慢病毒载体,稳定表达
慢病毒感染问题全解答
A&Q|慢病毒感染问题全解答慢病毒（Lentivirus）载体是以HIV-1（人类免疫缺陷I型病毒）为基础发展起来的基因治疗载体。
它可以将外源基因或外源的shRNA有效地整合到宿主染色体上，可有效地感染分裂细胞和非分裂细胞，所以慢病毒载体能大大提高目的基因或目的shRNA的转导效率，能够方便快捷地实现基因的长期、稳定表达。
在使用慢病毒的过程中，可能因病毒的浓度、细胞的状态、操作规范和时间把握等出现各种问题，今天小恒就来和大家聊一聊在其中可能会遇到的问题，以及如何解决这些问题~1.对照病毒或目的病毒感染细胞以后，细胞形态发生改变或者细胞死亡，是否说明病毒有毒性?首先，确定病毒是否有支原体或细菌污染；其次，确定病毒感染MOI是否过高，梯度稀释后感染，寻找合适的MOI。
同时考虑目的细胞可能比较敏感，更换其它细胞感染确定病毒是否有问题。
病毒对某些敏感细胞有毒性可能是不可避免的。
如果以上都排除后细胞状态仍然不好，尝试增加血清含量，观察细胞状态是否好转2.病毒感染目的细胞效率低?和以下几个因素有关◆病毒活性解冻病毒一定要在冰上进行，尽量避免反复冻融，-80℃保存半年以上需要重新测滴度；◆目的细胞最好预实验测试过，看病毒载体是否合适感染目的细胞。
一些难感染的细胞，如贴壁不好的细胞，原代细胞等，或者体内动物实验适合用腺病毒或AAV；◆当然也和MOI值、感染时间以及是否加入polybrene等因素有关，可在实验中进行实当的摸索和调整，提升慢病毒的感染效率3. 如何确定向细胞中加入慢病毒的最佳时间？慢病毒感染细胞后2~3天可观察慢病毒携带的基因荧光表达情况，在细胞汇合度30~50%且细胞状态良好时加入慢病毒，确保在感染后2天时细胞增长达到70%左右的汇合度。
3.用于慢病毒感染的细胞接种量是多少？根据细胞增殖的速度调整细胞接种量，以保证在感染后3天左右细胞刚好快长满培养皿底部为宜。
针对大部分细胞系：传代周期在2~3天，感染时细胞铺板的密度保持在30~50%左右针对某些原代细胞：由于细胞增长缓慢，可以在接种时提高汇合度到70~80%左右针对非分裂细胞：如神经元细胞，接种后不再增殖，此时可以按照100%的汇合度进行接种4.慢病毒感染后什么时间基因表达到峰值慢病毒感染后大部分细胞会在3天左右GFP或目的基因表达达到峰值，但是对于生长缓慢的细胞，达到峰值的时间会更长。
利用重组慢病毒载体建立稳定表达绿色荧光蛋白细胞系
慢病毒载体构建原理
慢病毒载体构建原理
慢病毒（lentivirus）是一类病毒，属于反转录病毒的一种。
慢病毒可以作为基因转移的工具，被广泛应用于基因治疗、基因编辑、干细胞研究等领域。
慢病毒载体构建是利用慢病毒作为基因传递的载体，将外源基因导入慢病毒基因组中，并通过慢病毒的复制和转录机制，将外源基因稳定地表达在宿主细胞中的过程。
慢病毒载体构建的原理主要包括以下几个步骤：
1. 选择适当的慢病毒载体，慢病毒载体通常由慢病毒的基因组和外源基因组成。
在构建慢病毒载体时，需要选择适当的慢病毒载体，通常选择已经经过改造的慢病毒载体作为基础，然后将需要表达的外源基因插入到载体中。
2. 插入外源基因，将需要表达的外源基因插入到慢病毒载体的适当位置。
通常采用限制性内切酶切割和连接酶连接的方法，将外源基因与慢病毒载体连接起来，形成重组的慢病毒载体。
3. 构建重组慢病毒载体，将插入了外源基因的慢病毒载体导入到适当的宿主细胞中，利用宿主细胞的复制和转录机制，使重组慢
病毒载体在宿主细胞中稳定复制和表达外源基因。
4. 验证慢病毒载体的稳定性和表达效果，对构建的重组慢病毒
载体进行验证，包括验证慢病毒载体在宿主细胞中的稳定性和外源
基因的表达效果。
通常采用PCR、Western blot等方法对慢病毒载
体进行验证。
总之，慢病毒载体构建是利用慢病毒作为基因传递的载体，将
外源基因导入慢病毒基因组中，并通过慢病毒的复制和转录机制，
使外源基因稳定地表达在宿主细胞中的过程。
这一技术在基因治疗、基因编辑、干细胞研究等领域具有重要的应用前景，对于疾病治疗
和生命科学研究具有重要意义。
慢病毒Cas9表达系统使用说明
