流式细胞仪

Purdue University Cytometry Laboratories
流式细胞术的临床应用
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临床常见应用
1.检测淋巴细胞亚群，监测细胞免疫状态 2.白血病/淋巴瘤免疫分型
3.HLA组织配型及HLA与某些疾病的关系
4.干祖细胞的定量及成分分析.
5.其它:血小板PAIg：粘附分子;TCR多态性检测;
• ②可进行多参数测量，可以对同一个细胞做有关物理、
化学特性的多参数测量，并具有明显的统计学意义；
• ③是一门综合性的高科技方法，它综合了激光技术、
计算机技术、流体力学、细胞化学、图像技术等从多 领域的知识和成果；
• ④既是细胞分析技术，又是精确的分选技术。
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• 概要说来，流式细胞术主要包括了样品的液流
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• 目前的流式细胞仪大多采用氩离子激光器，因为
488nm的激光器能够激发一种以上的荧光。光
源的谱线愈接近被激发物质的激发光谱的峰值，
所产生的荧光信号愈强。FITC的激发光谱如图
3-3所示， 488nm非常接近FITC的激发光谱的
峰值，所以FITC被激发时会表现出最强荧光信
号，而当FITC被其波谱范围内的其它波长激发
的技术。从开始设想到第一台仪器的问世,科技工作者进行 了不懈的努力。随着各相关技术的迅速发展，FCM技术已 经成为日益完善的细胞分析和分选的工具。
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• FCM仪器分为二大类：
• 一类为台式机，其特点为：仪器的光路调节系统固定，
自动化程度高，操作简便，易学易掌握。BD公司的临床 型 FACScan也是最早可用于临床诊断的仪器。
肿瘤癌基因及 抑癌基因蛋白产物的检测;细胞内酶; 耐药蛋 白的分析等等。
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• HLA-B27检测
外周血HLAB27的表达及其表达程度与强直性脊柱炎的发生 有很大程度的相关性.
• 循环血中活化血小板（CD62P、CD63）：
糖尿病伴微血管病变、冠心病、高血压病、高脂血症、脑 血栓形成、短暂性脑缺血发作、脑动脉硬化患者活化血小板百 分率和绝对值显著高于正常人。而糖尿病无微血管病变、周围
（ CD19+/CD3+） 的 百 分 含 量 为 ： 296/2839=10.43%。
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•
分 选
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488 nm laser
FALS Sensor
Fluorescence detector
Charged Plates
-
+
Single cells sorted into test tubes
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Laser
FALS Sensor
90LS Sensor
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流式细胞仪产生的信号
• 非荧光信号
颗粒度
细胞大小
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• 上述两种信号都是来自于激光原光束，目前采
用这两个参数组合，可区分不同种类的细胞亚 群，同时可获得细胞相关的重要信息，下图 （图 3-2 ）为 FSC 和 SSC 组成的二维散点图， 从图中可以很容易把全血样本中淋巴细胞、单
分含量。而且，还可以对感兴趣的细胞进行再
分选。
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FALS Sensor
Freq
Fluorescence
Fluorescence detector
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Example Channel Layout for Laser-based Flow Cytometry
PMT
4
Flow cell
Dichroic Filters
血管病变以及深静脉血栓形成患者活化血小板水平与正常人无
显著差异。PTCA后24小时发展成急性血管闭塞或高度再狭窄 的患者活化血小板CD62p、CD63增多，可以用于预测PTCA后 急性缺血再发作的危险性。
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微转移肿瘤细胞
灵敏度:10-7
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DNA含量及细胞周期分析
细胞周期分析:在细胞周期(G0，G1，S， G2 ，M)的各个时期，DNA的含量随各时相呈现 出周期性的变化。通过核酸染料标记DNA，并 由流式细胞仪进行分析，可以得到细胞各个时 期的分布状态，计算出G0/G1%，S%及G2/M%。 了解细胞的周期分布及细胞的增殖活性。也可 利用细胞周期蛋白（CYCLIN）、Ki67、核增殖 抗原（PCNA）等，对细胞周期进行精确的分期： G0、G1、S、G2、M.
400 nm 500 nm 600 nm 700 nm
Excitation Emission
ity s n te eIn tiv la e R
Phycoerythrin (PE)
27
350
300 nm
457 488 514
400 nm 500 nm
610 632
600 nm 700 nm
PE-TR Conj.
