Transwell试验方法

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Transwell细胞侵袭实验与移动实验

一、试剂和耗材

1)细胞及细胞培养基：KYSE150细胞、含10?S的RPMI1640培养基及无血清RPMI1640培养基。

10×PBS (pH7.0)：2)

NaHPO·12HO （MW 358.4） 2.87g 224KHPO（MW 136.09）0.2g 42NaCl（MW 58.44）

8.0g

KCl（MW 74.55）0.2g

去离子水至100 ml

高压灭菌后，室温保存。使用液为1×PBS(用无菌水进行1：9 稀释)。

3)冰乙酸:甲醛（1:3）

Transwell小室(BD, Bioscience)

4)Matrigel基质胶（BD, Bioscience，50ug/ml）：商品化，保存-20°。5)各种规格的枪头、6)1.5ml离心管及10ml玻璃离心管：高温灭菌后备用，其中准备一些枪头与1.5ml的离心管于-20o C预冷，备用。

7)5810R台式高速冷冻离心机（Eppendorf），TC10全自动细胞计数仪（Bio-Rad）

细胞计数板、8)6孔板

二、实验步骤

（一）侵袭实验

1.润化：在无菌台上取出Transwell小室，置于24孔培养板内，小室内和放小室的孔内均用加少量无血清培养基，润化5-15min。

2.细胞准备：在做实验前12h，弃去培养基，用PBS洗三次，每瓶细胞加入5ml无血清培养基，常规培4

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养24h。

3.细胞的接种：

弃去无血清培养基，常规胰酶消化细胞，若室温过低可置于37℃培养箱中消化，消化时间不宜过长，1)控制在1min以内。

2)加入4℃预冷的无血清培养基（建议6孔板2ml，培养瓶5ml），轻轻吹打均匀后，收集至10ml玻璃离心管中（带螺口盖子），水平转子4℃、700rpm/min，离心5min；

3)弃除上清，适量无血清洗涤细胞并离心；

弃除上清，加入适量无血清培养基重悬细胞（根据细胞消化前满度进行初步稀释，建议初步稀释至细4)

5/ml），轻轻吹打均匀后，取10ul细胞悬液用于Bio-Rad TC10胞密度大于1.5×10细胞计数；亦可取15ul细胞悬液与等体积台盼蓝染液混合后取10ul用于Bio-Rad TC10活细胞计数；

5/ml；计数后，取无血清培养基重悬一定体积的细胞悬液，将细胞密度调整至1.25×105)

4细胞）逐滴加入小（含5×10公司6)BD24孔板，取上述细胞悬液400μl将一定数量Transwell小室放入室；取500μl含10%血清的培养基沿小室侧壁与孔壁的空隙处加入到孔中，并保证小室膜与培养液之间无气泡。

7)将接种好的细胞放入培养箱，37℃、5%CO条件下常规培养24h，此过程不宜晃动细胞板。2细胞染色及拍照：4.弃孔内培养基，将小室取出，弃去孔中培养基，PBS漂洗3次，将小室内PBS吸干净，此过程要求快1)速完成，避免让小室的膜过于干燥，将小室置于已加入500ul固定液的培养孔中，在上室中加入200ul固定液，固定5-10分钟左右。此过程要将保证培养板盖有盖子，以防挥发。

2)弃去孔中固定液，PBS漂洗3次，将小室内PBS吸干净，将小室置于已加入500ul苏木素染液的培养孔中，上室中加入200ul固定液，染色10-15min。

3)将小室转移至新的培养孔中，水洗至适当颜色，用棉签擦拭去小室内部未穿过上室膜面的细胞。

往小室内加入100ul PBS，倒置显微镜观察穿过去的细胞，200×光镜下计数10个视野的侵袭细胞数,4)取其平均值,以侵袭细胞的相对数目表示肿瘤细胞的侵袭能力。

5)若颜色偏浅，可以置于染色液中重复染色，水洗至适当颜色后即可。

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（二）移动实验

1.小室润化：在无菌台上取出Transwell小室，置于24孔培养板内，小室内和放小室的孔内均用加少量无血清培养基，润化5-15min，备用。

2.细胞准备：常规培养细胞，用PBS（已灭菌）或无血清培养基洗涤3次后，加入常规量无血清培养基饥饿12h。

3.接种Transwell小室

1)弃去无血清培养基，常规胰酶消化细胞，若室温过低可置于37℃培养箱中消化，消化时间不宜过长，控制在1分钟以内。

2)加入4℃预冷的无血清培养基（建议6孔板2ml，培养瓶5ml），轻轻吹打均匀后，收集至10ml玻璃离心管中（带螺口盖子），水平转子4℃、700rpm/min，离心五min；

3)弃除上清，加入适量无血清培养基重悬细胞（根据细胞消化前满度进行初步稀释，建议初步稀释细胞5/ml），轻轻吹打均匀后，取10ul细胞悬液用于Bio-Rad TC10密度大于1.5×10细胞计数；亦可取15ul细胞悬液与等体积台盼蓝染液混合后取10ul用于Bio-Rad TC10活细胞计数；

5/ml；10 计数后，取无血清培养基重悬一定体积的细胞悬液，将细胞密度调整至4)1.25×将一定数量Transwell小室放入BD5)公司24孔板，取上述细胞悬液400μl逐滴加入小室；取500μl含10%血清的培养基沿小室侧壁与孔壁的空隙处加入到孔中，并保证小室膜与培养液之间无气泡。

6)将接种好的细胞放入培养箱，37℃、5%CO条件下常规培养24h，此过程不宜晃动细胞板。24.细胞染色（Giemsa 试剂盒）及拍照：

（三）Transwell小室重复利用处理方法

1．拍照结束后，将小室直接放入6孔板/24孔板中，小室上下均加入适量胰酶，使膜浸泡在胰酶中，室温放置过夜（约6h以上）；

2．将小室取出，用75%乙醇浸泡5min（可将小室全部没入乙醇中），重复三次，以除去苏木素染色；

3．无菌水漂洗几次以除去残留物质，甩干水后，置于室温自然晾干；

4．再次使用之前，将晾干的小室及所用的细胞板置于超净台紫外下除菌，小室正反面各照射30min。

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注：小室可重复利用多次，但在棉签擦拭的时候力度避免过大，以免损伤小室膜；重复使用之前可观察小室膜是否出现裂痕，若出现较多裂痕可停止使用。

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