慢病毒Cas9表达系统使用说明本说明书用于：¾构建Cas9蛋白表达细胞系¾在Cas9蛋白表达细胞系中敲除目的基因适用于以下产品货号货号pLV‐Cas9载体系列 CR2001，CR2002pLV‐Cas9‐Nick载体系列 CR2003，CR2004pGR载体系列 CR2011~CR2013pGR‐EGFP载体系列 CR2014~CR2016北京英茂盛业生物科技有限公司北京市昌平区沙河镇青年创业大厦B‐916Tel：010‐62495135Emai：order@Web site：目录1、产品简介 (2)1.1CRISPR/gRNA基因敲除原理 (2)1.2慢病毒Cas9表达系统特点 (2)2、Cas9表达慢病毒制备 (3)2.1试剂准备 (3)2.2简要实验流程 (4)2.3实验前准备 (4)2.4病毒制备步骤 (5)2.4 PEG纯化慢病毒 (6)3、筛选Cas9表达稳定细胞株 (7)3.1 试剂 (7)3.2 实验前准备 (7)3.3 筛选细胞系实验步骤 (8)3.4 Cas9表达细胞系检测 (9)4、用pTYNE载体对Cas9表达细胞系进行验证 (10)4.1验证Cas9蛋白表达细胞系 (10)4.2验证Cas9Nicknase蛋白表达细胞系 (11)5、pGR和pGR‐EGFP载体构建 (13)5.1 pGR和pGR‐EGFP载体图谱 (13)5.2 靶点设计 (13)5.3 pGR载体构建步骤 (14)附录1 用到的产品 (17)附录2 引物列表 (17)11、产品简介1.1CRISPR/gRNA基因敲除原理CRISPR (clustered, regularly interspaced, short palindromic repeats)是一种来自细菌降解入侵的病毒DNA或其他外源DNA的免疫机制。
在该机制中，Cas蛋白（CRISP‐associated protein）含有两个核酸酶结构域，可以分别切割两条DNA链。
慢病毒载体介导HIF1α稳定表达A549细胞系构建
慢病毒载体介导HIF1α稳定表达A549细胞系构建邹斌;周学亮;詹宇亮;陈紫晴;赖松青;吴霞;刘季春【摘要】目的利用慢病毒载体系统构建稳定表达HIF1α的A549细胞系.方法以NCBI人HIF1α基因编码序列为模板,设计并合成引物,PCR法扩增HIF1α.酶切回收的HIF1α片段与制备的慢病毒载体HBLV-RFP-Puro重组反应.PCR和基因测序鉴定重组质粒.重组质粒和辅助质粒共转染293T细胞.包装好的病毒经过滤、浓缩后,利用稀释计数法测定病毒滴度.制备好的慢病毒感染A549细胞,采用药物筛选稳定转染细胞系.荧光显微镜及Western blot检测观察转染及筛选效果.结果 PCR扩增HIF1α片段经鉴定成功,重组质粒经PCR、基因测序鉴定构建成功.成功包装获得高滴度LV-H IF1α.LV-HIF1α感染A549细胞后经药物筛选,荧光显微镜下细胞带有红色荧光,Western blot结果显示LV-HIF1α组HIF1α的表达水平明显高于对照组.结论慢病毒载体介导HIF1α稳定表达的A549细胞系构建成功.%Objective To establish the A549 cell line with stable expression of HIF1α by using lentiviral vector system.Methods Primers were designed and synthesized with human HIF1α gene coding sequence by the National Center of Biotechnogical Information(NCBI) as the template.HIF1α was amplified by PCR.The HIF1α fragment recycled by enzyme digestion was recombined with prepared lentiviral vector HBLV-RFP-Puro.The recombinant plasmid was identified by PCR and gene sequencing.The recombinant plasmid and the auxiliary plasmid were co-transfect into 293T cell.After filtration