流式细胞仪的应用ppt_
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BD流式全面介绍ppt课件
流式细胞仪的遗传学应用
细胞DNA, RNA 含量的测定 染色体倍体分析 染色体分离 基因表达产物的生物活性研究 基因转染表达的生物效应 基因表达调控研究 细胞内基因定位 酵母转基因株的筛选 报告基因的定性定量检测 植物遗传学研究 ••••••
What can Flow Cytometer tell us about a cell?
样本处理
细胞悬液的制备
— 细胞悬液：
– 分离PBMC、PRP等：操作复杂，分离、离心步骤导致细胞 特定群体丢失，并可能引入某些误差
– 直接使用外周血、骨髓：最接近生理状况，操作简便，样本 用血量小
– 灌洗液、体腔积液 – 培养细胞、细胞系
— 实体组织：
– 病理组织：新鲜样本/石蜡包埋样本 – 针吸组织：新鲜样本
Voltage
Laser Laser Laser
Voltage
Voltage
Time Time Time
Quantification of a Voltage Pulse
— Height is a measurement for all parameters. — Width = Area/Height
1. 散射光信号
•前向角散射光（FSC,Forward
Scatter） 入射激光的同向散射光信号 细胞相 对大小及其表面积。
•侧向角散射（SSC, Side Scatter）
入射激光90角的散射光信号 细胞粒度及细胞内相对复杂性。
散射光
—散射光能被用来区分不同细胞群体的基本形态 上的差异 - 通常使用“散点图”来看散射光信号 - 散点图上的一个点就代表一个细胞颗粒的 数据
Optics
• Excitation optics consist of:
流式细胞仪的荧光补偿问题课件
荧光补偿不当还可能 影响流式细胞仪的定 量和定性分析结果。
荧光补偿问题可能导 致实验结果的不稳定 性和不可重复性。
荧光补偿问题的解决方法
01
02
03
04
在实验设计时，应尽量选择光 谱不重叠的荧光染料，避免干
扰。
通过软件算法和校准技术，对 荧光补偿问题进行修正和优化
。
可以使用标准样本进行荧光补 偿校准，以提高实验数据的准
流式细胞仪的荧光补偿问题课件
目录
• 引言 • 流式细胞仪的工作原理 • 荧光补偿的问题分析 • 荧光补偿问题的实验研究 • 总结与展望 • 参考文献
01
引言
背景介绍
流式细胞仪是一种在生物学、医学和 生物工程领域广泛使用的技术，可用 于对细胞进行快速、多参数的分析。
荧光补偿是流式细胞仪分析中的重要 环节，通过对荧光的补偿可以纠正仪 器对不同荧光信号的偏差和不一致性 ，提高实验结果的准确性和可靠性。
实现实时荧光补偿
开发能够实时进行荧光补偿的 流式细胞仪，提高实验效率， 减少误差。
提高荧光补偿的自动化程 度
研究能够自动进行荧光补偿的 算法和技术，减少人工操作的 误差和繁琐程度。
多维数据分析
利用多维数据分析方法，对流 式细胞仪产生的多维荧光数据 进行深入分析和挖掘，发现更 多生物标记物和疾病标记物。
L.L. Wheeless et al., Flow Cytometry
A Practical Approach, 3rd ed., Academic Press, 2016.
THANKS
感谢观看
实验步骤
详细描述实验操作流程， 包括样本准备、上机实验 、数据收集及处理等。
实验结果及分析
BD流式分选的原理和应用课件
符合分选条件的颗粒一旦被检测到，包含该颗粒的液滴 将要从液流断开时，液流被充电。断开后的液滴仍然带 电，带电的液滴通过被充电的偏转板。受静电吸引或排 斥，带电液滴将向左或向右偏转。不带电的液滴不偏转 而流入废液槽。
21
部分应用实例
科学是复杂的，工具是简单的
22
转染绿色荧光蛋白GFP细胞的分选
用带GFP (绿色荧光蛋白 ) 标记的质粒转染细胞， 在488nm激光激发下， 表达GFP 的细胞发绿色荧光。本实验为U937 细胞转染GFP和目的基因， 用BD FACSAria III 分选高表达GFP目的基因的细胞。本案例用BD FACSAria III 分选GFP阳性细胞， 该 样本GFP阳性的目标细胞含量仅为1 .9%， 分选后回测， 目的细胞纯度高达99%。
细胞凋亡-Annexin Ⅴ/PI双标记法
