树突状细胞培养方法
树突状细胞实验报告
一、实验目的1. 了解树突状细胞（Dendritic Cells，DCs）的基本特性及其在免疫调节中的作用。
2. 掌握DCs的分离、培养和鉴定方法。
3. 学习利用DCs进行免疫调节实验。
二、实验原理树突状细胞是机体免疫系统中重要的抗原提呈细胞，具有摄取、加工和呈递抗原的能力。
DCs在启动、调控和维持免疫应答中发挥着关键作用。
本实验通过分离、培养和鉴定DCs，探讨DCs在免疫调节中的作用。
三、实验材料1. 试剂：胎牛血清、RPMI 1640培养基、DMEM培养基、双抗、TNF-α、IL-4、抗鼠CD14抗体、FITC标记的羊抗鼠IgG抗体等。
2. 仪器：CO2培养箱、倒置显微镜、流式细胞仪等。
四、实验方法1. DCs分离与培养（1）取健康小鼠脾脏，置于DMEM培养基中，剪碎后用200目筛网过滤。
（2）将滤液加入含10%胎牛血清的RPMI 1640培养基，在37℃、5%CO2条件下培养。
（3）培养3天后，加入TNF-α和IL-4，继续培养至第7天。
2. DCs鉴定（1）收集培养的细胞，用抗鼠CD14抗体进行标记。
（2）用FITC标记的羊抗鼠IgG抗体进行二次染色。
（3）流式细胞仪检测细胞表面CD14的表达情况。
3. 免疫调节实验（1）将分离得到的DCs与抗原共同培养，观察DCs对抗原的摄取和呈递能力。
（2）将DCs与T细胞共同培养，观察DCs对T细胞的激活作用。
五、实验结果1. DCs分离与培养：培养7天后，观察到细胞形态呈树突状，符合DCs的形态特征。
2. DCs鉴定：流式细胞仪检测结果显示，细胞表面CD14的表达率为（95±3）%，说明成功分离出DCs。
3. 免疫调节实验：（1）DCs对抗原的摄取和呈递：在抗原刺激下，DCs能够摄取并呈递抗原，说明DCs具有抗原摄取和呈递能力。
（2）DCs对T细胞的激活作用：在DCs与T细胞共同培养条件下，观察到T细胞增殖，说明DCs具有激活T细胞的作用。
树突状细胞的体外培养及鉴定
【 关键 词】 外周 血 ； 核细 胞 ； 突状 细胞 ； 外扩增 单 树 体
【 中图分类号１ ３ ２ １ Ｒ ９．ｌ
【 文献标பைடு நூலகம்码】 Ａ
【 文章编号】０４ ６ ７ （０７ ０－ １３ ０ １０ － ８９２ ０ ）２ ０ － ３ ｌ
ＣＩ ＩＩ ＴＥ ＡＮＤ Ｉ Ｔ、 Ｄ ＤＥＮＴⅡ Ｄ ｏＦＤＥＮ ＲＩ Ｃ Ｄ ＴＩ ＣＥＬＬＳＩ Ｖ Ｔ Ｎ Ｉ ＲＯ
（． １河北 工程 学院 医学 院 ，河北 邯郸
０ ６２ ；２ 北 京大 学基 础医 学院 ） ５ ０９ ．
【 摘要】 目的： 建立树突状细胞 （ｅｄ ｉｃｃｌ ， ｓ体外培养的方法。 ｄｎ ｒ ｉ ｅ ｓＤＣ ） ｔ ｌ 方法： 从正常人外周血分离获得单
