下游层析工艺中热原的去除
酸碱处理去除血液制品中热原工艺的探索
酸碱处理去除血液制品中热原工艺的探索
酸碱处理是一种常用的血液制品去除热原的工艺方法。
热原是血液中的一种物质，它的存在会对血液制品的存储和使用带来一定的风险。
探索酸碱处理去除血液制品中热原的工艺是非常重要的。
酸碱处理是通过改变血液中的pH值来去除热原。
热原在酸性条件下易于发生变性，而在碱性条件下则容易被去除。
这是因为热原是一种具有酸性的蛋白质，当pH值低于其等电点时，热原会发生凝聚和沉淀，从而被去除。
在进行酸碱处理之前，首先需要确定适宜的处理条件。
这包括酸碱处理的时间、温度和浓度等因素。
实验结果表明，当血液制品在pH值为3-4的酸性条件下处理30分钟以上，或在pH值为8-9的碱性条件下处理60分钟以上，可以有效去除热原。
酸碱处理的具体步骤如下：将待处理的血液制品与适量的酸或碱溶液混合，使其达到所需的pH值。
然后，将混合液进行搅拌，以保证酸碱溶液充分与血液制品接触。
接下来，根据需要的处理时间，将混合液保存在适当的温度下进行处理。
将处理后的混合液进行离心或过滤，去除沉淀和杂质，得到去除热原的血液制品。
酸碱处理方法的优点是简单易行，成本较低。
它可以有效去除血液制品中的热原，提高其质量和安全性。
酸碱处理也存在一些缺点。
酸性条件下容易引起蛋白质的变性，可能降低血液制品的活性。
酸碱处理还需要进行严格的控制和监测，以避免对血液制品的其他成分产生不良影响。
酸碱处理去除血液制品中热原工艺的探索
酸碱处理去除血液制品中热原工艺的探索随着人们对健康的重视，血液制品的需求量逐年增加，使得血液制品行业的发展变得越来越重要。
然而，血液制品中含有多种热原性病原体和热力敏感性的成分，必须采取相应的处理方法进行去除，以保障人体安全。
本文将重点探讨酸碱处理去除血液制品中热原的技术。
酸碱处理技术是一种较为成熟的热原处理方法，其基本原理是通过改变血液制品中的PH值，使病原体失去配体而失活。
一般情况下，对于烽原灰有辨识的血浆制品，可以采用酸碱处理来去除病原体。
酸碱处理的一般流程是将血浆制品经过过滤和预处理后，加入适量的碱液或酸液，然后进行摇晃或搅拌，使其充分混合。
处理时间根据不同的病原体而异，可以在15~30分钟之间。
达到一定的处理时间后，再进行中和处理，去除多余的酸碱液体。
最后，进行再过滤和最终制品的加热灭菌处理。
该方法在许多血液制品的生产过程中，已经被广泛应用。
酸碱处理技术最大的优势在于，不需要明确的热原辨识无法处理的情况下，可选用酸碱处理对热原进行去除。
另外，该方法不会对血浆制品的活性成分造成太大的损失，同时也不会对人体产生危害，更可靠和安全。
因此，随着生物技术的不断进步，对于一些难以识别和处理的热原，酸碱法可以成为一种常用的处理方法。
然而，酸碱法也存在一定的缺点和不足。
首先，无法去除所有的热原，且对不同的热原有不同的效果，需要针对性的选择酸碱液来处理，工艺复杂。
其次，酸碱处理可能会影响部分蛋白质成分的活性，存在一定的损失。
此外，如果处理时间不够充分，则病原体可能不能被完全去除，对人体仍然存在一定的危害。
综上所述，酸碱法作为热原处理方法之一，其特点和优缺点需综合考虑，根据血液制品的实际情况进行选择。
可以结合其他的热原处理方法，如紫外线消毒和过滤等，提高热原处理的效果和安全性。
在行业标准体系的不断完善下，相信该领域的工艺技术还有很好的发展前景。
注射剂除热源
注射剂除热源1，去除热源是注射剂工艺很重要也很麻烦的一个问题，很多药厂因此而返工甚至废料。
所以用什么方法，什么设备十分重要。
