关于酵母表面展示技术课件
细菌与酵母表面展示技术课件
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•
Schreuder等未来自瓜儿豆
胶的α-半乳糖苷酶的基因插入
到酿酒酵母转化酶分泌信号和
α-凝集素C端部分编码序列之间
。α-半乳糖苷酶和α-半乳糖苷酶
-α-凝集素〔α-Gal-ACI〕交融蛋
与α-凝集素类似的衔接锚定在细胞壁上。与α-凝集
素不同，α-凝集素由两个亚单位的糖蛋白பைடு நூலகம்成。
•
酵母外表展现系统运用在酿酒酵母的α-凝集
素将外源蛋白质展现与细胞外表。α-凝集素由中心亚
单位(Agalp)和结合亚单位(Aga2p)两个亚单位组成，
Agalp
•
共725个氨基酸，合成后被分泌到细胞外，与酵母
谢谢欣赏
1.目的蛋白-α-凝集素外表展现系统
• 此系统将目的蛋白作为N端，与α-凝集素C端部分交融， 目的蛋白经α-凝集素展现酵母细胞外表。α-凝集素共价衔 接到细胞壁的葡聚糖上，其锚定部位由蛋白质C端320个氨 基酸组成，富含Ser/Thr残基。Ser/Thr富集区因广泛存在的 O-糖基化而拥有的一个杆状构象，可作为空间支持无发扬 作用。
• 酵母是个足够大的颗粒，可用流式细胞仪进展挑 选和分别，这就使得基于特异定量亲和力改动的 的突变体分别成为能够。由于酵母展现的蛋白质 是严密锚定在细胞壁上，可以耐受SDS等的抽取， 同时酵母有发酵特性且生长快，因此在工业上具 有很好的运用前景。
• 前景：
• 外表展现技术日新月异，酵母展现系统在不断的完善和改 良，在多个领域得到广泛运用。由于其是真核细胞展现系统， 对于哺乳动物蛋白质，尤其是人的蛋白质的展现具有独特的 优越性，置信随着此技术的不断完善，在蛋白质分子的研讨 方面发扬越来越重要的作用。
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• 载体蛋白
酵母细胞表面包被着一层坚硬的细胞壁，由内 层的葡聚糖骨架和外层的甘露糖蛋白构成。甘 露糖蛋白主要包括两类蛋白质：一种以非共价 方式松散地结合于细胞壁，可以用SDS 抽提； 另一类蛋白必需以 β-1,3 或β-1,6 葡聚糖酶消 化细胞壁后才能抽提，这类蛋白常含有 GPI 锚 定区域。α-凝集素和絮凝素以及细胞壁蛋白如 Cwp1p，Cwp2p，Tip1p 等都属于 GPI 家族 蛋白，外源蛋白与它们融合后可被共价锚定于 细胞表面，这些蛋白是常用的酵母表面展示载 体蛋白。
第6页与外源蛋白融合，并将融合蛋白展露表达 在细胞表面，此系统又包括两个子系统: GPI锚定系统和絮凝结构域锚定系统。 GPI锚定系统是利用絮凝素Flo1p的C末端含有的GPI信号锚定外源蛋白，此系 统与凝集素展示相似; 絮凝结构域锚定系统是利用Flo1p的中间絮凝功能结构 域与外源蛋白融合，通过絮凝功能结构域识别酵母细胞壁中的甘露聚糖链并以 非共价作用诱导细胞粘附、聚集成可逆性絮状物
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• 酵母表面展示与酶技术 • 酶的固定化是指借助物理或者化学方法将酶固定于特殊