and concentration of packaged virus,the viral titer was detected by using the dilution counting method.The prepared lentivirus was infected A549 cells.The drug screening was adopted to stabilize the transfected cellline.The transfection effect was detected and observed by fluorescence microscope and Western blotting.Results The HIF1α fragment amplified by PCR was successfully verified and the recombinant plasmid was successfully constructed by PCR and gene sequencing identification.High-titer LV-HIF1α was obtained by successful package.After LV-HIF1α infecting A549 cells,the cells showed the red fluorescence by fluorescence microscope.The expression level of HIF1α in the LV-HIF1α group was significant higher than that in the control group by Westernblot.Conclusion The 549 cell line with HIF1α stable expression mediated by lentivirus is constructed successfully.【期刊名称】《重庆医学》【年(卷),期】2017(046)020【总页数】4页(P2744-2746,2750)【关键词】HIF1α;慢病毒载体;稳定表达;A549【作者】邹斌;周学亮;詹宇亮;陈紫晴;赖松青;吴霞;刘季春【作者单位】南昌大学第一附属医院心胸外科,南昌 330006;南昌大学第一附属医院心胸外科,南昌 330006;南昌大学第一附属医院心血管内科,南昌 330006;南昌大学第一附属医院心胸外科,南昌 330006;南昌大学第一附属医院心胸外科,南昌330006;南昌大学第一附属医院心胸外科,南昌 330006;南昌大学第一附属医院心胸外科,南昌 330006【正文语种】中文【中图分类】R734.2肺癌是全球最常见的恶性肿瘤之一，其导致的死亡人数居各类恶性肿瘤之首[1]。
慢病毒包装步骤及经验总结
慢病毒包装步骤及经验总结慢病毒（Lentivirus）是逆转录病毒的⼀种，它能够将靶基因导⼊到⼀些较难转染的细胞，如原代细胞等，并且将靶基因随机整合到宿主的基因组中，从⽽⼤⼤增加了转染效率，并且能够在细胞系中稳定表达若⼲代，可以进⾏稳转细胞株的筛选。
因为是随机整合，也有不确定因素，有些公司还能提供定点整合技术，将靶基因定点整合到基因组特定的部位，从⽽保证其⾼效表达并且对细胞不产⽣随机整合可能产⽣的伤害。
慢病毒表达载体包含了包装、转染、稳定整合所需要的遗传信息。
慢病毒包装质粒可提供所有的转录并包装RNA到重组的假病毒载体所需要的所有辅助蛋⽩。
为产⽣⾼滴度的病毒颗粒，需要利⽤表达载体和包装质粒同时共转染细胞，在细胞中进⾏病毒的包装，包装好的假病毒颗粒分泌到细胞外的培养基中，离⼼取得上清液后，可以直接⽤于宿主细胞的感染。
慢病毒载体基因组是正链RNA，其基因组进⼊细胞后，在细胞浆中被其⾃⾝携带的逆转录酶逆转录为DNA，形成DNA整合前复合体，进⼊细胞核后，DNA整合到细胞基因组中。
整合后的DNA转录mRNA，回到细胞浆中，表达⽬的蛋⽩或产⽣RNAi⼲扰。
慢病毒包装系统由⼀个包装质粒混合物（Mix）和⼀个慢病毒载体质粒（LentiviralVector）组成，如下图（图⽚来⾃MIT）：载体中含有HIV的基本元件5’LTR和3’LTR以及其他辅助元件等。
