槲皮素诱导人胰癌细胞株eanpan-2凋亡的实验研究

・－－——１３４６・。＿——　实验分析该表达蛋白免疫活性，结果表达的ｇｐ２１０　蛋白可与抗ｇｐ２１０抗体标准血清反应，且ＯＤ值随着　抗原稀释度的增加而降低。３０例ＰＢＣ患者中抗　ｇｐ２１０抗体阳性１１例，阳性率为３６．７％；７０例非　ＰＢＣ患者组和３０份正常人血清均为阴性。结果说　明ｇｐ２１０重组蛋白具有良好的抗原特异性。　本实验研究了ｇｐ２１０基因在大肠杆菌中的稳定　表达，获得了纯化的ｇｐ２１０抗原。与Ｔａｒｔａｋｏｖｓｋｙ　Ｆ克　隆表达大鼠的ｇｐ２１０蛋白不同，本实验是国内首次　重组表达人类的ｇｐ２１０蛋白，为血清抗ｇｐ２１０抗体检　测奠定了基础，对于ＰＢＣ辅助诊断具有重要的意　义。有关抗ｇｐ２１０抗体与ＰＢＣ疾病分型的相关性，　与疾病转归的相关性以及与ＡＭＡ的关系有待于进　一步研究。　参考文献：　［１］Ｍ￣ｃａｌｆＪＶ，ＢｈｏｖａｌＲＳ，Ｇｒａｙ　Ｊ，ｅｔ　ａ１．Ｉｎｃｉｄｅｎｃｅ　ａｎｄ　ｐｒｅｖａｌｅｎｃｅ　ｏｆｐｒｉｍａｒｙ　ｂｉｌｉａｒｙ　ｃｉｒｒｈｅｓ￣ｉｎ　ｔｈｅ　ｃｉｔｙ　ｏｆ　Ｎｅｗｃａｓｔｌｅ－ｕｐｏｎ．Ｔｙｎｅ，ｖ￣Ｏａｎｄ［Ｊ］．ｈａｔ　Ｆ　