FITC Annexin V/PI染色和流式细 胞仪分析。Jurkat细胞（人T细胞 白血病）用6µM的喜树碱或0.1% DMSO（阴性对照）4小时，引导凋 亡。细胞根据Annexin V-FITC凋亡 检测试剂盒的染色指南，用FITC Annexin V和碘化丙啶（PI）染色。 与DMSO对照组相比，喜树碱处理会 增加细胞的早期凋亡（PI阴性， Annexin V阳性），即图中绿色部 分。死细胞（PI阳性，红色部分） 和活细胞（Annexin V和PI阴性， 黑色部分）群体很容易辨别。图中 的数据来自BD Accuri C6流式细胞 的BD CFlow® Plus。
BD公司流式细胞仪
FACSJazz
FACSAriaII
Influx
FACSCantoII
LSRFortessa
Accuri C6
流式细胞仪特点及检测标本
21
部分应用实例
科学是复杂的，工具是简单的
22
转染绿色荧光蛋白GFP细胞的分选
用带GFP (绿色荧光蛋白 ) 标记的质粒转染细胞， 在488nm激光激发下， 表达GFP 的细胞发绿色荧光。本实验为U937 细胞转染GFP和目的基因， 用BD FACSAria III 分选高表达GFP目的基因的细胞。本案例用BD FACSAria III 分选GFP阳性细胞， 该 样本GFP阳性的目标细胞含量仅为1 .9%， 分选后回测， 目的细胞纯度高达99%。
细胞凋亡-Annexin Ⅴ/PI双标记法
FITC Annexin V/PI染色和流式细 胞仪分析。Jurkat细胞（人T细胞 白血病）用6µM的喜树碱或0.1% DMSO（阴性对照）4小时，引导凋 亡。细胞根据Annexin V-FITC凋亡 检测试剂盒的染色指南，用FITC Annexin V和碘化丙啶（PI）染色。 与DMSO对照组相比，喜树碱处理会 增加细胞的早期凋亡（PI阴性， Annexin V阳性），即图中绿色部 分。死细胞（PI阳性，红色部分） 和活细胞（Annexin V和PI阴性， 黑色部分）群体很容易辨别。图中 的数据来自BD Accuri C6流式细胞 的BD CFlow® Plus。
BD公司流式细胞仪
FACSJazz
FACSAriaII
Influx
FACSCantoII
LSRFortessa
Accuri C6
流式细胞仪特点及检测标本
流式细胞术(贝克曼)
对任何细胞群体都可以进行绝对计数
Th1Th2细胞因子分泌细胞测定
根据产生的细胞因子的
类型和生物学功能,人的ＣＤ
4+Ｔ细胞可以分为Ｔｈ1、Ｔ
ｈ2
Ｔｈ1细胞产生ＩＬ 2、ＩＬ 12、ＩＦＮ γ、ＴＮＦ β等细 胞因子,主要参与细胞介导的 免疫反应、迟发性过敏反应, 并在清除病毒等细胞内致病 因子方面起着重要作用
Normal Cell Cycle
M G2
G0
G1
s
C o u n t
DNA Analysis
G0G1
s G2 M
0
200
400
600
800
1000
2N
4N
DNA content
1. 肿瘤的早期诊断。 2. 肿瘤的良恶性判断。 3. 观察细胞的增殖状态及周期分布。 4. 疗效监测
细胞功能分析
1.吞噬功能试验 2.氧爆发试验 3.根据T淋巴细胞分泌细胞因子的不同将CD4+或 CD8+分为介导细胞免疫的I型细胞和介导体液 免疫的II型细胞. 4.药物泵的功能检测 5.NK细胞的肿瘤杀伤活性检测 6.血小板的粘附,聚集功能检测
CD80,CD86,CD83,DR等 2）利用BDCA1,2,3,4对外周血或其它组织DC进行
分析 3）
CD14+16/CD85/CD33,CD14+16/CD85/CD123
T细胞分析
相对计数－淋巴细胞亚群数量检查项目和意义
疾病
CD3 CD4 CD8 CD4/CD8 NK
自身免疫病
降低 增高 降低
降低
AIDS SARS
降低 降低
严重 降低
降低
Th1Th2细胞因子分泌细胞测定
根据产生的细胞因子的
类型和生物学功能,人的ＣＤ
4+Ｔ细胞可以分为Ｔｈ1、Ｔ
ｈ2
Ｔｈ1细胞产生ＩＬ 2、ＩＬ 12、ＩＦＮ γ、ＴＮＦ β等细 胞因子,主要参与细胞介导的 免疫反应、迟发性过敏反应, 并在清除病毒等细胞内致病 因子方面起着重要作用
Normal Cell Cycle
M G2
G0
G1
s
C o u n t
DNA Analysis
G0G1
s G2 M
0
200
400
600
800
1000
2N
4N
DNA content
1. 肿瘤的早期诊断。 2. 肿瘤的良恶性判断。 3. 观察细胞的增殖状态及周期分布。 4. 疗效监测
细胞功能分析
