有机磷农药的残留危害及其微生物降解
有机磷农药的微生物降解
有机磷农药的微生物降解摘要：现今农业发展过程中应用最普遍，种类最多的农药是有机磷农药，虽然原有的降解有机磷农药的化学、物理方法亦收到良好效果，但随着生物技术的卓越发展，微生物对降解农药尤其是有机磷农药发挥着日益重大的作用。
针对有机磷农药的微生物降解问题提出看法，希望促进农业的现代化发展。
关键词：有机磷农药微生物微生物源酶降解中图分类号：x592 文献标识码：a 文章编号：1007-3973（2013）004-089-02自1960年以来，众多国家开始限制、禁止使用有机氯农药，其逐步被有机磷农药所替代，有机磷农药具有广谱、高效等众多优点，但是随着农业的卓越发展，其被过多使用，产生的负面效应也日益突显，其不仅污染了水资源，而且致使残留在众多农产品中的农药严重超标，食品污染现象十分严重，最终威胁了人类的生存、发展，继而不利于社会的全面、协调与可持续发展。
至此，保护环境的时代背景下，有机磷农药的微生物降解问题备受世人关注，探究如何充分发挥微生物对降解有机磷农药的作用已成为环境保护的重大课题。
1 降解有机磷农药的微生物品种概述当前，我们主要是从被污染的环境介质（例如：被污染的泥土、土壤）中来获取高效降解菌。
现在人们已经分离出的对有机磷农药降解有良好效果的微生物菌群主要有真菌、细菌、放线菌及一些藻类。
真菌基于其较高的降解能力，人们十分关注，主要有：木霉属、曲霉属、酵母菌及青霉属等。
颜世雷等有关人员经过长时间的摇床驯化培养从被污染的土壤里筛选得到2株曲霉菌株，其能够在高浓度氧化乐果环境下生长。
当温度高达28℃时，其降解氧化乐果的比率高达70.38%及61.28%。
因为细菌具有容易引发突变菌株和生化多适应性的优点，故在微生物降解过程中它具有极高的地位。
目前已经分离出的细菌有：芽孢杆菌属、假单胞菌属、黄杆菌属、节杆菌属、不动杆菌属、沙雷氏菌属等。
例如：以解秀平为代表的有关人员从污水曝气池里分离出一株可以以甲基对硫磷以及其在降解过程中产生的对硝基苯酚是仅有的碳源的节杆菌属，其在5h内降解50mg/l的甲基对硫磷以及对硝基苯酚的比率达到85%与98%。
农药残留的微生物降解技术
农药残留的微⽣物降解技术农药残留的微⽣物降解技术刘淑娟,肖 军(泰⼭学院⽣物科学系,⼭东泰安 271021)[摘 要] ⼟壤和⽔体中存在⼤量可降解农药的微⽣物类群,并且这些微⽣物对农药的⼴泛降解性能也已被应⽤于许多实践⼯作,为治理环境污染提供了可靠保证.[关键词] 微⽣物;应⽤;途径;固定化;⽣物整治[中图分类号] Q93-3 [⽂献标识码] A [⽂章编号] 1672-2590(2004)06-0097-04 [收稿⽇期]2004—08—26 [作者简介]刘淑娟(1964-),⼥,⼭东平度⼈,泰⼭学院⽣物科学系副教授.由于农药具有成本低、见效快、省时省⼒等优点,在世界各国的农业⽣产中被⼴泛⽣产使⽤,仅1985年,世界的农药产量就达200多万t [1].在我国,仅1990年的农药产量就为22.66万t [2],其中甲胺磷⼀种农药的⽤量达6万t [3].农药残留问题便随着农药⼤量⽣产和⼴泛使⽤⽽产⽣了.由于化学农药主要是⼈⼯合成的⽣物外源性物质,⽽且很多类型是不易⽣物降解的顽固性化合物,有机农药的⼤量使⽤,使粮⾷、蔬菜、⽠果等农药残留超标,污染严重,给⾮靶⽣物带来了伤害.同时,在农药⽣产运输废⽔排放过程中也造成了对⼤⽓、⽔体及⼟壤等环境的严重污染,破坏了⽣态平衡,影响了农业的可持续发展,威胁着⼈类的⾝⼼健康.近⼏⼗年研究⼯作发现,⼟壤和⽔环境的农药降解中微⽣物起了主要作⽤,并分离到⼀批能降解或转化某种农药的微⽣物类群,弄清了微⽣物降解农药的主要作⽤⽅式及降解机制,以及各类化学农药微⽣物降解的途径,且在实践中得到了应⽤.1 常见降解农药的微⽣物类群已报到的农药降解微⽣物有细菌、放线菌、真菌等,且⼤多来⾃⼟壤微⽣物类群.其中由于细菌适应极性环境的能⼒强,且容易诱发突变株,从⽽占据了最主要的地位[4].⼏⼗年来优良菌株不断地从⼟壤和地下⽔中筛选出来,现列举⼏种农药及其降解菌,见表1.2 降解菌的富集分离为获取降解农药的微⽣物菌株,可从现已收藏的菌种中筛选,亦可以从⼟壤、⽔体或污染环境中直接分离筛选或经富集培养获得.⼟壤长期使⽤某⼀农药使得该农药降解菌逐渐富集,以后施⼊该农药时,其分解速率⼤⼤加快,这也是⼀些除草剂连续施⽤后效果下降的原因,[17]农药降解菌的获取主要是从这类⼟壤、⽔体或污泥等污染环境中直接分离筛选.如直接分离得不到⽬的微⽣物,可能是该微⽣物在试样中不存在或含量太少,遇到这种情况也可采⽤富集培养.农药降解菌的富集培养⽅法主要有:液体培养法、⼟壤环流法、连续流动培养法.通常是从长期被某种药剂污染的⼟壤和污⽔中取样经富集培养,再经固体培养分离纯化得到所需菌株.根据Veldkam p 的研究,富集培养可分为封闭式和开放式(即连续培养)2种类型.恒化器作为连续培养是⼀种有效⽅法.[7]它以⽬标农药作为培养中的⽣长限制底物,在这种选择原则的作⽤下,可筛选到降解⽬标农药的微⽣物菌株或诱发出有降解能⼒的突变菌株.第26卷第6期2004年11⽉泰⼭学院学报JOURNA L OF T AISH AN UNI VERSITY V ol.26 NO.6N ov 1 2004同时借助恒化器也可进⾏分⼦育种,如K elloge 曾在恒化器中接⼊各种有关农药降解的质粒菌,逐渐增加2,4,5-T 的浓度进⾏诱导,结果培养出能降解除草剂2,4,5-T 的⼯程菌,使难以被微⽣物降解的⾼残留除草剂有了“克星”.