核细 胞 ， 入ｒ Ｇ 加 ｈ Ｍ—Ｃ Ｆｌ ０ Ｕ／ｎ 、ｈ Ｌ ４ ０ Ｕ／ 体 外培 养 。 培养 ７ 的细胞 ， Ｓ ０ ０ ｒｌｒ ｌ － ５ ０ ｍｌ 取 天 采用 免疫 细胞化 学方 法和流 式细胞仪 测定细胞表 型 ， 并对其 进行鉴 定。 结栗 ： 免疫细 胞化 学方 法显示 ，０／ ９ ￣以上 培养７ 的细胞表 ， ０ 天
Ｍ ｏ ｏ ｙ ｅ ｒ ｂ ａ ｎ ｄ ｆ ｏ ｎ ｒ ｌ ｕ ｎｐ ｒｐ ｅ ａ ｌ ｏ ｎ ｕ ｔ ａ ｅ ｎ ｖｔｏ ｗｉ ＧＭ － Ｆ １ ０ Ｕ／ ｎ ｃ ｔｓ ｗｅ ｅｏ ｔ ｉ ｅ ｍ ｏ ｍａ ｍａ ｅ ｈ ｒ ｌ ｏ ｄ ａ ｄｃ ｌ ｖ ｔｄ／ ｉ ｔ ｒ ｒ ｈ ｉ ｂ ｉ ｒ ｈ ｈ ＣＳ ０ ０
维普资讯
丞 堡 医
堂
堂 塑
ＶＯ ． ４ Ｎｏ． ２ ０ １２ ． ２ ０７
Ｊ ０ＵＲＮＡＬ ＯＦ ＨＥ Ｃ ＮＧＤＥ Ｍ Ｅ ＣＡＬ ＣＯＬ ＧＥ ＤＩ ＬＥ
树突状细胞培养方法
树突状细胞培养方法树突状细胞（Dendritic Cells，DCs）是一类免疫细胞，主要负责识别和激活T细胞，发挥着重要的免疫调节和抗肿瘤等作用。
为了进行树突状细胞的研究，科研人员需要对其进行体外培养。
本文将介绍常用的树突状细胞培养方法。
1.制备树突状细胞前驱细胞：树突状细胞前驱细胞主要存在于外周血和骨髓中。
首先，采集外周血或骨髓，并将其进行红细胞裂解。
然后，用PBS洗涤样品，离心沉淀细胞。
最后，将细胞进行培养。
2.培养基的选择：培养树突状细胞需要选择适宜的培养基。
目前常用的培养基有RPMI1640、DMEM等。
添加10-20%的胎牛血清（FBS）可以提供必要的生长因子和营养物质。
3.添加生长因子：在培养树突状细胞的过程中，可能需要添加一些生长因子来促进细胞的分化和增殖。
常见的生长因子包括GM-CSF（粒细胞巨噬细胞集落刺激因子）和IL-4（白细胞介素4）。
可以将这些生长因子添加到培养基中，以达到最佳生长条件。
4.细胞培养条件的控制：树突状细胞对培养条件非常敏感。
因此，需要对温度、湿度、CO2浓度等参数进行严格控制。
一般来说，将细胞培养在37摄氏度、5%CO2的培养箱中。
5.细胞的分离和传代：在树突状细胞培养过程中，细胞会不断增殖。
为了保证细胞的活力和稳定性，需要定期分离和传代细胞。
可以使用胰酶等消化酶将细胞从培养瓶中剥离，然后进行细胞计数并按照一定比例进行传代。
6.细胞质量的评估：在培养树突状细胞的过程中，需要对细胞质量进行评估。
可以通过使用流式细胞仪等设备来检测细胞表面标记物的表达情况，以及细胞活力、树突状突起的形态等指标来评估细胞的质量。
7.树突状细胞的激活：树突状细胞的主要功能是激活T细胞。
为了使树突状细胞具备充分的抗原递呈能力，可以使用多种促进细胞激活的方法，如脂多糖、TNF-α等。
总结：树突状细胞培养方法包括制备前驱细胞、培养基选择、生长因子添加、细胞培养条件控制、细胞分离和传代、细胞质量评估以及细胞的激活等步骤。
小鼠骨髓源树突状细胞的体外培养及鉴定
源 的未 成 熟 和 成 熟 Ｄ Ｃ．
［ 关键词］树突状细胞 ；小 鼠；近交系 ；骨髓 细胞 ；吞 噬作用