2，用微滤（0.22um) 除热源不适宜, 但是有在微滤的膜上带上正电荷, 能够去除4~5个LOG 的大肠杆菌内毒素. 但是该方法使用时要注意, 您的主药成分不能是和热源一样, 在该PH 条件下带负电, 否则您就含量不合格了. 相应的产品有相应的FDA 认可的验证文件(4~5个LOG). 它目前用在纯水制备的最后一道工序, 紫外线消毒后同时去除细菌和热源, 效果很好. 国外和国内均有不少应用.3, 目前世界上唯一经FDA 认可的具有相应验证文件的产品是日本旭化成生产的6K 的中空纤维膜柱, 从实验室但Pilot 到生产规模全有产品. 但是使用该产品的前提条件是你的产品API 不能是大分子物质, 比如蛋白, 如果分子量小于2K, 最好是1000道尔顿以下最好, 所以他适合于中药注射剂或者化学药注射剂的去除热源. 目前国内有厂家应用.4, 用超滤膜包去除热源, 需要试验. 因为您的样品污染热源的主要分子量分布和您的产品是有关系的, 到底主要分布在多少分子量范围, 而且是强致热的成分? 您需要实验, 然后选择合适的切割分子量的膜包也是可以的, 要是您的热源分子量分布和您的目标物质分子量近似, 那是您的不幸! 您就不能选择这样的方法. 国内用的比较多的是小分子物质去除热源, 比如用10K 的膜包去除胸腺肽的热源. 我还遇到过用1000K 去除热源的生产例子.5, 比较有效的方法还有层析法, 上文Chromatography 已经有介绍. 该方法如果选择好的话, 应该非常有效. 唯一遗憾的是价格可能高一点, 但是还是可以接受的.6, 活性炭当然是除热源的方法之一, 但是有2个问题:a,在低温下的去除热源是很不靠谱的. 你需要验证, 不能仅凭一次结果断定. 活性炭的吸附热力学是与温度很有关系的. 我个人认为低温下是很难有效的.b, 它吸附热源的时候同时吸附API 或者目标物质, 你的损失会很大. 要是您的API 不值钱, 那也罢了, 就象大输液那样, 谁也不在意Glucosi 的被吸附.注射剂除去热原的方法2011-01-25 17:10 【大中小】【我要纠错】1. 除去容器、用具上热原的方法①高温法：凡能耐受高温处理的容器、用具，如注射用玻璃针筒及其他玻璃容器，在洗净后于250℃加热半小时以上，可有效地破坏热原。
如何去除注射液中的热原
如何去除注射液中的热原如何去除注射液中的热原，注射剂中原料、辅料、溶剂、容器具等由于各种原因均有可能被细菌污染，常用的热原去除方法如下。
(1)清洗与清洁容器可以通过充分清洗干净和灭菌，以减少微生物及热原的污染。
特别是暴露（开口）工序如配制、洗、灌、封等岗位，容器具清洁消毒不严格会产生热原。
(2)高温法凡能经受髙温加热处理的容器、管道、粗滤器、生产用具等可高温除去热原。
①针头、针筒或其他玻璃器皿，在洗净后，于250°C加热30min以上，可破坏热原。
②安瓿瓶一般红外加热300°C、15min以上，可破坏热原。
③粗滤器等及时洗净并煮沸灭菌，及时除去微生物，以防止热原的污染。
④不锈钢容器及管道可通入纯蒸汽消毒15～30min。
(3)酸碱法一些可拆卸的连接管道、针筒、活塞、器具药液冲净后，淋干，可用新鲜的重铬酸钾硫酸清洗液或强碱液浸泡0.5h以上，可将热原破坏。
重铬酸钾浓硫酸清洁液可以碳化一切有机物，所以热原亦能被强氧化剂破坏，但必须清洗干净，否则对易氧化药物容易引起色泽等方面的变化。
(4)吸附法活性炭具有吸附热原、脱色、助滤等作用。
配制时可加入0.1%～0.5%(质量分数）的活性炭，煮沸并搅拌15min左右，可去除大部分热原。
对于抗生素生产特别有用，因为发酵过程可以导致严重的热原污染。
但加人活性炭后吸附热原的同时也吸附注射剂中有效成分。
活性炭的加人量可根据注射剂中热原污染程度及其产品分子结构的不同酌情加入并且需延长活性炭吸附热原的时间、提高吸附热原的温度，吸附后必须根据检验的产品含量考虑投料量。
（5）离子交换法离子交换树脂可去除药液或溶剂中热原，热原大分子中含有磷酸根与羧酸根，带有负电荷，易被强碱性阴离子交换树脂交换吸附，吸附热原效果较好。
强酸性阳离子交换树脂除去热原的能力很弱。
因此常用强碱性阴离子交换树脂吸附热原。
此种方法必须具有离子交换柱、离子交换树脂，在应用过程中不方便，因此不常用。
注射剂除去热原的方法
注射剂除去热原的方法在注射剂的生产小除去与防止L热原．应在配液前严格控制注射用水、原料的质量以及容器、用具等不得含有热原。
在配液的操作规程中，应加强防止污染。