可见富集培养对农药降解菌的分离筛选起着重要作⽤.表1 常见降解农药的微⽣物序号微⽣物分解农药名称参考⽂献1⽩腐菌属(White -rot Funji )DDT 、七氯、林丹[5]2黄杆菌(Flav obacterium sp )对硫磷、杀螟松、⼆嗪农、甲基对硫磷[6]3链霉菌属(S treptomyces )阿特拉津[8]4⽩腐菌属(White -rot Funji )六六六、毒杀芬、氯丹、DDT [7]5地⾐杆菌属(B.Lichoniformis )甲胺磷、敌敌畏、对硫磷[16]6华丽曲霉(Aspergillus.orantus )甲胺磷[9]7假单胞菌属(Pseudom onas )2,4-D ,、茅草枯、敌裨、七氯、灭草隆、毒莠定扑草净、西马津、敌百⾍[10]8节杆菌属(Arthrobacter sp )甲基对硫磷、杀螟松、对硫磷[6]9曲霉属(Aspergillus )莠去津、草乃敌、利⾕隆、西马津、2,4-D 、西草净、敌百⾍、扑草净[10]10假单胞菌属(Psudom onas )甲单眯[11]11曲霉属(Aspergillus sp )乐果、甲胺磷、马拉硫磷、对硫磷[12]12尖孢镰孢(Fusarium F oxysporum )丁草胺[13]13青霉属(Penicillium sp )灭幼脲[14]14球⽑壳霉(Chaetomium globosum )甲草胺[15]15芽孢杆菌属(Bacillus sp )茅草枯、狄⽒剂、苯硫磷、甲基1605、灭草隆、莠去定、杀螟松、DDT 、M M DD [9]3 微⽣物降解农药的途径农药和其他的有机污染物质⼀样,微⽣物的降解途径主要有酶促降解作⽤和⾮酶促作⽤,⽽酶促作⽤则是微⽣物降解的主要形式.即化合物通过⼀定的⽅式进⼊微⽣物体内,然后在各种酶的作⽤下,经过⼀系列的⽣理⽣化反应,最终将农药完全降解或分解成分⼦量较⼩的⽆毒或毒性较⼩的化合物的过程.⾮酶促作⽤是指微⽣物活动使环境pH 发⽣变化⽽引起农药降解,或产⽣某些辅助因⼦或化学物质参与农药的转化.主要包括氧化、还原、脱卤、脱烃、酰胺及酯的⽔解、环裂解、缩合或共轭形成等.[10]4 微⽣物降解农药的应⽤性研究近年来,随着微⽣物降解农药机理的阐明和分⼦⽣物学的兴起,越来越多的科研⼯作者把研究的⽅向转向农药微⽣物降解的应⽤性研究.由于农药对环境的污染不仅在于其在农⽥的使⽤产⽣的残留上,很⼤⼀部分污染是在农药的⽣产和运输过程中就已发⽣,如农药⼚排出的废⽔就是⼀个重⼤的污染源,这些废⽔对环境造成严重污染和危害.⼤部分农药⼚都采⽤了微⽣物降解的⽅法来处理⽣产废⽔.⽬前常⽤的⼏种处理⽅法主要有活性污泥法、⽣物膜法、氧化塘法、废⽔的厌氧及需氧⽣物处理法等.但这些常规⽅法有⼀些缺点不能克服,如活性污泥法易发⽣污泥膨胀现象,易产⽣⼆次污染等.为克服这些缺点,科研⼈员把⽬光转向新的⽅向,如固定化微⽣物技术、⽣物整治技术、基因⼯程菌的构建等都是当前研究的热点.4.1 固定化微⽣物技术在农药⽣产废⽔处理中的应⽤研究固定化微⽣物技术是⽣物⼯程领域中的⼀项新技术,它是通过采⽤化学或物理的⼿段将游离细胞或酶定位于限定的空间区域内,使其保持活性并可重复利⽤.由于其有利于提⾼⽣物反应器内的微⽣物细胞浓度和纯度,并保持⾼效菌种,污泥产量少,⼆次污染⼩,利于反应器的固液分离等特点,[18]⼈们开始考虑利⽤固定化微⽣物技术取代传统的活性污泥法.⼀般固定化微⽣物的制备⽅式⼤致可分为吸附法、共价结合法、交联法和包埋法四⼤类.其中包埋法是微⽣物固定化最常⽤的⽅法.微⽣物及其降解酶的降解作⽤是环境中农药分解和转化的重要途径,利⽤固定化微⽣物技术固定这些有降解作⽤的微⽣89 泰⼭学院学报第26卷物和酶,再⽤这些固定化产物处理农药、杀⾍剂废⽔的研究已取得⼀些成果,显⽰出良好的应⽤前景.4.1.1 固定化细胞的应⽤陈敏等[19]利⽤聚⼄烯醇包埋活性炭固定微⽣物,对⽔胺硫磷的降解进⾏试验,取得满意的结果,固定化微⽣物对该农药的降解能⼒优于未固定化微⽣物,经固定的微⽣物对温度、酸碱度和⽔胺硫磷浓度适应范围扩⼤.Y ang,T.P 等⼈⽤三醋酸纤维素包埋固定酚驯化污泥来降解2,4-D ,当⽔中2,4-D 浓度为250mg ΠL 时,出⽔浓度可降⾄⼩于15mg ΠL ,去除率达97%.P otier ⽤多孔载体Celie R -630吸附固定假单胞菌处理含氯⼄酸盐的杀⾍剂⽣产废⽔,氯⼄酸钠的去除率为99%,T OC (总有机碳)的去除率为89%.农药是⼀种难降解的⼈⼯合成物,⽤单⼀菌种处理很难彻底降解,这就需要固定多种细胞形成多步反应器,通过各种微⽣物的协同作⽤⾼效降解农药.J.Beuuin 曾在此⽅⾯做过探索,他⽤海藻酸钠同时固定产碱杆菌、阴沟肠杆菌,在这个多细胞⽣物反应器中同时发⽣了好氧和厌氧降解反应,将DDT 还原为DDD ,并将DDT 的分解产物DDM 氧化分解,从⽽达到完全降解DDT 的⽬的.由于固定化细胞对底物和氧⽓扩散有阻碍,使细胞酶活性降低.[20]通过基因⼯程⼿段制备⾼效⼯程菌是解决问题的关键.闫延春等[21]克隆抗性库蚊的酯酶基因并在⼤肠杆菌中⾼效表达,⽤海藻酸钠包埋固定此⼯程菌,并处理有机氯农药三氯杀⾍酯,菊酯类农药溴氰菊酯.结果表明,固定化⼯程菌能⾼效降解这两种农药.4.1.2 固定化酶技术的应⽤微⽣物对农药的降解虽卓有成效,但与降解酶相⽐他的应⽤受到限制.