［ 中图分类号］Ｒ ３ ２ ２ ． ２［ 文献标识码］Ａ ［ 文章编号］２ ０ ９ ５ －６ １ ０ Ｘ （ ２ ０ １ ３ ）１ １ －０ ０ ０ ５ －０ ４
Ｃｕ ｌ ｔ ｉ ｖ ａ ｔ ｉ ｏ ｎ ａ ｎｄ Ｉ ｄｅ ｎｔ ｉ ｉｃ ｆ ａ ｔ ｉ ｏ ｎ ｏ ｆ Ｄｅ ｎｄ ｒ ｉ ｔ ｉ ｃ Ｃｅ ｌ ｌ ｓ ｆ ｒ ｏ ｍ Ｍｏ ｕｓ ｅ Ｂｏ ｎｅ Ｍａ ｒ ｒ ｏ ｗ ｉ ｎ Ｖｉ ｔ ｒ ｏ
Ｗ ＡＮＧ 一 ｙ ｉ ｎ”， ＣＨＥＮ Ｒｕ ｉ ”， Ｗ ＡＮＧ Ｊ ｕ ｎ ，Ｓ Ｕ Ｘｉ ａ ｏ — ｓ ａ ｎ”， Ｚ ＨＡＮＧ Ｌ ｅ ｉ ”
（ １ ）Ｂ ｉ ｏ ｍ ｅ ｄ ｉ ｃ ａ ｌ Ｒ ｅ ｓ ｅ ａ ｒ ｃ ｈ Ｃ ｅ ｎ ｔ ｅ ｒ ，Ｔ ｈ ｅ Ａ ｆ ｉｌ ｆ ｉ ａ ｔ ｅ ｄ Ｃ ｌｍ ａ ｅ ｔ ｔ ｅ Ｈｏ ｓ ｐ ｉ ｔ ｌ ａ ｏ ｆＫｕ ｎ ｍｉ ｎ ｇ Ｍｅ ｄ ｉ ｃ ａ ｌ Ｕ ｎ ｉ ｖ ｅ ｒ ｓ ｉ ｔ ｙ ，Ｋｕ ｎ ｍｉ ｎ ｇ Ｙ ｕ ｎ ｎ ａ ｎ ６ ５ ０ ０ １ １ ； ２）Ｄ ｅ ｐ ｔ ． ｆＡ ｏ ｎ ｅ ｓ ｔ ｈ ｅ ｓ ｉ ｏ ｌ ｏ ｇ ｙ ，Ｔ ｈｅ Ｉ ｓ ｔ Ａ ｆ ｉｌ ｆ ｉ ｔ ａ ｅ ｄ Ｈｏ ｓ ｐ ｉ ｔ ａ ｌ ｆＫ ｏ ｕ ｎ ｍ ｉ ｎ ｇ Ｍｅ ｄ ｉ ｃ ａ ｌ Ｕ ｎ ｉ ｖ ｅ ｒ ｓ ｉ ｔ ｙ ， Ｋｔ ｍｍｉ ｎ ｇ Ｙ ｕ ｎ ｎ ａ ｎ ６ ５ ０ ０ ３ １ ，Ｃ ｈ ｉ ｎ ａ ） ［ Ａｂ ｓ ｔ ｒ ａ ｃ ｔ ］ Ｏｂ ｊ ｅ ｃ ｔ ｉ ｖ ｅ Ｔ ｏ ｅ ｓ ｔ ａ ｂ ｌ ｉ ｓ ｈ ａ ｍｅ ｔ ｈ ｏ ｄ ｏ ｆ ｃ ｕ ｌ ｔ ｉ ｖ ａ ｔ ｉ ｏ ｎ ｏ ｆ ｄ ｅ ｎ ｄ ｒ ｉ ｔ ｉ ｃ ｃ ｅ ｌ ｌ ｓ（ ＤＣ ） ｆ ｒ ｏ ｍ ｍｏ ｕ ｓ ｅ ｂ ｏ ｎ ｅ ｍ ａ ｒ ｒ ｏ ｗ
小鼠骨髓来源树突状细胞(BMDC)培养
小鼠骨髓来源树突状细胞（BMDC）的培养1、取骨髓，对倍稀释2、用滴管沿管壁缓慢加入淋巴细胞分离液(45度角倾斜，尽量产生气泡，起到缓冲作用)3、2000转，离心30分钟4、吸取白膜层，（沿管壁）交替多次吸取，加入5倍体积以上的PBS液5、1500转，离心15分钟（洗掉血小板）6、弃掉上清，留少许回流液，轻弹管壁，加入PBS液至50ml7、800转，离心10分钟，（洗掉红细胞）8、重复两至三次9、加入PBS液至50ml，计数:？个细胞离心后铺板，1X1076孔板培养液，共铺20板。
无血清1640+DNA酶12h后轻晃培养液，洗板后加入完全培养基和GM—CSF(1000U/ml)和IL—4(500U/lml) 10、第三天每孔补加等体积的完全培养基和GM—CSF(1000U/ml)和IL—4(500U/lml) ，这时细胞部分悬浮11、第五天为imDC，+1LPS(1ug/ml),诱导至第七天，为mDC。