一旦药液污染热原尚无理想的处理办法，即使加以处理也很不经济，成品也不理想：除去热原一般用以下方法：1．高温法凡能经受高温加热处理的容器、用具如玻璃器皿等，在洗涤干燥后，于250℃加热30min以上，可以破坏热原。
2．酸碱法玻璃容器、用具用重铬酸钾硫酸清洁液浸泡处理或用稀氢氧化钠溶液煮沸半小时以上．可将热原破坏，但碱法使用过久会损坏玻璃的透明性。
3．吸附法常用的吸附刑为活性炭，活性炭对热原有较强的吸附作用，同时有助滤、脱色作用，所以在注射液中使用较广。
常用量为o．1％----o．2％．个别品种可增加至0．5％，视热原量多少而定。
活性炭吸附法，适合于无机盐类、高分子溶液、蛋白类等注射液,此外还可用活性炭与白陶土合用除去热原c 4．超滤法用于超滤的薄膜一般要控制其孔径在50—500A之间，而且在操作时要严格注意过滤时的温度与压力。
日本专利用超滤膜过滤10％-------15％葡苗糖溶液，采用市售的KP—00滤器，在10kg／cm2血压力下过滤，可以除去热原。
也有报道认为采用CA——1或CA——3型膜超滤制备中草药注射剂(不加活性炭处理)，除热原是可靠的。
5．离子交换法国内有用301#弱碱性阴离子交换树脂10％与122#弱酸性阳离子交换树脂8％成功地除去丙种胎盘球蛋白注射液中的热原。
6．凝胶过滤法国内有用—乙氨基蓟聚糖凝胶(分子筛)成功地制备了无热原去离了水。
7．其他方法热原的耐热性是相对的，这与热原的种类、加热温度与受热时间、介质条件等均有关。
热原在水件介质中加热或不加热放置后，其活性都有不同程度的降低。
在酸性和碱性介质中比在中性介质中更不稳定。
有报道，采取二次以上灭菌或适当地提高灭菌温度和延长灭菌时间，处理含有热原的葡萄糖注射液、甘露醇注射液等而能得到热原合格的产品。
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干扰素 ,用 SP Sepharose FF 阳离子交换层析做第 一步纯化 , > 90 %内毒素出现在穿透峰内 ,干扰 素活性峰内的内毒素含量减少约 150 倍[9] 。
(5) 若使用阴离子交换介质 ,大部分内毒素 和目标蛋白一起结合在柱上 ,可根据两者电荷性 质的差异 ,用梯度或不同洗脱液分开 。如人重组 超氧物歧化酶的下游纯化主要是以 Q Sepharose
表 1 重组外毒素糖蛋白 LysPE338 的下游纯化及热原 、核酸的去除
纯化步骤
层析方法/ 层析柱 (内径 mmΠ高度 mm)
LysPE38 纯度
核酸含量 (pg)
内毒素含量 ( EU)
LysPE38 澄清萃取液
< 10 %
12000
DEAE Sepharose Fast Flow
阴离子交换 BPG 100Π10 柱
价金属离子的螯合机会 ,从而降低内毒素的聚合 程度 。内毒素磷酸基团的 p Ka 约为 6 ,在 pH8 以
离子交换层析的速度快、载量高 、浓缩效应 上基本上失去螯合能力 。所以偏碱性 pH8 缓冲
好 ,在早期下游纯化中担当重要角色 。一般而 液 ,更 有 利 于 内 毒 素 与 阴 离 子 交 换 介 质 的 结
一途径是稍微提高缓冲液的电导 ,使目标蛋白直 接穿透 ,大部分内毒素仍然结合在介质上 。
(4) 内毒素不结合阳离子交换介质 ,目标蛋 白可用阳离子交换介质结合 ,使大部分内毒素直 接穿透 。如以大肠杆菌包涵体形式表达的重组
要利用离子交换层析除热源 ,主要应注意如 何降低内毒素的聚合 ,如 :
(1) 在样品中加入少量尿素或非离子表面活 性剂 ,可降低内毒素的聚合 ,待样品中的内毒素 与阴离子交换介质结合后 ,目标蛋白可用不含尿 素或表面活性剂的洗脱液洗脱 。
(3) 因药审对蛋白质类生物制品的多聚体含 量有严格规定 ,下游纯化最后一步常用凝胶过滤 层析去除多聚体 、同时去除残留的热原 、核酸等 杂质[4] 。rhGM2CSF 的最后一步凝胶过滤层析用 Superdex 75 PG将内毒素含量减少 1615 倍 ,达到 药审要求[13] 。
(4) 注意 :采用流速慢的介质 ,层析时间长 ,
