缺氧诱导因子家族

1）pVHL：林希病因子（von Hipple-Lindau tumor suppressor protein） 林希氏病（von Hipple-Lindau disease——1894年）：遗传性肿瘤综合 症，视网膜、中枢神经系统多发性血管瘤 林希氏病时有VHL基因突变或缺少野生型 VHL为肿瘤抑制基因 （2）pVHL与Cul2、 Elongin B、Elongin C形成复合体——VCBC（VHLE3） （3） VCBC与HIF-1结合

–均可与靶基因的缺氧反应元件（HRE）特异结合

–均受到细胞内氧张力的调节

不同点：
–同源性：
同种系、不同亚基：同源性较低 同亚基、不同种系：同源性则高
人与小鼠HIF-1α 的cDNA之间有90%的同源性，而HIF-1α 和HIF-2α 的同源性仅为48%。
–组织分布：
HIF-1α ——几乎所有组织 HIF-2α ——内皮特异的PAS结构蛋白（EPAS-1）（结构、稳定性、 二聚体形成、DNA结合等与HIF-1α 相似）
三、HIF-1的分子结构
HIF-1为由α、β组成的异二聚体： HIF-1 α （功能性亚基）——120kD HIF-1 β （结构性亚基）——91/93/94kD（与磷 酸化程度有关） cDNA序列分析-genebank查询： HIF-1 α为新发现的细胞核因子； HIF-1 β为已被鉴定的一种核因子——芳香烃受 体核转运体（ARNT）， HIF-1 β= ARNT
人、大鼠、小鼠各组织中HIF-1有广泛表达 缺氧（7%O2、60min）仅能使HIF-1 mRNA在 大鼠脑、肺、肾组织中的表达有限地 （modestly）增加

ODD
1211bp
HIF-1α cDNA 结构示意图

HIF-1 β：789/774氨基酸
HIF-1的DNA结合结构域与PAS家族
PAS Domain HIF-1α HIF-1β （ARNT） SIM PER bHLH bHLH bHLH A PAS B A PAS B A PAS B A PAS B PAS 家族与 PAS 结构域示意图 826aa
缺氧与基因表达及其调控
——缺氧诱导因子家族（HIFs）
柳君泽 第三军医大学病理生理教研室
本节主要内容：
一、HIFs家族的组成与发现过程 二、HIF-1的生物学活性特性 三、HIF-1的分子结构 四、HIF-1的合成、降解与活性调节 五、HIFs家族成员的比较
一、HIF家族的组成与发现过程

HIFs的组成：
缺氧因子家族的发现年代与作者 年代 作者 Semenza GL，et al Ema M，et al. Gu YZ，et al 发表刊物 Mol Cell Biol，12（12） ：5447 Proc Natl Acad Sci USA，94：4273 Gene Exp，7（3） ：205
HIF-1 HIF-2 HIF-3
3、羟化
（1）ODD的Pro564、Pro402 （2）脯氨酸羟化酶（HIF prolyhydroxylase，HPH）：Fe+3、O2
五、HIFs家族成员的比较
HIFsα 亚基的比较 cDNA 全长 HIF-1α HIF-2α （EPAS-1） 2000 HIF-3α （可能是负调节因子） 3720 阅读框 2478 1878 2004 826 626 668 19 号 14q21-4 同一亚基不同种 系之间高； 同一种系不同亚 基间低。 蛋白 基因定位 同源性 NAD CAD 区 区 + + + + + -
AHR-HSP90-ARNT
HSP90
AHR-ARNT ↑
四、HIF-1的合成、降解与活性调节
HIF-1α的调节环节



HIF-1α的合成（表达）调节 – mRNA的转录 – 转录后 – 翻译水平 – 翻译后加工 HIF-1α的活性调节 – 核内定位 – 磷酸化 – 其它反式作用因子的结合：C-Jun、Jab1、CREB、P300 HIF-1α的降解调节 – 磷酸化调节 – 羟基化调节

结构域的功能：
bHLH：与DNA结合，并参与蛋白的二聚体化 PAS：与蛋白的二聚体形成有关，并参与DNA 的结合。 200～350保守的氨基酸组成； 中间含有A、B两段特殊结构，各有51aa重复， 间隔100aa左右。

ARNT的功能：
配体 （dioxin，xenobiotic ） AHR-HSP90 + ↓ ARNT ↓ DNA
缺氧 EPO mRNA↑
？
缺氧
（1%O2）
Hep3B或HepG2细胞
+
EPO 3’ HIE