文章编号：１００７—４２８７（２００７）１０—１３４６—０３　

Ｃｂｉｎ　Ｊ　Ｌａｂ　Ｄｉａｇｒｌ，Ｏｃｔｏｂｅｒ，２０ｏ７。、　ｌ１．Ｎｏ．１０　Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌ，１９９７，２６：８３０．　１２］Ｌａｓｓｏｕｅｄ　Ｋ，Ｂｒｅｎａｒｄ　Ｒ，Ｄｅｇｅｓ　Ｒ　ｅｔ　ａ１．Ａｎｆｉｎｕｃｌｅａｒ　ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ　ｄｉｒｅｔｔｅｄ　ｔｏ　ａ　２００　ｋＤ１３ｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅｏｆｔｈｅ　ｎｕｃｌｅａｒｅｎｖｅｌｏｐｅｉｎ　ｐｒｉｍａｒｙｂｉｌｉａｒｙ　ｃｉｒｒｈｏｓｉｓ．　ａ　ｃｌｉｎｉｃａｌａｎｄｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ　ｓｔｕｄｙｏｆａ　ｓｅｒｉｅｓ　ｏｆ１５０ｐａｔｉｅｎｔｓｗｉｔｈｐｒｉｍａｒｙ　ｂｉｌｉａｒｙ　ｃｉｒｒｈｅｓｉｓ［Ｊ］．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ，１９９０，９９：１８１．　１３］Ｂａｎｄｉｎ　０，Ｃｏｕｒｖａｌｉｎ　ｊｃ　ｅｔ　ａ１．Ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ　ａｎｄ　ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ　ｏｆ　！Ｏ　ａｕｔｏａｎｔｉ・　ｂｏｄｉｅｓ　ｄｅｔｅｃｔｅｄ　ｕｓｉｎｇ　ａｎ　ｅｎｚｙｍｅ－ｌｉｔ￣ｋｅｄ　ｉｍｍｔｍｅｓｏｒｂｅｎｔ　ａｓｓａｙ　ａｎｄ　ａ　ｓｙｎ．　ｔｈｅｆｉｃ　ｐｏｌｙｐｅｐｆｉｄｅｉｎｔｈｅ　ｄｉａｇｎｏｓｉｓ　ｏｆ　ｐ－ｍａｒｙ　ｂｉｌｉａｒｙ　ｃｉｒｒｈｅｓｉｓ［Ｊ］．Ｈｅｐａ．　ｔｏｌｏｇｙ，１９９６，２３：１０２０．　１４］ＮｉｃｋｏｆｉｔｚＲＥ，ＷｏｒｏａａｎＨＪ．Ａｕｔｏａｎｔｉｂｅｄｉｅｓ　ａｇａｉｎｓｔｉｎｔｅｇｒａｌｍ￣Ｉｌｂｌ－ｆｌＨｅｐｍ・　ｔｅｉｎｏｆｔｈｅ　ｎｕｃｌｅａｒ　ｅｎｖｅｌｏｐｅｉｎ　ｐａ￣ｅｎｔｓｗｉｔｈ　ｐｒｉｍａｒｙ　ｂｆｌｉａｒｙ　ｃｉｒｒｈｅｓｉｓ［Ｊ］　Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ，１９９４；１０６：１９３．　１５］Ｗｏｍｉａｋ　ＲＷ，Ｂａｒｔｎｉｋ　Ｅ，Ｂｌｏｂｅｌ　Ｇ；Ｐｒｉｍａｒｙ　ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ　ａＩｌ山　８　ｏｆａｎ　ｉｎｔｅ—　ｇｎｄ　ｍｅｍｂｒａｎｅ　ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｎｕｃｌｅａｒ　ｐｏｒｅ【Ｊ］．Ｊ　Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｌ，１９８９，　１０８：２０８３．　１６］Ｔａｒｔａｋｏｖｓｋｙ　Ｆ　ｅｔ　ａ１．Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　１Ｏ　ａｕｔｏａｎｔｉｂｅｄｉｅｓ　ｉｎ　ｐｒｉｍａｒｙ　ｂｉｌｉａｒｙ　ｃｉｒｒｈｏｓｉｓ　ｕｓｉｎｇ　ａ　ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｃｏｍｔａｌｎｉｎｇ　ｔｈｅ　ｐｒｅｄｏｍｉｎａｎｔ　ａｕｔｏｅｐｉ・　ｔｏｐｅ［Ｊ］．Ｈｅｐｏｔｏｌｏｇｙ，１９９５，２１：４９５．　（收稿日期：２０Ｏｒ７一ｏ３—３０）　