子交换层析已用于生物制品除热源[21] ,之后的 再洗脱 ,有助内毒素在介质上的竞争性吸附 。另
许多成功例子使之成为最常用的除热源方法之 一[15] 。但是由于内毒素的不均一性 , 此方法也 并非万无一失 。如高分子量 ,结构近似脂膜或脂 囊的内毒素 ,电荷不暴露在外 ,则无法与阴离子 交换介质结合 。
内毒素含量 ( EU)
579
疏水层析
315
阴离子交换
116
凝胶过滤
8814
781200 405 87 84
1827140 155620 213840 9405
内毒素减少倍数
815 114 1615
4 凝胶过滤层析去除内毒素
要用凝胶过滤层析去内毒素 ,先要了解到内 毒素结构受所在环境的亲水性 、离子强度 、pH、样 品浓度等多种参数影响 ,分子量分布由数万至数 千万不等 ,以下几点可供参考 。
第4期
陈昕 :下游层析工艺中热原的去除
103
夏季容易受热原污染 。最好隔数小时便更换一 次新鲜的无热原缓冲液 。当然 ,更理想的是考虑 改用新一代流速快 、易清洗的凝胶过滤介质如 Superdex 。
5 反相层析去除内毒素
反相层析介质的基架疏水性很强 ,可吸附内 毒素的类脂 A 区 。在重组人白介素 2 (rhIL22) 纯 化中 ,最后一步反相层析是最有效的除热原步 骤 。不过 ,反相层析所用的有机试剂 ,可能影响 到蛋白质的活性 ,所以不常被用于下游纯化 。
要从生物产品中去除内毒素 ,首先需要进一 步了解内毒素的性质 。高纯度内毒素属脂多糖 类 (LPS) ,含三个不同的化学区 :包括内层的 ,引 起热原反应的类脂 A 区 ,核心多糖区 ,和特异性 多糖链区 。内层和中层含许多磷酸基和酸基 ,所 以内毒素带负电 (图 1) ,在天然状态下 ,也含蛋 白质 。单从结构上看 ,内毒素和蛋白质的物理和 化学性质 ,包括分子量 、电荷性质疏水性等 ,是有 很大差异的 。那么为什么多种去除内毒素的方 法效果往往未如理想 ? 研究发现 ,内毒素的一端 的特异性多糖区是亲水的 ,而另一端的类脂 A 区 则是疏水的 ,结构上类似表面活性剂 。内毒素一 般以聚体形式存在 ,在亲水环境中还可形成双层 脂膜或脂囊 。内毒素的磷酸基团和二价金属离 子螯合 ,可进一步稳定内毒素分子间的聚合 ,促 成更大的内毒素复合体 ,所以分子量可由几千至 数千万不等[8] 。正是由于内毒素的性质极不均 一 ,生产者们难以找到一个简单或通用的去热原 方法 。更令人头疼的是 ,带负电的内毒素还可以 和带正电的生物分子 ,如碱性蛋白 ,形成稳定的 复合体 。即使内毒素被酶解 ,剩下的脂肪 A 部份
3 电子信箱 :crystal . chan @hk. amershambiosciences. com
1 内毒素的性质
内毒素在高温 、强酸 、强碱下都颇稳定 。传 统的加热 、蒸馏 、过滤 、反相渗透 、活性碳粉 、各种 柱层析方法能去除或灭活部分内毒素 。令生产 人员头痛的是 ,多数方法都很难将内毒素一次性 彻底去除 ,甚至经过多个步骤后 ,仍达不到最终 药审的要求 ,而面临整批产品报废的危险 。
言 ,内毒素比蛋白质在阴离子交换介质上的结合 合[19] 。
强很多 ,分子量越小的内毒素结合得越强 ,多数
(3) 绝大多数蛋白所带的负电荷都没有内毒
要在柱再生 (1M 氯化钠) 或在位清洗 (1M 氢氧化 素所带的强 ,增加样品在阴离子交换介质上的结
钠) 时才从介质上洗脱下来 。早在 1975 年 ,阴离 合时间 ,如降低上样流速或上样后停滞一段时间
第 22 卷第 4 期
中 国 生 物 工 程 杂 志
JOURNAL OF CHINESE BIOTECHNOLOGY
2002 年 8 月
下游层析工艺中热原的去除
陈 昕 3
(安玛西亚中国有限公司 北京 100044)
摘要 各国药审部门对于生物药品中热原物质的含量都有严格要求 。较主要的热原是内毒 素 。由于内毒素性质极不均一 ,给除热原的工作带来不少挑战 。通过分析内毒素在不同环 境下的化学 、物理性质 ,对于如何在下游层析工艺中去除热原 ,提出了多种方法和建议 。 关键词 热原 内毒素 脂多糖 离子交换层析
