，质粒可以永久保存） 2. 对于测序正确的重组质粒，提取和纯化高质量的不含内毒素的重组质粒； 3. 使用高效重组载体和病毒包装质粒（购入）共转染293T 细胞[1]，进行病毒包装和生产，收集病毒液； 4. 浓缩、纯化病毒液； 5. 用高质量的病毒液感染细胞(293T细胞)； 6. 通过定量PCR精确测定病毒滴度（高精确滴定方法）和Western 分析实验结果； 7. 用高质量的病毒液感染宿主细胞；检测基因功能或者siRNA的沉默效率以及使用药物进行稳定转染细胞株的筛选，通常状况下，筛选的细胞克隆株具有长期的表达稳定性。病毒液足够用于一般的动物活体实验。 三、重组质粒构建流程 1.基因的获得: shRNA寡核苷酸序列的设计和合成(将正确序列克隆入载体中，退火形成双链，PCR扩增) 2.回收 A． 酶切产物的胶回收：一般做50-100ul 体系，然后跑电泳回收，回收量一般为30ul。 B． PCR扩增产物的胶回收 原理：首先利用低熔点琼脂糖凝胶电泳DNA片段，分离目的条带DNA，然后紫外光下切割含目的DNA条带的胶块，利用胶回收试剂盒回收纯化DNA片段。试剂盒的胶回收柱采用特殊硅基质材料在一定的高盐缓冲系统下高效、专一地吸附DNA、RNA的原理，配备设计独特的离心吸附柱式结构，使用常规台式高速离心机，在几分钟之内即可以高效回收核酸片段。 实验仪器：1、琼脂糖凝胶电泳系统2、紫外观察分析仪3、离心机4、单面刀片5、恒温水浴锅 试剂 ：1、DNA回收试剂盒[2] 2、50×TAE[3]（电泳缓冲液Tris-乙酸）3、ddH2O 4、琼脂糖凝胶[4] 步骤： 1）使用TAE缓冲液制作琼脂糖凝胶，然后对目的DNA进行琼脂糖凝胶电泳（分离DNA作用）[5]。 2）在紫外灯下切分含DNA的琼脂糖块，尽可能除去多余的琼脂糖。放入1.5ml离心管中。 3）按每100mg琼脂糖加入300—600μl 溶胶液[6]的比例加入溶胶液（本实验加500ul），置55℃水浴10分钟，使琼脂糖块完全溶化，期间每2分钟颠例混匀一次促溶。 4）将溶化后的琼脂糖液移入吸附柱，12000rpm 室温离心1分钟，倒掉收集管中的液体。再将吸附柱放入同一个收集管中。 5）在吸附柱中加入500uI漂洗液，室温静置1分钟后， 12000rpm 室温离心30秒，倒掉收集管中的液体，将吸附柱放入同一个收集管中。 6）再在吸附柱中加入500uI漂洗液， 12000rpm 室温离心15秒，倒掉收集管中的液体，将吸附柱放入同一个收集管中。 7） 12000rpm 室温空离心1分钟。 8）将吸附柱放入一个干净的1.5ml的离心管中，在吸附膜中央加入30ul洗脱缓冲液，室温静置2分钟后， 12000rpm 室温离心1分钟（为提高回收效率可再洗脱一次），将1.5ml离心管(DNA)贮存于-20℃。 9）琼脂糖凝胶电泳（鉴定作用）检测回收产物。 注意事项： 1）切胶时应快速操作，在紫外灯下时间长容易伤害到眼睛； 2）溴化乙锭染色后的DNA易受紫外光破坏，故尽量放置于暗室，切带时应使用长波长紫外灯，切胶时间尽量短。 3）胶块一定要充分融化，否则将会严重影响DNA的回收率。 4） 把洗脱液加热，使用时有利于提高洗脱液效率 3．连接 器材：旋涡混合器，微量移液取样器，移液器吸头，1.5ml 微量离心管，双面离心管架，台式离心机，干式恒温气浴。 试剂：T 载体，T4 DNA 连接酶，连接酶缓冲液，无菌dd Water 。 操作步骤 ：PCR产物（已纯化回收）与T载体直接连接： （1） 事先将干式恒温仪（或冰盒里的水）温度设定在14~16°C。 （2） 取4个灭菌的200ul微量离心管，加入：（需要调整）4ml 目的基因 ；1ml T载体 ；0.5ml T4 DNA连接酶（TAKARA, 350U/ul）；1ml 连接酶缓冲液10 x buffer ；3.5 ml dd Water ，总量10ml 体系。 （3）上述混合液轻轻震荡后再短暂离心，然后置于14°C干式恒温仪（或14°C水中）中保温过夜（12-16h）。 （4） 连接后的产物可以立即用来转化感受态细胞或置4°C冰箱备用。 4. 转化 原理：目前，感受态细胞的制备常用冰预冷的CaCl2处理细菌的方法制备，即用低渗CaCl2溶液在低温（0℃）时处理快速生长的细菌，从而获得感受态细菌。此时细菌膨胀成球形，外源DNA分子在此条件下易形成抗DNA酶的羟基－钙磷酸复合物粘附在细菌表面，通过热激作用促进细胞对DNA的吸收。在一定条件下，经过连接后的ＤＮＡ片段与感受态细胞混合保温，可以进入感受态细胞。进入感受态细胞的ＤＮＡ分子通过复制、表达，实现遗传信息的转移，使受体细胞出现新的遗传性状。将经过转化后的细胞在选择性培养基中培养，即可筛选出转化体，即带有异源DNA分子的受体细胞。

目的：连接上目的基因的质粒转化大肠杆菌是为了让目的基因在大肠杆菌里扩增，然

后提取质粒。 器材：恒温摇床,电热恒温培养箱,台式高速离心机,无菌工作台,低温冰箱, 恒温水浴锅, 制冰机, 分光光度计,微量移液枪。 试剂：1.LB固体和液体培养基[7] 2.含特定抗生素的LB固体培养基3.100mM CaCl2溶液。4.待转化质粒 大肠杆菌感受态细胞制备步骤： 1）从大肠杆菌平板上挑取一个单菌落于3mlLB液体培养基 ，37℃振荡培养过夜（12h左右），直至对数生长期。 2）取0.4ml菌液转接到40mlLB液体培养基中，37℃振荡培养2~3h，至OD600值达到0.5-0.6之间。 3）菌液转移到50ml离心管中，冰上放置10min。 4）4℃离心10min（4000r/min） 5）倒出培养液，将管口倒置以便培养液流尽 6）用冰浴的0.1mol/L氯化钙10ml悬浮细胞，立即冰浴30min 7）4℃离心10min（4000r/min） 8）倒出上清液，用冰浴的0.1mol/L氯化钙2ml悬浮细胞（冰上放置） 9）分装细胞，200ul一份，4℃保存。 暂且不用的贮存于-70℃可保存半年。 取其中一份进行转化。 质粒DNA的转化 1）取200ul新鲜制备的感受态细胞，加入质粒DNA2ul混匀，冰浴30min 2）离心管放到42℃水浴锅中保温90s（90s一定要精确，不要摇动试管） 3）将试管迅速转移到冰浴，冷却1-2min 4）每管加800u l LB液体培养基，37℃培养1h 5）取适当体积（100ul）的复苏细胞，涂布在含有适当抗生素的LB固体培养基上，用灭过菌的玻璃棒涂布均匀，室温正置30min 6）倒置平皿37℃，12~16h，出现菌落 为了提高转化效率, 实验中要考虑以下几个重要因素： 1. 细胞生长状态和密度: 细胞生长密度以刚进入对数生长期时为好，可通过监测培养液的OD600 来控制。 2. 质粒的质量和浓度: 用于转化的质粒DNA应主要是超螺旋态DNA(cccDNA)。一般情况下,DNA溶液的体积不应超过感受态细胞体积的5％。 3. 试剂的质量: 所用的试剂,如CaCl2 等均需是最高纯度的(GR.或AR.),并用超纯水配制,最好分装保存于干燥的冷暗处。