参考Inaba等人的方法，并根据本实验室的经验稍作改进。
即：1. 颈椎脱位法处死C57BL/6小鼠，无菌状态下取股骨和胫骨，浸泡在RPMI-1640培养基中。
2. 用1ml注射器吸取RPMI-1640培养液，从骨干的一端刺入骨髓腔，将骨髓冲洗到一无菌培养皿中，每根骨头反复4～6遍，收集培养皿中的骨髓细胞悬液，离心，1500 rpm×10min。
3. 弃去上清，加入5 ml无菌Tris-NH4Cl溶液悬浮细胞溶解红细胞，于室温下静置2分钟溶解红细胞后，再次离心，1500 rpm×5min，弃上清。
4. 用RPMI-1640培养液洗涤后将细胞用完全培养基悬浮，分至6孔培养板中，并在每孔中加入完全培养基至4 ml，再加入rmGM-CSF至终浓度10 ng/ml，IL-4终浓度10ng/ml。
5. 将细胞培养板放入37℃，含5% CO2的孵箱中培养48小时。
6. 轻轻吹打细胞后，连同培养液一起吸去悬浮细胞，仅保留贴壁细胞。
大鼠骨髓树突状细胞的分离和培养
大鼠骨髓树突状细胞的分离和培养杨贺勤;张震宇【期刊名称】《现代妇产科进展》【年(卷),期】2009(18)7【摘要】目的:探讨体外分离和培养大鼠源性树突状细胞的方法,及其经卵巢肿瘤提取物致敏后在体内诱发抗肿瘤免疫效应。
方法:(1)取大鼠骨髓悬液,经Tris-NH4Cl裂解红细胞后得到大鼠骨髓单个核细胞;(2)应用大鼠重组粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(rrGM-CSF)、大鼠重组白细胞介素4(rrIL-4)、大鼠重组肿瘤坏死因子-α(rrTNF-α)进行体外培养;(3)培养第5天时加入NuTu-19 Fischer 344大鼠卵巢肿瘤细胞提取物,获得负载卵巢肿瘤提取物的树突状细胞;(4)体内实验检测DC诱发抗肿瘤免疫效力。
结果:(1)大鼠骨髓来源的骨髓单个核细胞(bone marrow mononuclear cells,BMMNC)在相关细胞因子作用下可培养出成熟的树突状细胞;(2)体内实验表明,预先免疫的大鼠肿瘤出现时间较晚,肿瘤生长速度较慢,与对照组有显著差异(P<0.05),抑瘤率59.4%;治疗组大鼠在实验过程中肿瘤体积小,最终肿瘤质量轻,与对照组有显著差异(P<0.05),与先行免疫组无明显差异(P>0.05),抑瘤率69.3%。
结论:大鼠骨髓来源的BMMNC可培养出成熟的树突状细胞。
DC可负载并提呈肿瘤提取物,体内实验显示肿瘤提取物致敏的树突状细胞可以杀伤肿瘤细胞。