1.吞噬功能试验 2.氧爆发试验 3.根据T淋巴细胞分泌细胞因子的不同将CD4+或 CD8+分为介导细胞免疫的I型细胞和介导体液 免疫的II型细胞. 4.药物泵的功能检测 5.NK细胞的肿瘤杀伤活性检测 6.血小板的粘附,聚集功能检测
CD80,CD86,CD83,DR等 2）利用BDCA1,2,3,4对外周血或其它组织DC进行
分析 3）
CD14+16/CD85/CD33,CD14+16/CD85/CD123
T细胞分析
相对计数－淋巴细胞亚群数量检查项目和意义
疾病
CD3 CD4 CD8 CD4/CD8 NK
自身免疫病
降低 增高 降低
降低
AIDS SARS
降低 降低
严重 降低
降低
《流式细胞术的原理》PPT课件
补偿不好调。 4. 尽量选择应用广、亮度高的荧光素 5. — 荧光素的强弱用Stain Index染色指数来表示，
数值越大，信噪比越高。 6. 多色实验中，亮度高的荧光素搭配表达量低的目
标抗原 7. — 例如，PE， APC这类大分子蛋白相对亮度高。 8. 关注F/P比值
BD网站提供每一种荧
光素的激发以及发射光 谱
流式细胞仪的根本构造 以及原理
流式细胞仪的根本构造 以及工作原理
•虽然每款流式细胞仪有各自的特征性构造，但是其 内部构造根本组成一样。
•根本构造一共分三局部： •液流系统 •光学系统 •电子系统
液流系统
液流系统包括
•流动室 flow chamber
Injector
Tip Sheath
fluid
•液流驱动系统
Fluorescence signals
Focused laser beam
鞘液三大作用： 防止堵塞喷孔 约束样本位于喷嘴中心、提高测量精度 保持细胞活性
液流系统
对灵敏度要求不是很苛刻的实验，可调高样本进样速率，从而 提高采样分析速度。
光学系统
主要由激发光源、光束成形及收集系统组成
数据显示
•二维点图 〔Dot Plot〕 •直方图〔Histogram〕 •等高线图 〔Contour Plot〕 •密度图 〔Density〕 •三维图〔3D Plot〕等·
流式细胞术操作流程
样本收集及 处理
制备单细胞 悬液
免疫荧光 染色
表型测定
统计学分 析
1.样本制备
样本来源
•血液 •骨髓 •淋巴结 •体液 〔尿液、脑脊液、胸腹腔积液〕 •灌洗液〔肺泡支气管〕 •加抗凝剂〔EDTA〕，室温保存，24h内
数值越大，信噪比越高。 6. 多色实验中，亮度高的荧光素搭配表达量低的目
标抗原 7. — 例如，PE， APC这类大分子蛋白相对亮度高。 8. 关注F/P比值
BD网站提供每一种荧
光素的激发以及发射光 谱
流式细胞仪的根本构造 以及原理
流式细胞仪的根本构造 以及工作原理
•虽然每款流式细胞仪有各自的特征性构造，但是其 内部构造根本组成一样。
•根本构造一共分三局部： •液流系统 •光学系统 •电子系统
液流系统
液流系统包括
•流动室 flow chamber
Injector
Tip Sheath
fluid
•液流驱动系统
Fluorescence signals
Focused laser beam
鞘液三大作用： 防止堵塞喷孔 约束样本位于喷嘴中心、提高测量精度 保持细胞活性
液流系统
对灵敏度要求不是很苛刻的实验，可调高样本进样速率，从而 提高采样分析速度。
光学系统
主要由激发光源、光束成形及收集系统组成
数据显示
•二维点图 〔Dot Plot〕 •直方图〔Histogram〕 •等高线图 〔Contour Plot〕 •密度图 〔Density〕 •三维图〔3D Plot〕等·
流式细胞术操作流程
样本收集及 处理
制备单细胞 悬液
免疫荧光 染色
表型测定
统计学分 析
1.样本制备
样本来源
•血液 •骨髓 •淋巴结 •体液 〔尿液、脑脊液、胸腹腔积液〕 •灌洗液〔肺泡支气管〕 •加抗凝剂〔EDTA〕，室温保存，24h内
流式细胞分析分选原理课件
04 流式细胞分析的优缺点
流式细胞分析的优点
高效快速
流式细胞分析能够同时对多个 细胞进行快速分析，大大提高
了检测效率。
高灵敏度
流式细胞分析能够检测到单个 细胞水平的微小变化，具有很 高的灵敏度。
自动化程度高
流式细胞分析采用自动化仪器 进行操作，减少了人为误差和 操作时间。
可进行多参数分析
流式细胞分析可以对细胞进行 多参数检测，包括细胞表面抗 原、胞内蛋白质、细胞大小和
未来流式细胞分析将更加智能化 和自动化，提高检测效率和准确
性。
多组学整合
将流式细胞分析与基因组学、蛋 白质组学等多组学技术整合，实 现更全面的细胞分子特征分析。