因为降解酶往往⽐这类酶的微⽣物菌体更能忍受异常环境条件,如不适宜的酸碱度、温度、毒素、天敌和⾼浓度农药及其产物都会破坏微⽣物的降解作⽤;⽽降解酶的应⽤却不受这些因素的限制,酶可以在微⽣物不能忍受的极端环境下起作⽤,不受天敌影响,⽽且不受微⽣物的抑制作⽤,多酶反应器的研制成功更有利于降解酶的应⽤.现在已知仅⽔解酶就有酯酶、溶菌酶、酰胺酶等多种酶对农药起降解作⽤.我国安徽固源⽣物⼯程公司与多家国家级科研单位合作,从单细胞微⽣物中筛选出⼀种⾼效、⼴普的农药降解酶,发明了利⽤⽣物⼯程⼿段来⼯业化⽣产农药降解酶技术.这种⾼科技⽣物酶技术,对我国⼤量使⽤的有机磷农药,如1605、甲基1605、敌敌畏、⼆嗪农、毒死蜱等均有很⾼的降解率.常温下7～15分钟,在产品推荐的使⽤量下,在这类农药超过国家允许残留标准40倍左右时,其降解率能够达到90%～98%,,也就是说,可以基本甚⾄完全清除蔬菜⽠果上残留农药.⽽且这种产品可以⼀年四季在不同地区和不同⽓候条件下⼴泛使⽤.4.2 ⽣物整治技术的应⽤⽣物整治(Bioremediation )是传统的⽣物处理⽅法的延伸,其新颖之处在于它治理的对象是较⼤⾯积的污染.[22]⼜由于它具有就地处理,修复经费低,不产⽣⼆次污染,修复时间短等特点,⽬前已成为⼀种新的可靠的环保技术.作为⼀种⼴泛使⽤的除草剂,莠去津的微⽣物降解研究较多.⽤⼟著菌和混合菌矿化莠去津都已得到证明.Shapir 等报道取⼟壤表层10～20cm 被莠去津污染的⼟壤,依靠⼟壤本⾝的⼟著微⽣物降解作⽤,虽然有50%的莠去津能被降解,但只有1%能完全矿化,⽽在受到莠去津污染的⼟壤中加⼊假单胞杆菌进⾏⽣物整治,可使其矿化率达90%～100%.⽣物整治中利⽤的微⽣物可分为⼟著微⽣物、外来微⽣物和基因⼯程菌.接种的外来菌在实际环境中难保持活性,⼯程菌的应⽤在欧洲⼀些国家也受到严格限制.[23]因此⽣物整治中实际应⽤的微⽣物多为⼟著微⽣物.对于⼀些难降解的⾼浓度农药,需要考虑接种多种微⽣物或激发当地多样的⼟著微⽣物,如⼴泛使⽤的除草剂阿拉特津的矿化速度⾮常慢,Brand C 等从长期使⽤这种农药的⼟壤中分离到⼀个混合微⽣物培养物,在液体培养中7d 内就可将0.56mm ol ΠL 的阿拉特津矿化96%,在⼟壤中,它可以将0.14mm ol ΠL 的该除草剂在25d 内完全降解,145d 后,他的中间产物羧基氯⼄异丙嗪也在⼟壤中完全消失.接种降解菌后,⼟壤中该农药的矿化速度⽐不接种时提⾼了20倍,且没有代谢产物残留.虽然农药残留的微⽣物降解研究已经取得了很⼤的进展,⽽且也有了⼀些应⽤的实例,但研究⼤多99第6期刘淑娟:农药残留的微⽣物降解技术局限在实验室中.[24]与⼤⽥的农药应⽤情况相⽐较,实验室常⽤纯培养⽅式进⾏试验,得到的降解菌应⽤到⽥间或者⾃然环境条件下其降解活性容易丧失.另外在实验室⾥得到的微⽣物在向⼤⽥释放和直接应⽤时,其对环境的安全性以及对⼈和其他⽣物是否有害必须认真深⼊细致地研究.如何使实验室得到的结果与⼤⽥应⽤相结合,是⼀个有待进⼀步进⾏探讨的复杂⽽具有实际意义的课题.[参考⽂献][1]杨光启,侯祥麟,时钧,等.中国⼤百科全书(化⼯卷)[M].北京?上海:中国⼤百科全书出版社,1987.[2]韩熹莱,钱传范,陈馥衡,等.中国农业百科全书(农药卷)[M].北京:农业出版社,1993.[3]阮少江,刘洁,赵永芳,等.微⽣物降解甲胺磷农药的进展[J ].宁德师专学报,2000,12(3):177-180.[4]郑重.农药的微⽣物降解[J ].环境科学,1991,11(2):68-72.[5]Aris oy M.Biodegradation of chlorinated organic com pounds by white -rot fungi[J ].Bull.Environ.C ontam.T oxicol,1998,60:875-876.[6]M allick K,Bharati K,Banerji Aetal.Bacterial degradation of chlorpyifos in pure cultures and in s oil[J ].Bull.Environ.C ontam.T oxicol ,1999,62:48-54.[7]李慧蓉.⽩腐真菌的研究进展[J ].环境科学进展,1996,4(6):69-77.[8]France S.Degradation of atrazine in s oil by streptomyces[J ].Environ.Sci.Health ,1998,33(1):37-49.[9]刘⽟焕,钟英长.甲胺磷降解真菌的研究[J ].中国环境科学,1999,19(2):172-175.[10]王家玲.环境微⽣物学[M].北京:⾼等教育出版社,1988.[11]王保军,刘志培,杨惠芳.单假脒农药的微⽣物降解代谢研究[J ].环境科学学报,1998,18(3):296-302.[12]刘⽟焕,钟英长.真菌降解有机磷农药乐果的研究[J ].环境科学学报,2000,20(1):95-99.[13]Chakraborty S K,Anjan Bhattacha ⽇ya.Degradation of butachlor by tw o funji[J ].Chem osphere ,1991,23(1):99-105.[14]施国涵.⼟壤微⽣物对灭幼脲3号杀⾍剂代谢作⽤的研究[J ].环境科学学报,1990,10(3):296-303.[15]郑和辉,叶常明.