的相，使得酶与整体流体分开，但是仍然能够进行底物 和效应物分子交换并发挥其催化效能的一种技术。与游 离酶相比，固定化酶提高了酶的稳定性，并使酶能够反 复回收利用。但是，传统的固定化方法也会产生一些不 利因素，例如由于增加固定化操作，导致酶固定化过程 中的活性收率损失；另外由于固定化操作需用载体，因 而增加了载体成本费和固定化操作费用。利用表面展示 技术将具有催化活性的酶展示于酵母等微生物细胞表面 就形成了全细胞催化剂，与传统的细胞内酶和外分泌酶 不同，表面展示的酶以共价或非共价方式固定于细胞外 表面，这种独特的空间定位使其相对自由酶而言有许多 优良的特性，如温度、有机溶剂稳定性、可多次重复使 用等，这些特点与传统的固定化酶技术相似，但无需额 外的蛋白纯化和固定的操作，有着良好的应用前景。
酵母菌表面展示操作步骤之酵母细胞转化与筛选
酵母菌表面展示操作步骤之酵母细胞转化与筛选酵母菌表面展示是一种常用的生物技术方法，通过将目标蛋白质展示在酵母菌表面，可以方便地筛选和分析目标蛋白的性质和功能。
本篇回复将介绍酵母细胞转化和筛选的操作步骤。
1. 酵母细胞培养首先，准备酵母菌的培养基，可选择含有适当营养物质的液体培养基或固体培养基。
将培养基加热至适温（通常为30°C）后，将酵母菌培养基中接种适量的酵母细胞。
培养室环境应保持洁净，避免杂菌的污染。
2. 酵母细胞转化酵母细胞转化是将外源DNA导入酵母细胞的过程。
常用的方法有化学法、电穿孔法和冷冻转化法等。
化学法是最常用的方法之一。
首先，将目标DNA与载体质粒进行连接。
然后，将该DNA与酵母细胞混合，加入聚乙二醇和锂盐缓冲液，并进行热胁迫。
此时酵母细胞的细胞壁会变薄，使DNA能够进入细胞。
最后，将转化混合物分别进行热立体电转，温度变化会让酵母细胞摆脱聚乙二醇，转化DNA进入细胞内。
电穿孔法在酵母细胞转化中也被广泛使用。
该方法通过施加高压电脉冲来使细胞膜通透，从而使DNA能够进入细胞内。
冷冻转化法则通过将酵母细胞与DNA混合后迅速冷冻来实现DNA导入。
冷冻对酵母细胞膜的完整性要求较高，因此通常需要较高的转化效率。
3. 筛选转化酵母细胞筛选转化酵母细胞是为了找出具有目标蛋白质表面展示的细胞株。
常见的筛选方法包括基于细胞生长特性的选择筛选和基于蛋白质表达的筛选。
基于细胞生长特性的选择筛选方法利用某些基因的突变导致细胞对特定抗生素的敏感或抗药性来筛选细胞。
例如，将转化酵母细胞接种在含有某种抗生素的培养基上，只有表达了目标蛋白的细胞才能生长。
基于蛋白质表达的筛选方法则通过蛋白质表达水平的检测来筛选细胞。
常用的方法包括免疫检测、荧光标记和酶活检测等。
例如，可以利用特异性抗体来检测目标蛋白的表达情况，或者利用荧光蛋白标记来可视化表达目标蛋白的细胞。
4. 确认目标蛋白质表面展示在筛选出合适的酵母细胞株后，需要进行确认，确保目标蛋白质确实表达在酵母菌的表面。
酵母细胞表面展示
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Hahnenberger和Kurtz 建立了酵母展示的系统来筛选钾离子通道、 质子通道和钠/氢离子通道的抑制剂。其中，流行性感冒质子通道 蛋白M2的表达能导致酵母生长缺陷，因此，理论上那些能使酵母 恢复生长的化合物就是M2的抑制剂。据此，他们筛选得到了一个 流行性感冒质子通道蛋白的抑制剂。此外，在利用生长抑制的方法 进行抑制剂筛选实验中，由于那些具细胞毒性的化合物虽然不是离 子通道抑制剂，也能阻碍酵母生长。为此，Hahnenberger和Kurtz设 计了微生理测量计，能检测出反映离子通道功能的pH变化，为假 阳性的剔除提供了一个快速的二次检验方法。