个体化医疗应用
利用流式细胞分析技术对个体细 胞的分子特征进行分析，为个体
化医疗提供有力支持。
05 流式细胞分析的实际应用 案例
肿瘤免疫研究中的应用
肿瘤学研究
用于检测肿瘤细胞的 表面抗原、基因突变 和细胞周期状态。
生殖医学研究
用于精子分析和胚胎 筛选。
传染病研究
用于病毒和细菌的检 测和鉴定。
02 流式细胞分析的基本原理
流式细胞样本的制备
01
02
03
细胞样本的采集
从患者体内或体外培养中 获取细胞样本，如血液、 组织等。
细胞样本的处理
清洗、离心、分离特定细 胞群，以备后续分析。
流式细胞分析分选原理课件
目 录
• 流式细胞分析简介 • 流式细胞分析的基本原理 • 流式细胞分选的原理与技术 • 流式细胞分析的优缺点 • 流式细胞分析的实际应用案例
01 流式细胞分析简介
流式细胞分析的定义
流式细胞分析是一种在液流中快 速检测、分离和分析单个细胞的
流式细胞仪原理及应用
BD Biosciences Immune Function
数据存储
• FCS 2.0格式
• 常以列表模式（LIST MODE)：将每个细胞的每个检测参 量依次排列顺序存储
FSC SSC FL1 FL2 Event 1 30 60 638 840 Event 2 100 160 245 85 Event 3 300 650 160 720
• 诊断原发性免疫缺陷病（如先天性无 r 球蛋白血症）或继发 性免疫缺陷病（如AIDS）
• 造血干细胞移植后免疫重建（6个月NK；9个月T、B）
• Th/Ts：机体免疫功能亢进：自身免疫性疾病，如SLE、类风
湿性关节炎等（治疗有效恢复正常）
• Th/Ts：机体免疫功能低下：AIDS、病毒感染、慢性活动性
淋巴细胞 活化功能研究
T淋巴细胞活化
BD Biosciences Immune Function
• 细胞数目增殖 • 细胞表面表达
活化标记 • 分泌细胞因子
CFSE示踪原理
• 羟基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺脂(CFSE)是一种 可穿透细胞膜的荧光染料，CFSE进入细胞后可以 不可逆地与细胞内的氨基结合偶联到细胞蛋白质上。 当细胞分裂时，CFsE标记荧光可平均分配至两个 子代细胞中，因此其荧光强度是亲代细胞的一半。 这样，在一个增殖的细胞群中，各连续代细胞的荧 光强度呈对递减，利用流式细胞仪在488nm激发光 和荧光检测通道可对其进行分析。
数据分析
等高图和密度图分析
BD Biosciences Immune Function
数据分析
三维图分析
BD Biosciences Immune Function
BD Biosciences Immune Function
数据存储
• FCS 2.0格式
• 常以列表模式（LIST MODE)：将每个细胞的每个检测参 量依次排列顺序存储
FSC SSC FL1 FL2 Event 1 30 60 638 840 Event 2 100 160 245 85 Event 3 300 650 160 720
• 诊断原发性免疫缺陷病（如先天性无 r 球蛋白血症）或继发 性免疫缺陷病（如AIDS）
• 造血干细胞移植后免疫重建（6个月NK；9个月T、B）
• Th/Ts：机体免疫功能亢进：自身免疫性疾病，如SLE、类风
湿性关节炎等（治疗有效恢复正常）
• Th/Ts：机体免疫功能低下：AIDS、病毒感染、慢性活动性
淋巴细胞 活化功能研究
T淋巴细胞活化
BD Biosciences Immune Function
• 细胞数目增殖 • 细胞表面表达
活化标记 • 分泌细胞因子
CFSE示踪原理
• 羟基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺脂(CFSE)是一种 可穿透细胞膜的荧光染料，CFSE进入细胞后可以 不可逆地与细胞内的氨基结合偶联到细胞蛋白质上。 当细胞分裂时，CFsE标记荧光可平均分配至两个 子代细胞中，因此其荧光强度是亲代细胞的一半。 这样，在一个增殖的细胞群中，各连续代细胞的荧 光强度呈对递减，利用流式细胞仪在488nm激发光 和荧光检测通道可对其进行分析。
数据分析
等高图和密度图分析
BD Biosciences Immune Function
数据分析
三维图分析
BD Biosciences Immune Function
BD Biosciences Immune Function