甲草胺和丁草胺等除草剂在介质环境中环境⾏为综述[J ].环境科学进展,1999,7(3):1-10.[16]王永杰,李顺鹏,沈标等.有机磷农药降解菌的紫外诱变育种[J ].应⽤与环境⽣物学报,1999,5(6):635-637.[17]虞云龙,樊德⽅,陈鹤鑫.农药微⽣物降解的研究现状及策略[J ].环境科学进展,1996,4(3):28-35.[18]陈铭,周晓云.固定化细胞技术在有机废⽔处理中的应⽤与前景[J ].⽔处理技术,1997,23(2):98-104.[19]陈敏,罗启芳.聚⼄烯纯包埋活性炭与微⽣物的固定化技术及其对⽔胺硫磷降解的研究[J ].环境科学,1994,15(3):11-14.[20]张慰问,张灼.固定化微⽣物技术在废⽔处理中的应⽤和研究[J ].上海环境科学,1991,10(10):20-24.[21]闫艳春,乔传令,周晓涛.⼀种⼯程菌的⾼酶活及其固定化细胞对农药的降解[J ].中国环境科学,1999,19(5):461-465.[22]林⼒,杨慧芳.⽣物整治技术进展[J ].环境科学,1997,18(3):67-71.[23]张景来等.环境⽣物技术及应⽤[M].北京:化学⼯业出版社,2002.[24]王伟东等.农药的微⽣物降解研究进展[J ].环境污染与防治(⽹络版),2004,(3):1-10.Microbial technology of reducing and dissolving pesticide remainsLI U Shu -juan ,XI AO Jun(Department of Biology Science ,T aishan University ,T ai ’an 271021,China )Abstract :There exist many microbes in s oil and water.These microbes have been widely utilized in practice to reduce and diss olve pesticide ,which provides reliable guarantee for environmental pollution prevention.K ey w ords :microbe ;utilization ;ways ;regularity ;microbial administration 001 泰⼭学院学报第26卷。
农药降解综述
有机磷农药的降解综述摘要：农药是环境中重要的污染物，农药污染严重危害人类健康。
近年来，对农药降解方面的研究越来越多，尤其是在一些难降解、高残留、高毒的有机磷农药降解方面。
该文综述了近年来在有机磷农药降解方面的研究进展，并提出农药降解研究领域的发展趋势和未来工作的展望。
关键词：农药微生物降解有机磷农药有机磷农药主要是用于杀虫剂领域，尤其是在我国的杀虫剂领域中，有机磷农药更是有着举足轻重的地位。
世界有机磷类杀虫剂的产量占整个杀虫剂产量的1/3以上，年销售额在30亿美元以上，而我国的有机磷杀虫剂产量则占整个杀虫剂总量的70%以上[1]。
虽然它的大量使用提高了作物的产量, 但对环境造成一定的危害，而且对人体存在着急性中毒的危险[ 2]。
因此, 了解有机磷农药的特性，研究有机磷农药的降解具有重要的现实意义。
1有机磷农药性质有机磷农药是含磷的有机化合物,根据磷原子的电子构型可知形成化合物时3d 空轨道可参与成键, 形成含d-Pπ配键的5 价磷化合物,因此,有机磷农药的种类十分繁多。
现世界上有机磷农药的种类达 150多种[ 3] 。
有机磷农药一般分为四类 :磷酸酯类、硫代磷酸酯类、硫代膦酸酯类、硫代磷酰胺类。
有机磷农药是醇类与磷酸结合的酯类化合物，或者是磷酸与其它有机酸结合而成的酸酐类化合物，常含有三个磷酯键，所以又被称为磷酸三酯，所有的有机磷农药都含有P=O或P=S基团[4]。
2 有机磷农药的非生物降解2.1 农药的化学降解进入土壤中的农药在有氧或无氧的情况下就会发生氧化．还原反应，例如特丁磷、甲拌磷、异丙胺磷和涕灭威在土壤氧气充足时候很快氧化：对硫磷、杀螟磷、氯硝醚在厌氧条件下能很快分解[5]。
农药的氧化-还原反应是与土壤中的氧化还原电位密切相关的。
当土壤透气性好时,其Eh高，有利于氧化反应进行，反之则利于还原反应进行。
单甲脒在好氧条件下在水稻土中的半衰期为3．69 d，而在厌氧条件下期半衰期为5．56 d，说明单甲脒在厌氧条件下比在好氧条件下降解慢[6]。
有机磷农药降解方法及应用研究新进展
3、生物法
生物法利用微生物或酶的催化作用降解有机磷农药。微生物降解是通过微生 物体内的酶系统将有机磷农药分解成小分子。这种方法具有环保、经济等优点， 但需要合适的微生物种群和适宜的生长条件。酶降解是有机磷农药降解的另一种 生物法。在酶降解中，特定的酶能够催化有机磷农药的分解反应，将其分解成小 分子。这种方法具有高效、专一性强等优点，但需要寻找合适的酶源，且酶的稳 定性可能影响其应用效果。
四、应用前景
微生物降解技术具有广阔的应用前景。目前，已经开发出了一些基于微生物 降解的生物修复技术，用于治理有机磷农药污染土壤。这些技术包括：
1、生物强化技术：通过添加具有降解能力的微生物，提高土壤中有机磷农 药的降解速率；
2、生物堆肥技术：将有机废弃物与污染土壤混合堆肥，通过微生物的作用 将有机磷农药降解为无害物质；
四、结论