槲皮素诱导人胰癌细胞株ｃａｎｐａｎ一２凋亡的实验研究　牛壮，牛辉　（北华大学附属医院，吉林吉林１３２００１）　摘要：目的探讨中草药樨皮素诱导人胰腺癌细胞株ｃａｎｐａｎ－２凋亡的作用。方法运用Ｍ＇ＩＴ法检测樨皮素对　ｅａｎｐａｎ－２细胞凋亡的抑制率，流式细胞仪技术分析樨皮素对ｃａｎｐａｎ－２细胞增殖周期的影响。结果　１０—３２０／ｍａｏｌ／Ｌ　度的樨皮素均能抑制ｃａｎｐａｎ－２细胞的生长，且呈明显的时间，剂量依赖性关系，细胞周期分析显示樨皮素组Ｇｌ期细胞　比例明显增多，呈量效关系。结论樨皮素抑制ｃａｎｐａｎ．２细胞增殖，可能通过使ｃａｎｐａｎ．２细胞停滞在Ｇｌ期而诱导其　凋亡。　关键词：樨皮素；ｃａｎｐａｎ－２细胞抑制率　中图分类号：Ｒ７３５．９　文献标识码：Ａ　Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ　ｏｆＱｕｅ￣ｅｌｌｎＩｎｄｕｃｅｓＡｐｏｐｔｏｓｉｓ　ｃａｎｐａｎ－２　ｃｅｌｌｓｏｆｐａｎｃｒｅａｔｉｃ　ｃａｒｃｉｎｏｍａ　ｏｆＢｅｉ＾∞（，，　旧　，ｊｉｌｉｎ　１３２００１，Ｃｈｉｎａ）　Ａｂｓｔｒａｃｔ；Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ　Ｔｏ　ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅ　ｔｈｅ　ａｐｏｐｔｏｓｉｓ　ｏｆ　ｑｕｃｒｃｃｔｉｎ　ｏｎ　ｃｅｌｌ　ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｃ￣ｐａｎ－２　ｃｄｌｌｓ　ｏｆ　ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ　ｃａｒｃｉｎｏｍａ・　Ｍｅ￥ｏｄｓ　Ｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃ　ＭＴｒ－ａｓｓａｙ　ｗａｓ　ｕｓｅｄ　ｔｏ　ｍｅａｓｕｒｅ　ｔｈｅ　Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ　ｒａｔｉｏ　ｏｆＱｕｅｒｃｅｔｉｎ　ｏｎ　ｃａｎｐａｎ－２　ｃｅｌｌｓ．Ｔｈｅ　ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ　ｃｙｃｌｅ　ｏｆ　ｃａｎ啪．２　ｃｅｌｌｓ　ｗａｓ　ｄｅｔｅｍｉｎｅｄ　ｕｓｉｎｇ　ｆｌｏｗ　ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ．Ｒｅｓｕｌｔｓ　Ｑｕｅｒｃａｔｉｎ　１０—３２０　ｖｍｏｌ／Ｌ　ｉｎｈｉｂｉｔｅｄ　ｔｈｅ　ｐｒｏ　ｍ【ｉ０ｎ，０ｆ　ｃ肌Ｆ肌．２　ｃｅｌｌｓ　ｔｈ　ｄｉ位ｒｅｎｔ　ｒ撕０Ｉ１ｓ　ａｎｄ　ｓｈｏｗｅｄ　ｔｌｌｅ血ｎｅ．ａｎｄ　ｄｏｓｅ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ　ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ．Ｔｈｅ　ａｕｇｍｅｎｔ　ｏｆ　Ｇｌ　ｒａｔｉｏｎ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｐｍｌｉｆｅｒａｔｉ０ｎ　ｃｙ　ｌ　０ｆ　ｃａｒＩｐａｎ．２　ｃｅｕｓ　ｐ　ａ　ｄｏｓｅ　ｄｅｐｅｎｄｅｎｔｉＢａｎｉ￣ｒ．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ　Ｑｕｅｒｃａｔｉｎ　ｃａｎｉｎｈｉｂｉｔｔｈｅ　ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ　０ｆ伽ｐａｎ’２　ｅｕｓ　ａｎｄ衄出ｍ‘　

ｄｒｃｅｔｈｅ　ａｐｏｐｔｏｓｉｓ　ｂｙ　ｒｅｓｔｒａｉｎｅｄ　ｃｅｌｌ　ｃｙｃｌｅ　ａｔ　Ｇ１．　Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ：Ｑｕｅｒｃｅｔｉｎ；ｃａｎｐａｎ－２　ｃｅｌｌｓ；Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ　ｒａｔｉｏ　