【总页数】4页(P486-489)【关键词】树突状细胞;大鼠,近交F344;肿瘤提取物;细胞培养【作者】杨贺勤;张震宇【作者单位】首都医科大学宣武医院妇产科;首都医科大学附属北京朝阳医院妇产科【正文语种】中文【中图分类】R737.33【相关文献】1.大鼠骨髓来源树突状细胞的体外分离培养鉴定初步研究 [J], 黄江波;罗志刚;刘宇明;刘利;何群君;言彩红;李建军;龙向阳2.大鼠骨髓来源树突状细胞的分离、培养及鉴定 [J], 张升宁;李立;冉江华;邵剑春;李铸;刘静3.大鼠骨髓树突状细胞的分离培养及HMGB1/TLR4信号通路的调控作用 [J], 王涵磊;薛继阳;葛捍伟;夏杰;林炜;赵琦峰4.大鼠骨髓树突状细胞的体外分离培养及生物学特性研究 [J], 叶建新;陈卫昌;黄小平;高楠5.大鼠骨髓树突状细胞的分离培养及HMGB1/TLR4信号通路的调控作用 [J], 王涵磊;薛继阳;葛捍伟;夏杰;林炜;赵琦峰;因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
小鼠树突状细胞(DC)培养
8．加入树突细胞培养液重悬细胞，调整细胞数至1×106/ml(Scepter自动细胞计数器,美国Millipore公司)，按2ml/孔接种至12孔细胞培养板（4.5cm2/孔），置37℃、5%CO2孵箱培养。
9．于培养第3，5天每孔分别更换2ml树突细胞培养液。第6天收集悬浮细胞，流式抗体染色后，流式细胞仪检测树突状细胞的表型。
1.4.4 红细胞裂解液pH7.2（1L）：
NH4CL 8.56g
Tris碱 2.059g
MilliQ水定容至1L 调节pH至7.2
1．处死BALB/c小鼠并浸泡于75%医用酒精10min，随后取小鼠股骨及胫骨并用眼科剪剔除附着在骨骼上的肌肉。
2．剪掉两侧股骨头，将吸满PBS缓冲液的注射器针头插入骨腔中，并缓慢推动注射器冲洗骨髓腔，直至骨变白。
3．将收集到的骨髓细胞悬液500×g离心5mim，弃上清。
4．向骨髓细胞沉淀中加入红细胞裂解液并反复吹打混匀，置37℃孵箱孵，吸弃上清。用PBS重悬细胞沉淀，200钼铜网过滤除去骨髓细胞悬液中组织碎块。
6．用1ml PBS缓冲液重悬细胞，加入功能纯化抗体抗-小鼠CD4/CD8a/ MHC-Ⅱ/CD45R及兔血清补体，37℃孵育1h，以去除T淋巴细胞、B淋巴细胞及MHC-Ⅱ+细胞。(功能纯化抗体抗-小鼠 CD4(L3T4)、CD8a(Ly-2)、CD45R(B220)、MHC-Ⅱ（I-A/I-E）抗体购自eBioscience公司)
bmdc培养方法
bmdc培养方法BMDC培养方法是一种常用的小鼠树突状细胞(Dendritic Cell, DC)培养方法，主要用于研究DC的功能和调控机制。
以下是关于BMDC 培养方法的详细介绍：1. 实验材料准备：小鼠骨髓细胞RPMI-1640培养基小鼠GM-CSF(粒细胞巨噬细胞集落刺激因子)和IL-4(白细胞介素-4)无菌培养箱、离心机、显微镜等实验设备2. BMDC的获取：从小鼠的股骨和胫骨中提取骨髓细胞，用RPMI-1640培养基洗涤并悬浮。
将骨髓细胞以1×10^6/mL的密度接种到无菌的培养瓶中，加入GM-CSF和IL-4，使其终浓度分别为50ng/mL和20ng/mL。
将培养瓶置于37℃，5%CO2的培养箱中，每两天更换一次培养基。
3. BMDC的成熟：在BMDC培养的第5天，用GM-CSF和IL-4继续诱导BMDC的成熟。