有机磷农药降解方法及应用研究新进展为解决环境和食品安全问题提供了新 的思路和方法。随着科学技术的发展和研究的深入，相信未来会有更多高效、环 保、经济的有机磷农药降解方法被发现和应用，为保护环境和人类健康做出更大 的贡献。
参考内容
有机磷农药（OPPs）是农业生产中广泛使用的一种合成杀虫剂，然而，它的 滥用或不合理使用可能会导致土壤污染。土壤中的有机磷农药对环境和人类健康 构成威胁，因此，研究如何有效降解土壤中的有机磷农药具有重要意义。在这篇 文章中，我们将探讨有机磷农药污染土壤的微生物降解研究进展。
1、物理法
物理法中的热分解和光分解是常见的有机磷农药降解方法。热分解通过加热 将有机磷农药分解成小分子，光分解则利用紫外线、可见光等光源照射有机磷农 药，使其分解成小分子。这两种方法均能有效地降解有机磷农药，但需要较高的 能量输入，且可能产生二次污染。
农药残留在环境中的行为过程、危害及治理措施
农药残留在环境中的行为过程、危害及治理措施内蒙古自治区巴彦淖尔市015000摘要：农药是现代化农业的重要组成部分，而农药的使用却是一把双刃剑，科学安全使用农药，对防病治虫、促进农业稳产高产具有重要的作用，但是由于不科学使用农药与施药技术落后等原因，会导致农药残留在植物与环境中，造成危害。
菜农在种植水果蔬菜时，缺乏科学管理理念，滥用农药，导致农药在果蔬产品中残留量超标，如果消费者未充分洗净，可能会对人体健康造成危害影响。
有机磷农药是较为常用农药中的一种。
本文分析了在环境中的残留行为与危害，提出了应对措施建议。
关键词：农药；环境；残留；蔬菜在我国农业生产有着十分重要的作用，是我国国民经济的基础。
随着人口的不断增加，人们对农产品的需求不断增长，农业经济的重要地位日益显现。
在农业生产中，为了保证农作物增产、农民增收，不可避免地要使用农药。
有机磷农药作为一类高效、广谱的杀虫剂正被广泛地用于农业防害以及家庭、仓储等的杀虫，但大量使用后产生的环境危害也日益严重。
农药的急性中毒，特别是果蔬食品污染后引发的群体中毒事件屡有发生。
因此对有机磷农药进行危害分析很有必要。
一、农药农药是指在农业生产中用于预防农作物病虫害、消除杂草、促进或控制植物生长的各种药剂的统称。
农药是农业上用以防治病、虫、草害的有毒化学物质。
由于具有高效、速效、方便、适应性广、经济效益显著等特点而被广泛应用于农业生产中，但是由于长期大量地使用农药，在得到显著效益的同时，也产生了广泛的副作用。
农药残留指使用农药后残留于生物体、农副产品和环境中的微量农药及其有毒的代谢物的总量。
研究农药残留的组分和数量及其对人、畜、其他生物和环境可能造成的毒害和污染，目的是通过科学合理使用农药以减少其对环境的污染及对人畜和生态系统的不良影响。
二、农药在环境中残留行为喷洒后的农药在环境中主要去向：一是沉积到粑标农作物上，二是直接或间接进人土壤中，三是通过降雨或地表径流冲刷，使大气中或地表土壤中的农药进人到水系中，四是通过蒸发作用与气流运动进人到大气中。
有机磷农药的残留、毒性和展望
有机磷农药的残留、毒性和展望作者：杨迪来源：《硅谷》2014年第06期摘要有机磷农药问世到现在已70年了。
由于它的高效、快速和广谱等特点，在农药领域一直占有重要位置，对全球农业的发展起了很重要的作用。
但随着它的不断使用，也暴露出了很多问题，如高残留、毒性强等，引起了人们的高度重视。
文章主要对有机磷农药的残留检测、毒性作了初步的分析，指出尽快开发替代产品是今后使用有机磷农药的方向。
关键词有机磷农药；毒性；残留中图分类号：S48 文献标识码：A 文章编号：1671-7597（2014）06-0178-02随着社会的进步和人们生活水平的提高，人们更加关注和重视健康和食品安全问题。
农药可以用来杀灭昆虫、真菌和其他危害作物生长的生物。
最早使用的农药有滴滴涕、六六六等，它们能大量消灭害虫。
但它们的稳定性好，能在环境中长期存在，并在动植物及人体中不断积累，为此被淘汰。
后来改用有机磷农药，如敌敌畏等，替代最初的农药。
然而它们的毒性太大，对人畜的危害很大。
农药残留污染已经成为一个亟待解决的问题。
根据防治对象，可分为杀虫剂、杀菌剂、杀螨剂、杀线虫剂、杀鼠剂、除草剂、脱叶剂、植物生长调节剂等。
有机磷农药，是用于防治植物病、虫、害的含有机磷的有机化合物。
这一类农药品种多、药效高，用途广，易分解，在农药中是极为重要的一类化合物。
但有不少品种对人、畜的急性毒性很强，因高分子聚合物不易氧化、分解，也难被微生物降解，能长期在环境中滞留，可能发生化学变化转化成为毒性更强、危害性更大的二次污染物。
同时，残存于植物体内的成分可以通过食物链的富集作用，使食物中农药残存量超过卫生标准。
因此在使用时特别要注意安全，防止造成环境污染或影响人体健康。
“1605对硫磷”是1944年德国拜耳公司制造出的世界上第一种有机磷杀虫剂，到今天有机磷农药的使用已达70年之久。
目前世界上现有的有机磷农药有几百种之多，我国有200多种，我国有机磷农药的产量约占世界总产量的1/3。
微生物降解有机磷农药甲胺磷的研究
微生物降解有机磷农药甲胺磷的研究[摘要]对培养的华丽曲霉菌种降解甲胺磷的效果进行了研究，并对不同条件下的降解情况进行了讨论。
实验结果表明，当甲胺磷浓度一定时，华丽曲霉菌种的用量在80 kg/hm2时降解的效果最好。
当农药浓度在2．00-300mg/kg范围内，华丽曲霉菌均有明显的强降解作用。
同时也对华丽曲霉菌种降解甲胺磷的代谢机制进行了推测。