不同系统包装质粒混合物也不⼀样，以本实验室的三质粒系统为例，包装质粒混合物中含pMDL，VSVG，pRSV-Rev，⽐例为5:3:2；其中pMDL含有编码HIV病毒主要结构蛋⽩的gag基因和编码病毒特异性酶的pol基因，pRSV-Rev含编码调节gag和pol基因表达的调节因⼦rev基因，VSVG含有提供病毒包装所需要的单纯疱疹病毒来源的VSVG基因。
以下介绍⽤293T细胞在六孔板（35mm）中包装病毒，其他孔板相应增加或减少体积。
准备试剂篇? 核⼼质粒；? 指数⽣长的293T细胞；? 病毒包装质粒Mix:1 µg/µl（Mix=pMDL: VSV-G : REV=5:3:2），不同载体系统所⽤的包装病毒质粒也不⼀样，此系统可⽤于包装PBOBi，PLKO， Plv等载体质粒。
病毒载体在基因工程中的优势与应用案例
病毒载体在基因工程中的优势与应用案例基因工程是一门通过DNA分子的重组技术来改变或者改造生物体基因结构的科学技术。
它不仅可以用于基础研究，还可以应用于医学、农业和工业领域。
在基因工程中，病毒载体作为一种重要的工具，具有许多独特的优势和广泛的应用。
本文将介绍病毒载体在基因工程中的优势，并举几个应用案例进行讨论。
病毒载体在基因工程中的优势之一是其高度选择性，可以将外源基因有效地嵌入到宿主细胞的基因组中。
病毒载体的基因组通常很小，可以携带和传递较长的DNA序列。
此外，病毒载体经过长时间的进化，已经具备了高度有效的侵染宿主细胞的能力。
利用这些特性，科学家可以使用病毒载体来将目标基因传递到特定类型的细胞中，从而实现基因工程的目的。
其次，病毒载体在插入目标基因时具有高效性。
病毒载体可以很容易地与外源基因重组，使得目标基因在宿主细胞中高效表达。
病毒侵染细胞的过程中，目标基因会被病毒载体运输并插入宿主细胞的基因组中，从而可以在细胞内产生目标蛋白。
这种高效的表达方式使得病毒载体在基因工程中得到了广泛应用。
病毒载体还具有广泛的宿主范围，可以感染多种类型的细胞。
这一特性使得病毒载体在基因工程中的应用更加灵活多样。
不同的病毒载体适用于不同类型的细胞，科学家可以根据需求选择合适的病毒载体进行基因传递。
例如，腺病毒载体可以感染多种哺乳动物细胞，而慢病毒载体则可以感染较广泛范围的细胞类型。
下面，我们将介绍两个病毒载体在基因工程中的应用案例。
第一个应用案例是利用腺病毒载体进行基因治疗。
腺病毒载体具有高度感染人体细胞的能力，被广泛应用于基因治疗领域。
基因治疗是一种将正常基因导入病人体内，以纠正遗传性基因缺陷或者改善疾病症状的方法。
例如，在严重联免疫缺陷病患者中，科学家使用腺病毒载体将正常的免疫系统基因导入患者的造血干细胞中，以恢复其免疫功能。
第二个应用案例是利用慢病毒载体进行基因敲除。
慢病毒载体具有稳定的遗传物质传递能力，被广泛应用于基因组编辑和基因敲除中。
RNAi、慢病毒、稳转细胞和原核表达简介
基因功能研究
通过构建稳转细胞系，研究特定 基因在细胞生长、分化、代谢等 方面的功能。
药物筛选
利用稳转细胞系进行药物筛选， 寻找能够调节特定基因表达或影 响细胞功能的药物。
疾病治疗
通过构建与疾病相关的稳转细胞 系，研究疾病发生发展的机制， 为疾病治疗提供新的思路和方法 。
04
CATALOGUE
原核表达
rnai技术的应用
应用
RNAi技术广泛应用于基因功能研究、药物发现和Biblioteka 发、以及治疗遗传性疾病和癌症等疾病。
举例
通过RNAi技术，科学家可以研究特定基因的功能，或抑制某些有害基因的表达以治疗疾病。此外， RNAi技术还可用于开发新型药物，通过沉默与疾病相关的基因来治疗各种疾病。
02
CATALOGUE
慢病毒
慢病毒的概述
慢病毒是一种逆转录病毒，属于 Retroviridae科，具有逆转录酶
活性。
慢病毒具有感染多种细胞类型的 能力，包括分裂细胞和非分裂细
胞。
慢病毒具有稳定整合基因到宿主 细胞基因组的能力，因此常用于
基因治疗和基因功能研究。
慢病毒的制备
慢病毒载体通常由包装细胞系（如293T细胞）转 染产生。
稳转细胞的制备
准备质粒
将目的基因克隆到表达载体中，构建稳定表 达质粒。
筛选稳定细胞系
通过药物筛选或克隆选择等方法，筛选出稳 定表达外源基因的细胞系。
细胞转染