(1) 在接近生理环境 ,或是亲水缓冲液中 ,内 毒素可形成类似脂膜或脂囊的高聚合物 ,分子量 超过 1000ku ,远大于一般蛋白质纯化的凝胶过滤 介质的分离范围 ,所以容易被去除 。
(2) 当缓冲液中的二价离子如钙 、镁等被去 除时 ,内毒素的脂膜结构破裂 ,形成分子量 300ku
～1 ,000ku 的聚体或胶束 ,表面活性剂可令之进 一步裂解成小于 20ku 的分子 ,分子量较接近蛋 白质 。这时需选择分辨率高 、分离范围窄的介质 如 Superdex、Sephacryl 等才能把热原与目标蛋白 质分开 。分子量小于 10ku 的内毒素没有热原性 质[1] 。
纯化步骤
RhGM2CSF 包涵体复性后样品 Phe Sepharose 6 Fast Flow (hs) DEAE Sepharose Fast Flow Superdex75 Prep Grade
表 2 rhGM2CSF 的下游纯化及热原 、核酸的去除
层析方法
总蛋白量 (mg)
核酸含量 (pg)
Abe =β2脱氧岩藻糖 ;Man = 甘露糖 ;Rha = 鼠李糖 ; Gal = 半乳糖 ; Glc = 葡萄糖 ; Hep = 庚糖 ; KDO = 脱氧2D2甘露辛酮糖酸 ;
○P = 磷酸盐 ; EtN = 乙醇胺 ;M = 豆蔻酸 ;Mo =β2羟基豆蔻酸
2 离子交换层析最常用的去内毒素方法
生物产品中的热原 ( Pyrogen) 泛指能引起哺 乳类动物发烧反应的物质 。为确保产品安全性 必须尽量去除 (Depyrogenation) [1] 。热原的种类很 多 ,较主要的是内毒素 ( Endotoxin) ,是一种脂多 糖 ,(Lipopolysaccharide 简称 LPS) ,来源于革兰氏 阴性 细 菌 外 膜 , 细 菌 死 亡 或 分 解 后 被 释 放 出 来[2] 。各国药审部门均对生物产品中的内毒素 含量 有 严 格 规 定 。美 国 食 品 与 药 物 管 理 局 (FDA) 规定每剂生工药品的内毒素含量必须少 于 5EUΠKg 病者体重 。许多生物工程药物由革兰 氏阴性细菌如 E. coli 表达 ,细胞破碎后 ,样品已 含大量内毒素[3] 。即使起始样品本身不含内毒 素 ,也可能由环境或操作过程受到热原污染 。
3 疏水层析去除内毒素
前面提到 ,内毒素的类脂 A 部份有很强的疏 水性 ,但疏水层析需用高盐缓冲液平衡 ,内毒素 在高盐下容易凝集 ,大都不结合疏水层析介质 。 只要选择适合的疏水层析介质结合目标蛋白 ,大 部份内毒素 、核酸会在上样时直接穿透而被去 除 。在重组人粒细胞2巨噬细胞集落刺激因子 (rhGM2CSF) 下游纯化中 ,第一步疏水层析令内毒 素及核酸含量大大减少[13] (表 2) 。
约 25 %
820
214 ×106
Phe Sepharose 6 Fast Flow ( hs)
疏水层析 BPG100Π15 柱
63 %
118
810 ×105
阴离子交换
Q Sepharose High Performance
BPG100Π10 柱
> 99 %
6
10
Superdex75 Prep Grade
目前美国 FDA 和国内药审部门主要采用将 样品注射入家兔 , 测量其体温的家兔法 (U. S. Pharmacopeia rabbit test ) [5] 及 鲎 试 剂 法 (Limulus amebocyte lysate test 简称 LAL test) [6] 检 测 热 原 。 前者可检测 ng 级的内毒素和其它热原物质 ,但 因家兔的种类 、抵抗力的差别引至测试结果的偏 差 。后者可检测 ng 级以下的内毒素 ,但无法检 测内毒素以外的热原物质[1] 。所以 ,通过了鲎试 剂检测的产品有时仍不能通过家兔检测 。极少 数专引起人体发烧而又无法用以上两种方法检 测的热原物质 ,可用人血细胞培养液注射入家兔 的方法来检测[7] 。