[关键词]甲胺磷降解有机磷农药(Organophosphates简称OPS)一直国内外广泛生产和使用的农药产品，其产品已达上百种。
国内广泛使用的约有30种，其中80％以上是剧毒农药如甲胺磷、甲基对硫磷、对硫磷、久效磷、敌敌畏等。
甲胺磷是其中用量最大，用途广泛的一种水溶性的广谱杀虫、杀蜗剂。
化学名称为：O，S－甲基胺基硫代磷酸酯。
结构式见下图所示。
该农药具有胃毒、触杀和内吸作用可用于防治水稻、棉花、玉米等作物的多种害虫。
甲胺磷的结构式尽管甲胺磷农药属非持久性农药，却由于其在我国使用而广、频繁量大，易在土壤、水体中短时间内积累，已超过一般微生物的净化能力，必然会对环境产生污染，对人、畜构成潜在的威胁，在某些环境条件下也会有较长的残存期并在动物体内产生蓄积作用。
我国近10年来发生的农药中毒事故大多数集中于高毒有机磷农药，尤其是甲胺磷。
因此，甲胺磷已成为我国优先检测的10种农药品种之一。
能分解甲胺磷的微生物系有细菌、放线菌、酵母、霉菌、藻类等，尤以细菌为多。
许多科研工作者对此作了大量的研究，筛选出能够降解甲胺磷的一些菌种。
从甲胺磷的结构来看，可能降解甲胺磷微生物有以下几种情况：①能以甲胺磷为唯一碳源和能源生长的矿化菌。
由于甲胺磷为C1化合物，因此这类菌必为甲基营养菌。
而矿化菌又可分为：(a)不能利用甲胺磷作唯一氮源；(b)能利用甲胺磷作唯一氮源；②不能利用甲胺磷为碳源和能源生长，但辅加其它可利用碳源后，可降解甲胺磷的共代谢菌其又可分为；(c)不能利用甲胺磷为碳、氮源；(d)能利用甲胺磷为唯一氮源。
微生物对有机磷农药的降解
5.2降解酶基因的克隆、表达调控及基因工程的构建 降解酶基因的克隆、 降解酶基因的克隆 （ GMO ）；
目前已经有很多关于 GMO 的研究, 比如, WilfredChen[ 10] 构建 的带有有机磷水解酶基 因的工程大肠杆菌, 可 以迅速的降解有机磷农 药。但是, 随着分子生 物学的迅猛发展, 新技 术,新方法不断涌现, 降 解酶基因克隆、表达调 控以及GMO 的构建将 会针对性更强, 效果更 明显。
降解
有机磷农药
主要内容
1 、有机磷农药简介 2 、微生物降解有机磷农药 3 、有机磷农药降解酶 4 、微生物降解农药的作用机理 5 、微生物降解农药的研究进展 6、 前景展望
1 、有机磷农药简介 有机磷农药简介
有机磷农药是农药中很重要的一类，一直在国 有机磷农药是农药中很重要的一类，一直在国 内外大量生产和广泛使用。目前，世界上的有 机磷农药的商品已达百种，我国使用的有机磷 农药约有30种，包括杀虫剂，除草剂等。农药 农药约有30种，包括杀虫剂，除草剂等。农药 在农业生产中广泛使用，而有机磷农药占整个 农药的60%，在有机磷农药中80%以上是剧毒 农药的60%，在有机磷农药中80%以上是剧毒 的有机磷农药如；甲胺磷，甲基对硫磷，对硫 磷，久效磷，敌敌畏等，仅甲胺磷的使用量一 年就高达6.5万吨，其他大吨位的有机磷农药还 年就高达6.5万吨，其他大吨位的有机磷农药还 有乐果，氧化乐果和辛硫磷等。它具有高效的 杀虫能力，为增加粮食生产防治疾病传播做出 了巨大贡献。但是有机磷农药的生产运输和大 量使用对生态环境中其他非靶生物乃至土壤、 水、大气整个生态系统产生的负面影响日益严 重，尤其是水果蔬菜等农产品中的农药残留通 过食物链在生物体内富集对人类找成严重危害 更不容忽视。
6.2 在识别降解酶基因的基础上，对降解基因 进行克隆与表达，构建工程菌，提高降解 能力，制备降解酶；
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环境与健康期末论文教师：蔡兰坤学院：资源与环境学院学号：B2014009班级：环境122姓名：严义昌有机磷农药的残留危害及其微生物降解严义昌资环学院环境122学号：B2014009（华东理工大学资源与环境学院，上海201424）摘要：有机磷农药因为自身的优良特性开始逐步取代对环境危害更大的有机氯农药，它的大量使用在提高了作物产量的同时也对动物和人体产生了许多负面效应，造成了全球性的环境污染和生态破坏.而有机磷农药残留问题已经直接威胁到人类的生存和可持续发展.微生物因为众多的种类和新城代谢的多样性在有机磷农药降解中表现出独特的优势.对降解有机磷农药的微生物种类，有机磷降解菌的获得和鉴定，有机磷的降解机理，有机磷农药降解菌的广谱性和目前存在的问题以及未来的研究方向做出论述.关键词：有机磷农药；微生物降解；降解机理；降解菌广谱性20世纪60年代以来，由于有机氯农药难以被动植物降解而且在生物体内降解速度慢，致使许多国家开始限制和禁止使用有机氯农药.有机磷农药作为有机氯农药的替代品，因为具有品种多，成本低，药效好，应用范围广，对自然环境的污染以及对生态系统的危害和残留没有有机氯农药那么普遍和突出等优点迅速发展起来，从20世纪70年代起，有机磷杀虫剂的使用量逐年上升.正是因为有机磷农药在我国大量、频繁和反复地使用，导致其过量残留.残存于作物、土壤或水体中的有机磷农药，经物理迁移或化学转化，最终通过食物链的传递和富集作用影响人类及其他有益生物体[1].世界上有机磷农药种类超过150种，中国生产和使用的有机磷农药有将近40种，其中常用的有敌百虫、乐果、敌敌畏、马拉硫磷、对硫磷、辛硫磷等.有机磷农药的结构区别很大，毒性也大不一样，其中对硫磷类农药的毒性最大.1有机磷农药的毒性效应有机磷农药引起的中毒主要为急性中毒，以神经症状为主.