• 絮凝结构域锚定系统是利用 FLo1p的中间絮凝功能结构 域与外源蛋白融合，通过絮 凝功能结构域识别酵母细胞 壁中的甘露聚糖链并非共价 作用诱导细胞粘附、聚集成 可逆性絮状物。
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酵母表面展示技术的特点
特点
表达偏差 小
筛选、纯 化、活性 测定方便
融合蛋白 相对分子 质量范围
酵母细胞表面展示技术及其在高通 量筛选中的应用
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目录
• 酵母细胞表面展示技术的概述 • 酵母细胞表面展示技术在高通量筛选中的应用
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酵母细胞表面展示技术的概述
酵母细胞表面展示技术概念 酵母细胞表面展示技术基本原理 酵母细胞表面展示技术常见系统 酵母细胞表面展示技术的特点
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酵母细胞表面展示技术的概述
• 酵母细胞表面展示技术(Surface Display)是一种真核蛋白表达系统。
它是一类筛选蛋白质突变体库的高通量 筛选方法，在抗体蛋白的研究中应用尤 其广泛，具有高效、灵敏等特点，在医 药、食品、生物燃料等多个工业领域都 有广泛的应用前景。
酵母菌表面展示的操作步骤
酵母菌表面展示的操作步骤酵母菌表面展示的操作步骤：酵母菌表面展示技术是一种基因工程技术，用于在酵母菌表面显示外源蛋白。
这项技术具有广泛的应用前景，可以用于疫苗研发、抗原表位筛选、酶工程等领域。
以下是酵母菌表面展示的一般操作步骤：1. 制备酵母菌工作库：首先，选择适合表面展示的酵母菌株，如Saccharomyces cerevisiae或Pichia pastoris等。
然后，将目标蛋白的编码序列与酵母菌表面展示载体进行连接，得到重组质粒。
将重组质粒导入酵母菌细胞中，经过适当的培养和筛选，得到酵母菌工作库。
2. 构建表面展示的载体：将目标蛋白的编码序列与表面展示载体连接，通常采用DNA重组技术，将目标蛋白编码序列与表面展示载体的启动子、终止子以及分泌信号序列等序列连接起来。
确保连接正确无误后，得到表面展示载体。
3. 将表面展示载体转化入酵母细胞：将表面展示载体导入酵母细胞，可以采用化学法转化或者电击法转化。
在转化过程中，需要添加适当的选择性培养基，筛选转化成功的酵母菌克隆。
4. 诱导表面展示蛋白的表达：将转化成功的酵母菌接种至培养基中，培养一定时间，使酵母菌开始生长。
在适当的时间点，添加诱导剂，如酒石酸或甘油等，刺激酵母菌产生表面展示蛋白。
5. 检测表面展示蛋白的表达：采用免疫学检测方法，如免疫印迹、免疫荧光等，检测表面展示蛋白的表达情况。
可以使用特异性抗体来识别表面展示蛋白，并观察其在酵母菌表面的分布情况。
6. 验证表面展示蛋白的功能：针对表面展示蛋白的功能特性，进行相应的活性鉴定实验。
例如，对于展示的酶类蛋白，可以进行酶活测定；对于展示的抗原蛋白，可以进行抗原性测试。
总结：酵母菌表面展示技术是一种重要的基因工程技术，通过将外源蛋白表面展示在酵母菌细胞上，实现了对蛋白的高效表达和功能验证。
通过以上的操作步骤，可以成功制备出表面展示蛋白的酵母菌工作库，并通过免疫学检测和功能验证来验证表面展示蛋白的表达和功能。
