流式细胞仪---

散射光的测定：
3.流式细胞仪系统结构
细胞在液柱中与激光束相交时向周围360°立体角方向散射的光线信 号，它的强弱与细胞的大小、形状、胞内颗粒折射等有关，主要分 为前向角散射光和侧向角散射光。
3.流式细胞仪系统结构
➢前向角散射光（FSC:forward scatter）：激光束照射细胞时，光 以相对轴较小角度(0.5°～10°)向前方散射的讯号用于检测细胞等 粒子的表面属性，信号强弱与细胞体积大小成正比。
，防止其靠近孔壁而阻塞喷孔。
为了保证液流是稳液，一般限制液流速度υ<10m/s。
3.流式细胞仪系统结构 流动室与液流驱动系统模拟图
3.流式细胞仪系统结构
FCM的液流系统（如何 形成单个细胞流）
3.流式细胞仪系统结构
▲入管道前，边缘与中心速度一致； ▲入管道后，受管壁粘性阻力边缘速度下降，中心速度不变； ▲大约管道50倍直径处，稳定层流形成，产生流体聚焦效应； ▲液流中心由单列匀速运动颗粒组成的液柱。
•1940年Coons提出结合荧光素的抗体去标记细胞内的特定蛋白； •1949年Wallace Coulter申请了在悬液中计数粒子的方法的专利； •1950年Caspersson用显微UV-VIS检测细胞 •1953年Croslannd-Taylor应用分层鞘流原理，成功设计红细胞光学 自动计数器
流式细胞术是一项新型的、发展迅速的生物医学分析技术,它是集 激光技术、光电测量技术、计算机技术、流体力学以及细胞免疫荧 光化学技术、单克隆抗体技术为一体的新型高科技细胞分析技术。
➢2.流式细胞术发展史：
1.流式细胞术概述
•1930年Caspersson和Thorell开始致力于细胞计数的研究； •1934年Moldaven最早设想细胞检测自动化，用光电仪记录流过一 根毛细管的细胞；
荧光测量
3.流式细胞仪系统结构
荧光信号由被检细胞上标记的特异性荧光染料受激发后产生，发射 的荧光波长与激发光波长不同。
每种荧光染料会产生特定波长的荧光和颜色，通过波长选择通透性 滤片，可将不同波长的散射光和荧光信号区分开，送入不同的光电倍 增管。
选择不同的单抗及染料就可同时测定一个细胞上的多个不同特征。 荧光素与特异抗体结合，荧光抗体与细胞抗原结合越多，产生的荧 光信号越强
➢5.流式细胞仪分类：
2.流式细胞仪概述
临床型：光路调节系统固定，自动化程度高，操作简便，易掌握， 适用于临床常规测试；
科研型：分辨率高，选配多种波长和类型激光器，可将感兴趣细胞 分选到特定培养孔或板上，适用于科研。
2.流式细胞仪概述
BD公司的流式细胞分析仪
2.流式细胞仪概述
BD公司的流式细胞分选仪
3.信号检测与分析系统
3.流式细胞仪系统结构
➢信号检测系统由特异信号检测器件和非特异信号检测器件构成。
➢当细胞携带荧光素标记物，通过激光照射时，产生代表细胞内不同 物质、不同波长的荧光信号，这些信号以细胞为中心，向空间360度 立体角发射，产生非特异的散射光和特异的荧光信号。
➢荧光信号由PMT检测,前向角散射光信号由光电二极管检测。
线性放大器的输出与输入是线性关系，细胞DNA含量、RNA含量、 总蛋白质含量等的测量一般选用线性放大测量。
对细胞膜表面抗原等参数进行荧光检测时，通常使用对数放大器。
FL1, FL2, FL3, FL4（荧光）
3.流式细胞仪系统结构
激光光源
激光特点：单波长、高强度、高稳定性
目前主流产品标准配置： (1)多采用氩离子激光器或氦氖激光器 (2)一般选配2-4根激光，488nm 、633nm和355nm、407nmUV激光 (3)最多检测13个荧光参数
3.流式细胞仪系统结构
1.流动室和液流系统
流动室：仪器核心部件，被测样品在此与激光相交 液流驱动系统（压力泵）：空气泵+压力传感器
3.流式细胞仪系统结构
流动室：
流动室由样品管、鞘液管和喷嘴等组成，常用光学玻璃、石英等透 明、稳定的材料制作
样品管贮放样品，单个细胞悬液在液流压力作用下从样品管射出;
鞘液由鞘液管从四周流向喷孔，包围在样品外周后从喷嘴射出;
LP 500
SP 500
BP500/50
3.流式细胞仪系统结构
光收集系统：光电倍增管（PMT）
光电倍增管(PMT：photomultiplier tube)：放大电信号,光灵敏度高； 响应时间短，仅为ns数量级；光谱响应特性好，在200～900nm的光 谱区；用于测定弱信号(SSC、FL1、FL2、FL3、FL4)。 光电二极管：光灵敏度低，测定强信号（FSC）。
2.流式细胞仪概述
➢2.流式细胞仪的发展史与商品化：