核细胞及粒细胞区分开。
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荧光信号
• 荧光物质吸收符合其波长范围的光能量，内部电
子受激上升到高能级。然后受激电子迅速衰落回
基态，释放过剩能量成为光子。这种能量的转换
称为荧光。
• 能够激发荧光物质的波长范围称为激发光谱。因
为更多的能量消耗在吸收转换而不是荧光转换中，
所以发射光波长要高于激发光波长。荧光物质的 发射波长范围叫做发射光谱。
Common Laser Lines
Texas Red
PI Ethidium PE FITC
cis-Parinaric acid
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• 对单克隆抗体进行荧光染色，通过分析细胞表
面抗原标记
• 确认细胞类型。在细胞的混合群体中，我们使
用不同的荧光染料区分细胞亚群。每个亚群的 染色模式与FSC和SSC数据相结合，用于识别样 本中的细胞种类，并可以得到各细胞亚群的百
流式细胞术
胡嘉波 江苏大学基础医学与医学技术学院
1
•
流式细胞仪（Flow Cytometer 简称FCM）是一项集激光 技术、电子物理技术、光电测量技术、计算机技术及细胞 荧光化学技术、单克隆抗体技术为一体的新型高科技仪器。 概括来说，流式细胞术就是对于处在快速直线流动状态中
的细胞或生物颗粒进行多参数的、快速的定量分析和分选
• 统计结果表明，整个事件共记录了6000个细胞，门内
淋巴细胞2891个。其中M1（阴性）细胞619个，M2 （CD3阳性）细胞2272个细胞。淋巴细胞亚群CD3阳 性 百 分 含 量 的 统 计 结 果 为 ： M2： 2272/2891=78.59%。
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• 二维点图以双参数显示结果，每个点表示一个或多个细胞。图为
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Forward Angle Light Scatter 前向角
Laser
FALS Sensor
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• 侧向角散射：侧向角散射（SSC）光与
被测细胞的颗粒密度和内部结构有关， 对细胞膜、胞质、核膜的折射率更为敏
感。SSC收集与激光束正交90度方向的
散射光信号。
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90 Degree Light Scatter 90度侧向角
技术、细胞的分选和计数技术，以及数据的采 集和分析技术等。FCM目前发展的水平凝聚了 半个世纪以来人们在这方面的心血和成果。
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流式细胞仪发展的历史
• 起源: 1934年--- 细胞计数仪 • 雏形: 1949年--- Coulter 计数器 • 1959年--- B型Coulter计数器 • 1972年: BD(Becton-Dickinson) • 第一台流式细胞仪, 具有分选功能
7
•
流式细胞仪主要由三部分组成：流动室和液 流系统；光路系统以及电系统。其作用如下：
• 液流系统：依次传送待测样本中的细胞到激
光照射区。
• 光路系统：细胞由激光激发，通过光学滤片
产生光信号，并传送到相应的探测器。
• 电系统：把光信号转换为电信号。
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• 在流式细胞仪中，细胞被传送到液流中的激光照射区。
阴性对照图，用于设定阴性对照边界，全图划分为四个象限，以 区分阴性细胞、单阳性细胞以及双阳性细胞。左下象限（LL）为 双阴性细胞，左上象限（UL）为Y轴阳性细胞（CD19 PE），右 下象限（LR）为X轴阳性细胞（CD3 FITC），右上象限 • （UR）为双阳性细胞（CD19+/CD3+）。
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• 如图 5-7 所示，淋巴细胞亚群双阳性细胞
• 另一类为大型机，其特点为可快速将所感兴趣的细胞分
选出来，并且可将单个或指定个数的细胞分选到特定的 培养孔或板上，同时可选配多种波长和类型的激光器， 适用于更广泛更灵活的科学研究应用。
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●
流式细胞仪实物
BD-Calibur
BD FACSVantage
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• 其特点是： • ①测量速度快，最快可在1秒种内计测数万个细胞；
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液流系统
液流系统的作用是依次传送待测样本中的细胞到激光照射区， 其理想状态是把细胞传送到激光束的中心。而且在特定时间 内，应该只有一个细胞或粒子通过激光束。
统的核心部件，台式机中流动室称为样品槽，大型机称之为 喷嘴。在流动室内细胞液柱聚焦于鞘液中心，细胞在此与激 光相交。
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血小板计数新标准(双平台法)
(国际血液学标准化委员会(ICSH)/国际实验血液学协会(ISLH) 2001)
R = 红细胞数R3/血小板数R1(流式) 血小板数=红细胞数(血球仪)/R
灵敏度高(1- 400x109/L)， 重复性好，室内/室外变异系数均很小 尤其应用于血小板预输注病人的检测 (阈值:20x109/L)
800
1000
2N
4N
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PI 荧光强度(DNA含量)
定量分析
1.检测细胞特异性标记物：FCM不但可以定性 分析标记物，而且可以进行定量。用标记 已知数量的荧光素分子的标准微球作参照， 可以计算出每个细胞抗原定簇的个数。 2.CD4绝对计数 3.CD34绝对计数 4.血小板绝对计数 5.可溶性物质(如细胞因子)的高通量定量检测