酵母菌表面展示基因的构建和转化
酵母菌表面展示基因的构建和转化酵母菌表面展示基因是一种常用的蛋白表达技术，通过将外源基因插入酵母菌表面展示基因载体中，使其能够在酵母菌细胞表面表达并展示出来。
这一技术可以应用于酵母菌的蛋白质工程和药物筛选等领域。
本文将介绍酵母菌表面展示基因的构建和转化流程。
一、酵母菌表面展示基因的构建1. 选择适合的酵母菌表面展示基因载体。
常用的载体有pCTCON2、pCTPAS2等，这些载体含有表面展示基因所需的信号序列和适当的启动子。
2. 选择合适的启动子和信号序列。
启动子决定了表达基因的强弱，信号序列决定了基因能否正确的表达在酵母菌细胞表面。
3. 将目标基因插入载体中。
可以使用PCR方法扩增目标基因或通过合成基因片段插入载体中。
注意选择合适的引物设计和错配扩增条件。
4. 确认基因插入正确。
可用酶切鉴定、测序和限制性片段长度多态性（RFLP）分析等方法进行确认。
二、酵母菌表面展示基因的转化1. 构建表达酵母菌表面展示基因的受体菌株。
选择合适的酵母菌株，如Saccharomyces cerevisiae。
构建基因敲除/插入的方法可以用来降低背景信号和增加基因表达效率。
2. 转化酵母菌。
可采用化学转化、电击转化或基因枪等方法。
注意转化体系的优化，如转化时间、转化剂的浓度和pH值等因素。
3. 选择性培养和筛选。
转化后的酵母菌需在含所需选择因子的培养基上进行培养，并去除未转化的酵母菌。
可利用选择性培养基或对抗物质的添加进行筛选。
4. 筛选高表达菌株。
通过检测表面展示蛋白的活性、测定蛋白产量或使用特异性抗体等方法进行筛选。
三、酵母菌表面展示基因的应用1. 酵母细胞表面展示蛋白质工程。
通过酵母菌表面展示基因技术可以进行蛋白质工程研究，可以展示和表达各种蛋白质、抗体、酶、蛋白质片段等物质，以便进行蛋白质相互作用研究、蛋白质功能分析等。
2. 药物筛选。
通过酵母细胞表面展示基因的技术，可以用来筛选化合物对目标蛋白的结合能力、激活能力或抑制能力。
酵母菌表面展示操作的步骤详解
酵母菌表面展示操作的步骤详解酵母菌表面展示是一种常用的生物学技术，用于将特定的蛋白质或多肽序列在酵母菌表面展示，以便进一步研究其结构和功能，寻找靶向治疗以及疫苗研究等方面的应用。
本文将详细介绍酵母菌表面展示的操作步骤。
一、准备工作1. 菌种的培养：选择具有表面展示蛋白质基因的酵母菌菌株，并在常见培养基（如YPDA或SD）中进行预培养，确保菌株健康生长。
2. 质粒的构建：将目标蛋白质基因插入适宜的表达质粒中，确保质粒含有所需的启动子、选择标记和适当的表达信号序列。
二、转化酵母菌1. 酵母菌的电转化：将目标质粒导入酵母菌中，使用电击等方法将质粒转化到酵母菌细胞内。
2. 酵母菌的化学转化：通过化学方法，将目标质粒导入酵母菌细胞内，例如利用锂乙酸或聚乙二醇等。
三、筛选阳性菌落1. 在选择培养基上筛选：使用具有所需物质的选择性培养基，如缺少特定氨基酸或碳源的培养基。
筛选出能够在选择性培养基上生长的酵母菌菌落。
2. 进一步确认：通过PCR、酵母菌染色体DNA的酶切等方法，进一步确认阳性菌落。
四、表达目标蛋白质1. 培养酵母菌：将阳性菌落进行扩大培养，至菌液处于对数生长期时，加入适当浓度的诱导剂，如甲基半乳糖醇（galactose）或双丙酮酸（acetate）等。
2. 酵母菌蛋白质提取：使用适当的方法，如裂解细胞壁，离心，使得表达的蛋白质从酵母菌细胞中释放出来。