•1953年：Parker 和 Hutcheon 描述一种全血细胞计数器装置，成为流 式细胞仪的雏型； •1969年：Van Dilla Fulwyler 发明第一台荧光检测细胞计； •1970年：Phywe研制脉冲细胞光度计，备有荧光镜的FCM，DNA定 量；同年Kamensky发明白细胞分类流式细胞仪，激光光源，吖啶橙 染色，测定淋巴、单核、中性粒C； •1972年： Len Herzenberg等在斯坦福大学研制荧光激活细胞分选仪 （FACS），氩离子激光，标志着流式细胞仪商品化时代到来； •1973年： Becton Dikinson (BD)公司投入市场，第一台FACS-Ⅰ问世， 其 后 2 0 多 年 来 不 断 改 进 完 善 产 品 ， 先 后 推 出 FA C S A n a l y z e r 、 FACScan、FACSCalibur、FACSLSR-Ⅱ、FACSVantage、FACSDiva、 FACSAria等； •1975年： Kochler 和 Milstein 提出单克隆抗体技术，为细胞研究中 大量的特异性免疫试剂的应用奠定基础；鉴于商业仪器的发展;
3.流式细胞仪系统结构
3.流式细胞仪系统结构
光学系统示意图
Flow Tip
SS and FL Detector
FS Detector
Laser
光收集系统：滤光片
LongPass
460 500 540
ShortPass
460 500 540
3.流式细胞仪系统结构
BandPass
460 500 540
3.流式细胞仪系统结构
2.激光光源与光学系统
FCM的光学系统由若干组透镜、滤光片和小孔组成，它们将不同波 长的荧光信号分别送入到不同的电子测控器。
激光光源：气冷式氩离子激光器 分色反光镜：反射长/短波长，通过短/长波长 光束成形器：两十字交叉放置的透镜 透镜组：形成平行光，除去室内光 滤光片：长通、短通、带通 光电倍增管：FS, SS（散射光）
激发波长 (nm) 488 488 488 488 488 488 488 633
发射波长(nm) 525 575 620 675 620 755 670 670
用途 免疫荧光 免疫荧光 免疫荧光 免疫荧光 DNA染色 免疫荧光
颜色 绿色 橙色 橙红 红 橙红 深红
3.流式细胞仪系统结构
➢荧光信号线性测量和对数测量
2.流式细胞仪概述
Beckman公司的流式细胞分析仪
2.流式细胞仪概述
Beckman公司的流式细胞分选仪：
3.流式细胞仪系统结构
3.流式细胞仪系统结构
➢流动室与液流系统 ➢激光光源与光学系统 ➢信号检测与分析系统 ➢分选系统
3.流式细胞仪系统结构
流 式 细 胞 仪 结 构 图
3.流式细胞仪系统结构
侧向角散射光示意图
Laser
FALS Sensor
90LS Sensor
测得的FS与SS信号通 过计算机处理，可得到 FS-SS图，由此可仅用散 射光信号对未染色的活 细胞进行分析或分选。
此为血细胞分类的基 本原理，但不能分析表 面分子。
3.流式细胞仪系统结构
单核细胞
ห้องสมุดไป่ตู้
淋巴细胞
中性粒细胞
光散射测量最有效的用途：从非均一群体中鉴别出某些亚群
流式细胞仪
1.流式细胞术概述 2.流式细胞仪概述 3.流式细胞仪系统结构 4.流式细胞仪软件介绍 5.流式细胞仪其它
目录
1.流式细胞术概述
1.流式细胞术概述
➢流式细胞术定义 ➢流式细胞术发展史 ➢流式细胞术特点
➢1.流式细胞术定义：
1.流式细胞术概述
流式细胞术(Flow Cytometry，FCM或 FACS)：是利用流式细胞仪 对处在快速、直线、流动状态中的单细胞或生物颗粒进行多参数、 快速定量分析，同时对特定群体加以分选的现代细胞分析技术。
3.流式细胞仪系统结构
前向角散射光示意图
Laser
FALS Sensor
3.流式细胞仪系统结构
➢侧向角散射光(SSC:side scatter):激光束照射细胞时，光以90° 角散射的讯号，与细胞精细结构和颗粒性质有关，对胞膜、胞质、
核膜变化更敏感，用于检测细胞内部结构属性。
3.流式细胞仪系统结构
2.流式细胞仪概述
➢4.流式细胞仪生产厂家：
目流式细胞仪生产厂家主要有 BD、Beckman Coulter、Partec、 Guava、Union Biometrica、ABI、Amnis 等等。
美国 BD、Beckman Coulter 和德国的 Partec 占领着流式细胞仪市 场的统治地位。
•1969年Van Dilla及其同事在Los Alamos, NM发明第一台荧光检测 细胞计
•1972年Herzenberg研制出细胞分选器 •1975年Kohler等提出单克隆抗体技术，为细胞研究提供大量的特异 免疫试剂大量厂家不断生产流式细胞仪
➢3.流式细胞术特点：
1.流式细胞术概述