此时，GM-CSF的浓度可以降低至25ng/mL，而IL-4的浓度可以维持在20ng/mL。
在BMDC培养的第7天，观察BMDC的形态变化，成熟的BMDC 呈树突状，表面有丰富的毛刺状突起。
此时，可以收集成熟的BMDC 进行后续实验。
4. BMDC的功能检测：将成熟的BMDC与抗原提呈细胞(如B细胞、T细胞等)共培养，观察BMDC对抗原提呈细胞的激活作用。
将成熟的BMDC与特异性抗体结合，观察BMDC对抗原的识别和摄取能力。
将成熟的BMDC与免疫细胞(如T细胞、NK细胞等)共培养，观察BMDC对免疫细胞的调节作用。
5. BMDC的应用：用于研究DC的功能和调控机制，如DC的抗原提呈、共刺激信号传导、凋亡抑制等。
用于制备疫苗，通过激活T细胞和B细胞，提高机体对病原体的免疫力。
用于研究免疫耐受、自身免疫性疾病等疾病模型。
总之，BMDC培养方法是一种常用的小鼠树突状细胞培养方法，通过诱导骨髓细胞分化为成熟的树突状细胞，可以用于研究DC的功能和调控机制，以及制备疫苗等应用。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
2.2.4 小鼠骨髓源性树突状细胞的培养
1）颈椎脱位法处死健康雄性4到6周龄的BABLIc小鼠，75％乙醇浸泡10分钟。
2）无菌条件下取双侧股骨、胫骨，剥离附着的肌肉软组织后浸泡在75%乙醇中2分钟。
RPMI1640冲洗，剪开骨的两端，1 ml 注射器抽取RPMI1640，分别从骨两端插入骨髓腔反复冲洗直至变白，RPMI1640清洗骨髓细胞后重悬。
3）在离心管中预先加入小鼠脾淋巴细胞分离液，将相同体积的骨髓细胞悬液小心加入淋巴细胞分离液上层，不打乱两层液体界面。
4）4℃，1500rpm离心7min后吸取中间白膜层，PBS清洗所获的单个核细胞。
5）BMDC完全培养液重悬后，以2×106每孔的浓度分种至6孔培养板中，每孔4ml完全培养基。
6）将细胞培养板放入37℃，含5%CO2的培养箱中培养6小时。
7）弯头滴管轻轻吹打，连同培养液一起弃去悬浮细胞，仅保留贴壁细胞；加入新鲜完全培养基和500 U/ml的rmGM-CSF及rmIL-4继续培养。
8）隔日半量换液，补加相同浓度细胞因子，尽量保留悬浮细胞。
9）培养至第6天，轻轻吹打收集所有悬浮细胞，即为未成熟的BMDC。
10）诱导培养过程中每天观察细胞集落及形态变化并拍照。
11）流式检测所诱导的未成熟BMDC表面分子CD11c的表达以评估BMDC 的纯度。
收集培养至第6天的BMDC，PBS洗2次，1×106个细胞用冷的Buffer （PH7.2的PBS+150mMNacl+ 0.09%NaN3+0.2%BSA）100µL悬浮。
加入3µL FITC-CD11c，对照管加入PBS，4℃冰箱避光反应45min。
Buffer洗2次，弃上清，500µL 1%多聚甲醛固定。
送第四军医大学流式细胞室上机检测。