选择合适的转染方法，如脂质体转染、电穿 孔等，将质粒导入目标细胞。
验证与鉴定
对获得的稳转细胞系进行鉴定和验证，确保 其具有预期的表型和功能。
稳转细胞的应用
此外，慢病毒还可用于建立稳 转细胞系，用于药物筛选和肿
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
慢病毒载体，稳定表达
一、慢病毒
逆转录病毒（Retrovirus）：是一种RNA病毒，在复制时需在逆转录酶的作用下首先将RNA 转变为cDNA，再在DNA复制、转录、翻译等蛋白酶作用下扩增。
主要包括RNA肿瘤病毒、慢病毒及泡沫病毒等三种亚科。
慢病毒（Lentivirus）：属于逆转录病毒科，名称源自该种病毒长达数年的潜伏期。
最经典的慢病毒是由HIV病毒改造而来，而且HIV-1/HIV-2系统也得到了广泛的应用，除了HIV病毒系统以外，后续还有猿类免疫缺陷病毒（simian immunodeficiency virus, SIV）载体系统、猫免疫缺陷病毒（felines immunodeficiency virus, FIV）载体系统、绵羊梅迪-维斯纳病毒（MMV）载体系统和马传染性贫血(EIA）载体系统等。
慢病毒结构：
2个调节基因：
（1）tat基因：反式激活因子，对HIV基因起正调控作用。
（2）rev基因：病毒蛋白表达调节因子，增加gag和env基因对结构蛋白的表达。
4个辅助蛋白（附属）基因：
（1）vif和vpu调节感染性病毒颗粒的产生；
（2）vpr和nef参与疾病的表现。
慢病毒的优势：
1.慢病毒携带的基因组可整合到宿主基因组，使宿主细胞长时间稳定表达外源基因；
2.可感染分裂和非分裂细胞；
3.低免疫原性，直接注射活体组织不易造成免疫反应，适用于动物实验；
4.可以更换特异性启动子；
5.野生型的HIV大小约为9.8 kb，插入片段可长达5-6 kb；
二、慢病毒载体
慢病毒载体（Lentivirus）是一类改造自人免疫缺陷病毒（HIV）的病毒载体，是逆转录病毒的一种，基因组是RNA，其毒性基因已经被剔除并被外源性目的基因所取代，属于假型病毒。
可利用逆转录酶将外源基因整合到基因组中实现稳定表达，具有感染分裂期与非分裂期细胞的特性。
慢病毒包装过程：
慢病毒基因组进入细胞后，在细胞浆中反转录为DNA，形成DNA整合前复合体，进入细胞核后，DNA整合到细胞基因组中。
整合后的DNA转录成mRNA，回到细胞浆中，表达目的蛋白；或产生小RNA。
慢病毒介导的基因表达或小RNA干扰作用持续且稳定，并随细胞基因组的分裂而分裂。
慢病毒包装和侵染细胞的过程（元和生物）
三、慢病毒的使用和优势
慢病毒的使用量的取决因素：滴度，感染体积，MOI ，细胞密度
滴度（Titer）：单位体积液体中有感染能力的病毒或噬菌体数目。
单位：TU/mL （活性滴度单位）、copies/mL （物理滴度单位）
检测方法：定量PCR检测干扰后细胞基因组中外源DNA拷贝数。
实验原理：慢病毒介导外源基因以逆转录方式整合进目的细胞基因组。
图3
MOI（multiplicity of infection）：感染复数或者复感染指数。
指感染时病毒和细胞数量的比值。
在实验中也将某个细胞达到80%感染时所需的MOI 值定义为这个细胞的MOI值。
加的病毒量(μl)=细胞数×MOI/滴度(…/ml) ×1000。
最后，818 一些有关慢病毒方面的产品：
1.关于慢病毒载体构建方面：
ORF表达克隆产品【LPP-货号-载体-100，ORF/Promoter/lncRNA慢病毒】
shRNA克隆产品【LPP-货号-载体-050，shRNA慢病毒】
miRNA克隆产品【LPP-货号-载体-050，miRNA/inhibitor慢病毒】
Cas 9 和sgRNA克隆产品【LPP-CP-LvC9NU-载体-100，Cas9 慢病毒】
2.慢病毒包装服务方面（慢病毒颗粒，病毒浓缩，包装细胞系等）
LT001，基于HIV骨架的慢病毒颗粒包装试剂(20 reactions)
LT005，基于qRT-PCR技术的HIV骨架慢病毒颗粒滴度检测试剂（20次RT反应+50次PCR 反应）
LT007，慢病毒浓缩试剂盒（50 ml）
LT008，293Ta慢病毒颗粒包装细胞系(1.5 x 106 cells)。