轻度中毒时表现为头痛、头晕、恶心、呕吐、疲倦、食欲不振等症状，血液胆碱酯酶活力下降到70%-50%；中度中毒时除上述症状加重外，还会出现肌肉震颤、瞳孔缩小、胸闷、轻度呼吸困难、流涎、流汗、腹痛、腹泻、血压和体温升高等症状，血液胆碱酯酶活力下降到50%-30%；重度中毒除上述症状和特征外，并伴有心率加快、血压升高、瞳孔高度缩小、肌肉震颤明显、呼吸困难、昏迷、循环衰竭等，少数人出现脑水肿，血液胆碱酯酶活力下降到30%以下.同时研究表明有机磷农药具有遗传毒性，可导致基因内部DNA的改变，并引起一定的表型变化.除了急性毒性外，也发现了有机磷农药的慢性毒性作用，不过其慢性中毒症状无明确的特异性，仅以神经衰弱综合征为主，如头痛、头晕、食欲不振、记忆力减退等.有机磷农药作为潜在的化学致癌物还可能参与癌症的发生.经流行病学调查发现，非霍奇金淋巴瘤（NHL）、白血病、前列腺癌的发生同接触有机磷农药混合物密切相关.1995年在对美国某农产进行调查时，发现该农场工人NHL的发病率高于没有接触有机磷农药人群.有机磷农药具有遗传毒性，可导致基因内部DNA的改变，并引起一定的表型变化.有研究表明，暴露在不同浓度的甲基对硫磷、甲基吡啶磷、敌敌畏条件下，可以导致黑腹果蝇三期幼虫两个遗传标记点的交叉杂合，在表型上观察到果蝇翅膀大小和形状的突变.早有报道久效磷具有遗传毒性，可导致生物机体的一系列生化指标如血浆蛋白含量、肝脏的DNA和RNA含量等改变.敌百虫、敌敌畏和乙酰甲胺磷可以显著诱发中国仓鼠（Phodopus griseus）卵巢细胞（CHO细胞）离体细胞姐妹染色体互换（SCE）的产生，并导致染色体的畸变.有机磷农药也具有生殖发育毒性.在给予了致死和亚致死浓度的敌敌畏后，鲶鱼的卵母细胞组织结构明显异常.长期慢性接触有机磷农药的男性，其精子的质量和数量均呈下降趋势，有机磷农药与精子多倍体和亚倍体的发生有密切关系.有调查表明，有机磷农药作业女工（主要生产乐果、氧化乐果、甲胺磷的供料车间、合成车间和包装车间工作）生殖功能异常，常有早产、过期产、自然流产等症状[2].2有机磷农药作用机制有机磷农药进入机体后，主要抑制机体内乙酰胆碱酯酶，使其失去活性.乙酰胆碱酯酶（AchE）是生物神经传导中的一个关键酶，主要位于突触后膜，临近胆碱受体，能降解乙酰胆碱，终止神经递质对后膜的刺激作用，保证神经冲动在突触间正常传导.有机磷农药进入机体后，其磷酸根迅速与胆碱酯酶的活性中心结合，形成磷酰化胆碱酯酶，因而失去分解乙酰胆碱的作用.以致胆碱能神经末梢补位所释放的乙酰胆碱不能迅速被其周围的胆碱酯酶所水解，结果导致乙酰胆碱蓄积，从而过强地刺激胆碱能神经系统，引起组织器官功能性改变，发生一系列的中毒症状.3降解有机磷农药的微生物种类自然环境中存在的部分细菌、真菌、放线菌、藻类等都对有机磷农药具有降解作用，而其中研究得比较深入的有细菌和真菌2类[3].细菌包括：假单胞菌属(Pseudomonas)、芽饱杆菌属(Baccillus)、节细菌属(Arthrabacter)、棒状杆菌属(Corynobacterium)、黄杆菌属(Flavobacterium)、黄单胞杆菌属(Xanthamonus)、固瘤细菌属(Azotomonus)、硫杆菌属(Thiobacillus)等.真菌有：曲霉属(Aspergillus)、青霉属(Pinicielium)、木霉属(Trichoderma)、酵母菌等.藻类对有机磷也有降解作用，如小球绿藻属(Chorolla)降解甲拌磷、对硫磷等[4].在自然环境中，能降解有机磷的细菌数量远远多于能降解有机磷的真菌数量，但是在降解能力上，细菌的效果要比真菌差，并且遗传性状不如真菌稳定，可能会因为多次传代而渐渐失去降解能力.4有机磷农药降解菌的获得与鉴定4.1降解菌的获得目前，降解有机磷农药的微生物获得途径主要有：(1)从受污染的土壤、水体底泥以及农药生产厂污水处理曝汽池中的污泥等受污染的环境介质中筛选、驯化、富集和分离高效降解菌，这是目前最为常见也是采用最多的一种方法.(2)定向培育优良有机磷降解菌种，其方法是在土壤中通过人为多次施药，培育可降解该农药的微生物，当再次施药时，经降解速率的测定，如发现农药在该土壤中的降解速度快于未施药土壤，则可确定降解该农药的微生物种群已培育起来，而后可从中分离出高效降解菌株，如Ronald等连续向土壤中施用乙烯菌核利，诱发筛选出该农药的降解菌假单胞杆菌，Alian.W等通过向土壤中施加萘丙酸草胺诱发该农药降解菌的产生并分离.(3)在上述两种方法的基础上进行诱变育种，王永杰通过紫外诱变育种获得高效菌株.刘玉焕等用NTG诱变曲霉乐果降解菌，经测定该诱变菌株对乐果的降解率明显提高.4.2降解菌的鉴定降解菌的鉴定方法有表形鉴定法和遗传型鉴定法.菌的形态特征、培养特征、生理生化特征、生物分型抗微生物易感性试验、血清分型、噬菌体分型、免疫印迹法和多位点酶电泳法等方法都是根据菌体的表现类型对细菌进行分类与鉴定的，统称为表型分类鉴定法.另一种方法是遗传型分类鉴定法，这些技术包括GC含量的测定、DNA 杂和率的测定、rRNA 相关度的分析、16srRNA碱基序列的测定、核糖体蛋白的组成分析、质粒图谱分的析、限制性核酸内切酶分析法、脉冲场凝胶电泳、PCR指纹图分析法.准确的菌株鉴定应该是表形鉴定和遗传型鉴定的综合运用，降解菌的准确鉴定是农药生物修复中的一项重要工作，它对于开发农药降解菌资源，了解降解基因的起源与分布具有重要意义[5].5.微生物降解有机磷农药机理的研究微生物对有机磷农药的降解方式可大体分成两类.