HIF-1的分离纯化： 活性检测——凝胶迁移率改变分析（W18探针） 分离纯化——离子交换层析、（W18）亲和层析、 甘油梯度沉降分析、凝胶电泳分子量测定、紫 外交联分析 cDNA克隆——克隆、序列分析、Genebank查找
（一）HIF-1的磷酸化与核内转移
（1）HIF-1的核内转移 细胞中有少量（basal level）的HIF-1 α （但 无活性），缺氧可诱导HIF-1α从头合成； HIF-1 β（ARNT）表达相对固定，但缺氧、 缺氧-复氧可引起HIF-1β蛋白在细胞内的重分 布，机制类似STAT（信号转移与转录激活子） 的核内转移。
1992 年 1997 年 1998 年
基因的缺氧诱导性表达调控。基础医学与临床，1997；17（1）：15～21
HIF-1的发现过程：
整体动物实验 转基因动物：转入人EPO的小鼠（肝、肾） 离体器官 体外培养细胞：Hep3B、HepG2 ————EPO的表达受缺氧刺激因素的诱导
缺氧 贫血 CO CoCl2
789/774aa 655aa
1218aa
PAS：（Per-ARNT/AHR-Sim）： Per：控制果蝇生物节律周期的period基因产 物； ARNT/AHR：分别为哺乳细胞中的芳香烃受体 （AHR）和芳香烃受体核转运子（ARNT）， 调节细胞内分解（代谢）多环芳烃化合物有关 的酶的基因的表达。 Sim：果蝇中枢神经系统及其前体的中线细胞 中Single-minded基因表达的一种核蛋白，调 节与中线细胞羽化有关的基因表达；

（2）HIF-1的磷酸化 缺氧诱导HIF-1的DNA结合过程中，伴有磷酸化过程 – HIF-1分子中富含丝氨酸和苏氨酸，为磷酸化位点； – 蛋白激酶抑制剂：

丝/苏氨酸激酶、酪氨酸激酶抑制剂处理，缺氧的Hep3B细 胞内HIF-1结合DNA的活性下降
– 蛋白磷酸酶抑制剂：

丝/苏氨酸磷酸酶抑制剂、酪氨酸磷酸酶抑制剂处理，可使 缺氧的Hep3B细胞内HIF-1结合DNA的活性增强

血管内皮，介导缺氧诱导的VEGF的表达，可能在血管的形成中发挥 更重要的作用

HIF-3α ——一定组织表达
有研究提示HIF-3α 可能是缺氧诱导靶基因表达的负性调控因子，转 染HIF-3α 的细胞可抑制HIF-1α 和HIF-2α 所调节的靶基因的表达。
六、整体组织器官中HIF-1的表达

共同点：
–均是由α 、β 两个亚基组成的异源二聚体，

α :主要功能亚基，受缺氧调控 β ：已知蛋白质（ARNT），对缺氧不敏感 蛋白-蛋白、蛋白-DNA相互作用的结构基础 调节其表达 缺氧可诱导其表达（转录、翻译）；增强DNA结合活性 氧张力调节降解：富氧促进降解
–α 、β 亚基均含bHLH-PAS结构域

HIF-1α基因结构和定位
• 人HIF-1α基因位于14q21~24 • 由15个外显子和14个内含子组成 •编码826个氨基酸的蛋白
cDNA结构：

HIF-1 α：826氨基酸
bHLH A PAS B 2478bp ↓ 826aa
Pro564、Pro402
5’ -UTR ↑ 28bp
3’ -UTR
HIF-1 + DNA → DNA-蛋白复合体
抑制剂
蛋白激酶
P P
（丝/苏、酪）
DNA(w18) P + P
蛋白磷酸酶
（丝/苏、酪）
抑制剂
（二）HIF-1的羟基化与蛋白降解
特点： 1、多个蛋白酶——蛋白酶体(proteasome) 2、需先活化——泛素化、pVHL化、羟化 3、受O2调控——氧依赖性降解（ODD）
二、HIF-1的生物学活性特性



仅存在于缺氧细胞（核）中； – DNA结合活性受氧分压的严密调节； – CoCl2、DFX（desferrioxamine，一种铁螯合剂） 也具有诱导细胞粗提液产生DNA结合活性的特点； 无细胞特异性：各种哺乳细胞 – EPO产生（EPO-producing）细胞 – 非EPO产生（non-EPO-producing）细胞； 从头（de nove）合成：放线菌素D、放线菌酮可阻断 诱导作用。