榴皮素（Ｑ　ｅｒｃｅｔｉｎ）是最常见的黄铜类物质，广　泛存在于蔬菜、水果及中草药之中，易于提取，分离　

（Ｃｈ／ｎ－，Ｌａｂ脚，２ＯＯ７，１１：１３４６）　和检测。棵皮素药理作用广泛，其有扩张冠状动脉，　降血脂、抗血小板聚集、抗糖尿病并发症等多方面作　

维普资讯 http://www.cqvip.com 中国实验诊断学２００７年１Ｏ月第１１卷第１Ｏ期　用［¨，近年来已经发现棵皮素对多种致癌、促癌物和　致突剂有抑制作用，而且对多种种瘤细胞生长抑制　的作用［　，引，对其抗肿瘤活性的研究越来越引起广　泛关注。本实验通过对人胰腺癌ｃａｎｐａｎ一２细胞体外　培养，来研究棵皮素对人胰腺癌ｃａｎｐａｎ一２细胞生长　抑制作用。　１材料与方法　１．１主要试剂棵皮素购自Ｓｉｇｍａ公司，以１当量　的ＮａＯＨ助溶，１％的稀盐酸凋ＰＨ值在７．０—７．４左　右，滤器过滤备用。用完全培养基配制棵皮素浓度　分解的０、１０、２０、４０、８０、１６０、３２０　ｔｍａｏｌ／Ｌ。碘化两啶　（ＰＩ）购自美国Ｓｉｇｍａ公司，ＭｒｒＩ＇购自美国Ｇｉｂｃｏ公　司，二甲基亚枫（ＤＭＳＯ）和胰蛋白酶购自北京中山公　司，人胰腺癌ｃａｎｐａｎ－２细胞购自中科院上海生命科　学究所。　１．２实验方法　１．２．１细胞培养取适量冻存细胞复苏，放于细胞　培养瓶中，加入含１０％胎牛血清的ＤＭＥＭ培养基　（含青霉素１００　Ｕ／ｍｌ、链霉素１００　ｕ／ｍ１），于３７℃，５％　ｃ０２饱和浓度的培养箱中培养，定期观察细胞生生　长期情况，实验时取时生长期细胞进行。　Ｉ．２．２细胞抑制率检测接种对数生长期ｃａｎｐａｎ一２　细胞至９６孔培养板，每孔１００　（约３×１０４个细　胞），培养２４　ｈ后，可人各浓度组槲皮素，对照组加　完全培养基，每组设５个复孔，分别培养６、１２、２４、　４８、７２　ｈ后，分别在各时间段结束前４　ｈ每孔加ＭＴＦ　（５　ｍｇ／ｒｎ１）１００　９１，临上机检测前每孔加ＤＭＳＯ　１００　ｌ，然后在ＤＣ￣３０２２Ａ酶标仪上５７０　１Ｔｌｌｎ波长处测吸　光度（ＯＤ值），重复实验３次。细胞抑制率＝（１一实　验组Ａ值／对照组Ａ值）×１００％　１．２．３细胞周期检测取对数生长期细胞接种至１　２孔培养板中，培养２４　ｈ后，加入各浓度组棵皮素，　继续培养４８　ｈ，对照组加入完全培养基，然后用　０．２５％胰酶消化细胞，离心（１０００　ｒｐｓ／ｍｉｎ，５　ｍｉｎ），　ＰＢＳ液漂洗并重悬，７０％冷乙醇４￣Ｃ固定过夜，４００　ｔ，．／ｍｌ，碘化丙啶（ＰＩ）４ｏＣ避光染色１　ｈ，用ＳＰＩＣＳ　ＸＬ　（ｃｏｕｌｔｅｒ，ＵＳＡ）流式细胞仪进行细胞周期分析。　１．２．４　Ａｎｎｅｘｉｎ　Ｖ—Ｆｒｒｃ／Ｐｉ双染色法分析槲皮素诱　导ｃａｎｐａｎ一２细胞凋作用在１２　ｈ、４８　ｈ分别收集，４０　ｔｍａｏｌ／Ｌ、１６０　ｔｍａｏｌ／Ｌ棵皮素作用的培养细胞，调整细　胞浓度为５×１０５个／ｍｌ，取１　ｍｌ细胞，１０００　ｒｐｓ／ｍｉｎ，　４￣Ｃ　１０　ｍｉｎ弃上清，加入冷的ＰＢＳ１　ｍｌ，轻轻振荡使　细胞悬浮，１０００　ｒｐｓ／ｍｉｎ，４￣Ｃ离心１０　ｍｉｎ，弃上清，重　复加入１　ｍｌ，冷的ＰＢＳ，轻轻振荡使细胞悬浮，１０００　—１３４７一　ｒｐｓ／ｍｉｎ，离心１０　ｍｉｎ，弃上清液，对于贴壁细胞先用　０．２５％胰蛋白酶消化制成单个细胞悬液，再用ＰＢＳ　离，１、５＂洗涤，将细胞重悬于２００　结合缓冲液，加入　１０　９１　Ａｎｎｅｘｉｎ　Ｖ—Ｆｒｍ（和５　的ＰＩ，轻轻混勾）避光　室温反应１５　ｍｉｎ，加入３００　９１结合缓冲液，立即上机　（流式细胞仪）检测。　１．３统计学方法　实验数据以元±ｓ表示，采用Ｓｐｓｓ　１１．５统计软　件分析，Ｐ＜０．０５有统计学意义。　２结果　２．１榔皮素对ｃａｎｐａｎ－２细胞的增殖抑制作用　２．１．１时效关系如表１所示，槲皮素８０　ｔＬｍｏｌ／Ｌ浓　度组与人胰腺癌ｃａｎｐａｎ－２细胞体外共同孵育０—７２　ｈ出现明显抑制作用，随着时间延长，抑制作用明显　增强，其作用呈时间相关性。