五、检测和分析1. SDS-PAGE分析：使用聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）技术，分析目标蛋白质是否表达，并确定表达量的相对大小。
2. Western blot分析：利用Western blot技术，将酵母菌表达的蛋白质转移到膜上，然后使用特异性抗体检测蛋白质的表达。
六、进一步应用1. 结构和功能研究：使用各种生物化学技术，如质谱分析、X射线晶体学等，研究目标蛋白质的结构和功能。
2. 靶向治疗：利用酵母菌表面展示的特性，研发针对特定靶点的药物或治疗方案。
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外源蛋白
酵母表面展示系统适合展示各种真核蛋白，包括酶、细 胞识别因子、受体、抗体、抗原等，被广泛地应用于蛋 白质工程、全细胞催化、生物转化、细胞吸附、分子识 别、生物治疗、信号转导、生物传感器和疫苗等领域。 外源蛋白与载体蛋白的融合方式有 C 末端融合、N 末端 融合、插入融合。对某些外源蛋白，选择恰当的融合方 式可以明显改善展示效果或蛋白的功能特性，如 Aga2p 蛋白有良好的柔性，外源蛋白可以以 N 末端或 C 末端 两种方式与其融合。研究表明抗 CD3ε单链抗体融合于 Aga2p 蛋白C末端时，其亲和力较天然蛋白降低 30～100 倍[5]，而融合于N末端时活性得以恢复。
酵母表面展示系统基本组成
宿主细胞 酿酒酵母一直被认为是安全的模式生物（GRAS）而广泛
应用于食品工业和医药工业，也是目前常见的用于酵母 表面展示的宿主细胞。除酿酒酵母外，近年来酵母展示 平台已被拓展至某些能利用甲醇作为单一碳源和能量来 源的细胞株，如巴斯德毕赤酵母、汉逊酵母。与酿酒酵 母相比，嗜甲醇酵母细胞株具有更优越的发酵特性，如 能够在廉价的碳源中生长和更高的细胞培养密度，这些 特性使其在需要大规模发酵的应用中更具优势，例如展 示异源酶作为全细胞催化剂。另外，毕赤酵母对外源蛋 白的 O-糖基化程度更高，因而对展示的外源酶具有更好 的稳定效果。
表面，在医药、食品、生物燃料等多个工业领域 都有广泛的应用前景。
Байду номын сангаас
原理
酵母是单细胞真核生物,根据交配型的差 异分为两种单倍体:MATα和MATa,其细胞 表面分别表达α-凝集素和a-凝集素,它 们可以介导细胞之间的交配融合。酵母 表面展示系统应用的是酿酒酵母的a-凝 集素,外源蛋白借助它在细胞表面得到展 示。a-凝集素由核心亚单位(Aga1)和结 合亚单位(Aga2)两部分组成,Aga1共有 725个氨基酸,它与酵母细胞壁的β-葡聚 糖共价连接。Aga2共有69个氨基酸,它通 过两个二硫键与Aga1结合,表达于酵母细 胞表面。Aga2的N端部分参与二硫键的形 成,外源蛋白通过与Aga2的C端融合可展 示于酵母细胞表面。
关于酵母表面展示 技术
细胞表面是细胞内外的功能界面。一些表面蛋白 横穿过质膜，另一些以共价或非共价结构与细胞
表面复合物结合一起。细胞能够锚定特定的表面 蛋白，并且能将其限制在细胞表面的特定区域。 在生物技术中，细胞表面通常用于研究蛋白跨膜 的机理。酵母细胞表面展示技术是近年来发展较
快的一种真核蛋白表达系统，其基本原理是将外 源靶蛋白基因(外源蛋白)与特定的载体基因序列 融合后导入酵母细胞，利用酵母细胞内蛋白转运 到膜表面的机制使靶蛋白固定化表达在酵母细胞
酵母表面展示系统的应用
酵母表面展示与酒精发酵 传统的酒精发酵是以淀粉质谷物或糖蜜为原
料。随着燃料酒精需求的日益增长，以天然 纤维素类资源生产酒精的研究也日益受到人 们重视。由于纤维素类物质是自然界中一种 潜在的可再生资源，对解决未来能源问题有 着巨大的潜力，因此，天然纤维素酒精发酵 具有重要意义。Fujita 等成功地将三种纤维 素水解酶同时展示在酿酒酵母表面，从而构 建了能够增效和按顺序降解纤维素的全细胞 生物催化剂。
絮凝素展示表达系统利用絮凝素基因与外源 蛋白融合，并将融合蛋白展露表达在细胞表 面，此系统又包括两个子系统: GPI锚定系统 和絮凝结构域锚定系统。GPI锚定系统是利用 絮凝素Flo1p的C末端含有的GPI信号锚定外源 蛋白，此系统与凝集素展示相似; 絮凝结构 域锚定系统是利用Flo1p的中间絮凝功能结构 域与外源蛋白融合，通过絮凝功能结构域识 别酵母细胞壁中的甘露聚糖链并以非共价作 用诱导细胞粘附、聚集成可逆性絮状物
载体蛋白
酵母细胞表面包被着一层坚硬的细胞壁，由内 层的葡聚糖骨架和外层的甘露糖蛋白构成。甘露 糖蛋白主要包括两类蛋白质：一种以非共价方式 松散地结合于细胞壁，可以用SDS 抽提；另一类 蛋白必需以 β-1,3 或β-1,6 葡聚糖酶消化细 胞壁后才能抽提，这类蛋白常含有 GPI 锚定区 域。α-凝集素和絮凝素以及细胞壁蛋白如Cwp1p， Cwp2p，Tip1p 等都属于 GPI 家族蛋白，外源蛋 白与它们融合后可被共价锚定于细胞表面，这些 蛋白是常用的酵母表面展示载体蛋白。
酵母表面展示系统与新药筛选
将未知功能的目的基因产物或特定病理过程相关 能的基 因产物或病理过程相关产物发生相互作用的物质， 有助于对未知基因功能的研究，并能发现一些药 物作用的新靶点，或筛选到治疗疾病的新药先导 化合物 。Visintin 等将酵母表面展示技术与酵 母双杂交技术相结合，将抗体的单链（scFv） 片断连接到转录因子VP16 的激活结构域( AD) 上， 将抗原连接到酵母LexA的结合结构域( DB) 上，以His3 和LacZ 为报告基因， 建立抗原抗 体相互作用的展示方法。当抗原- 抗体发生相互 作用时，AD 和DB 的结合将启动报告基因的表达， 可通过营养缺陷培养基进行检测。这种方法从 scFv 突变体展示库中将有可能筛选到抗原特异 的抗体，为疫苗及抗体类药物的研制提供良好的 平台。
酵母表面展示系统的类型
最常见的酵母表面展示表达系统包括: 凝集 素展示表达和絮凝素展示表达
凝集素展示表达系统是将外源基因与酵母编 码凝集素C端编码序列(含GPI锚定信号序列) 连接后插入质粒载体的信号肽下游， 融合蛋 白诱导表达后， 信号肽引导嵌合蛋白向细胞 外分泌， 由于融合蛋白C末端存在含GPI锚定 信号的凝集素多肽序列，可将蛋白锚定在酵 母细胞壁中，从而将蛋白分子展示表达在酵 母细胞表面。
酵母细胞表面展示与生物吸附
环境污染物的生物修复是以酶促降解或生物吸附 为基础的，例如微生物对重金属的吸附就包括两 种途径: ( 1) 与细胞表面复合物结合，( 2) 逐 渐吸收在细胞内进行消化。然而通过胞内消化降 解有毒物质必须使细胞内酶，蛋白质或污染物跨 越细胞膜这一屏障，比较缓慢及效率低而且不可 重复利用。利用表面展示技术能较好地解决这一 问题，吸附蛋白直接展示在细胞表面，不仅使吸 附过程快捷高效还可以利用回复剂如EDTA 对其 进行处理使之不断重复利用。