一类是微生物直接作用于有机磷农药，其反应实质是酶促反应[6]，因为微生物本身含有可降解该农药的酶系基因，通过氧化、脱氢、还原、水解、合成等作用将污染物进行讲解，主要是.或者，虽然微生物本身并无可降解该有机磷农药的酶系，但在农药胁迫下，微生物的基因发生重组或改变，产生了新的降解酶系.Mageong 等报道大肠杆菌产生的磷酸三酯酶能打开P=S 键[7].路杨等分离出的菌株可以不同程度地打断甲胺磷中的P=N 键、P=O 和P=S键，完全转化为PO 43-.阮少江研究发现，甲胺磷经甲胺脱氢酶(MADH)催化后，P=N 键被打开脱氨基，同时可检出一定量的甲醇、PO 43-和CH 3SH.由此，他推测自然界中甲胺磷的降解很可能是从P=N 的断裂开始的.对于微生物在其他种类有机磷上的降解方式，有不同的报道.Liu 等在分离到的抗辐射不动杆菌USTB-04降解甲基对硫磷的过程中，没有发现任何中间产物和最终产物.由此，他推测出USTB-04首先促使苯环上的C-C 键发生断裂而非作用于P=O 键.另一类是微生物的活动改变了微环境功能而间接促使农药降解.常见的作用方式有3种.(1)矿化作用：其指微生物直接以有机磷农药作为生长基质，将其完全分解成无机物如CO 2和H 2O 等的过程.石利利等研究了假单胞菌DLL-1在水溶液介质中降解甲基对硫磷的性能、影响因素及其降解机理.结果表明，DLL-1菌能将甲基对硫磷完全转化为无机离子NO 2-、NO 3-，中间产物为对硝基苯酚.李晓慧从长期受毒死蜱污染的污水处理池中分离到一株毒死蜱高效降解菌株，该菌株能在24h 内完全降解100mg/L 的毒死蜱.(2)共代谢作用：其指微生物在有可利用碳源存在时，对原来不能利用的物质进行分解代谢的现象.艾涛等分离到一株以共代谢方式降解乐果的真菌菌株L3，该菌株在120h 内对乐果的降解率达29.2%.王永杰等从污泥中分离出一株以共代谢方式降解乐果的菌株G1，对乐果的降解率达60%以上.(3)种间协同代谢：指同一环境中的几种微生物联合代谢某种有机磷农药.在这种情况下，培养混合菌是一种可行的解决办法.对此，Douglas 曾做过尝试性研究[8].6有机磷农药降解菌的广谱性众多学者的研究表明，一种有机磷农药可以被多种微生物降解；同时，由于有机磷农药结构的相似性，一种微生物也可对多种有机磷农药进行降解，体现了微生物种类的多样性以及某些微生物功能的多样性.有机磷农药种类繁多，在环境中往往不是单独存在的，因此人们希望找到一种能广谱性降解有机磷农药的微生物菌群.江玉姬等[9]从农药厂附近的土壤中分离、筛选到一株能高效降解MP 、辛硫磷、三唑磷和敌敌畏的玫瑰单胞菌属细菌（Roseomonas ），其对MP 、辛硫磷、三唑磷和敌敌畏的降解率分别为96%、99%、98.9%、69.0%.Kazufumi 等[10]研究发现，节杆菌B-5可以降解异唑磷、二嗪农、对硫磷、苯硫磷、杀螟硫磷、异柳磷、毒死蜱、灭线磷等多种有机磷农药，降解速率因底物不同而异.其中，B-5降解异唑磷的能力最强，1h 内能完全降解浓度为10mg/L 的异唑磷.7结语在环境保护意识强烈的21世纪，有机磷农药的微生物降解具有广阔的应用前景和发展空间，但目前主要研究成果大多都是从土壤等受污染的环境介质中通过纯培养方式在实验室中完成的，很难再自然环境中长期有效的生存，这使得其推广和应用还有一定的局限性.同时有机磷化合物的组成也不太稳定，使降解菌的的代谢不太理想，并且有些化合物会抑制其生长.未来可以在以下方面进行研究：筛选高效的有机磷降解菌，并通过基因工程构建提高其降解效率，同时开发降解酶制剂，使有机磷农药的微生物降解技术得以商品化.加强并深入研究降解有机磷农药的微生物菌群及其降解酶的遗传特性，从基因水平上阐明降解酶基因的表达调控机理，构建出更高效的工程菌；对降解有机磷的微生物的降解原理以及其代谢途径，代谢产物的类型等进行深入研究.利用具有多种微生物类群的复合体系进行农药污染的微生物降解，复合系更接近自然界微生物存在的协同关系，更加符合自然规律.采取一些条件控制措施，充分调动在污染环境中天然诱导出的降解有机磷农药的土著微生物，并将其发展成为生长良好的优势菌种，尽量采用原位生物修复而避免人为接种微生物带来的负面影响.参考文献：[1]李建华，董锦艳，宋洪川．有机磷农药的微生物降解[J]．农业与技术，2006，26(3)：43-47．[2]李建政．环境毒理学[M]．北京：化学工业出版社，2010．140-141．[3]刘斌斌．鲁氏酵母菌WY-3降解甲胺磷的性能[J]．环境科学，2001，22(4)：40-41[4]石成春，郭养浩，刘用凯．环境微生物降解有机磷农药研究进展[J]．上海环境科学，2003，22(12)：863-867．[5]王圣惠，张琛，闫艳春.有机磷农药微生物降解研究进展[J]．生物技术，2006，16（3）：96-97[6]方晓航,仇荣亮.有机磷农药在土壤环境中的降解转化[J]．环境科学与技术，2003, (02):57-62.[7]Mageong Y C，Joseph F P．Sereospecific enzymetic hydrolysis of phos-phorus-sulfur bond in chiral0rganophosphate triesters[J]．Biorganic&Med．chem．Lett．1994，4(2)：1473-1478. [8]金潇，颜冬云，秦文秀.有机磷农药的微生物降解技术[J].湖南农业科学，2011，1（9）：93-97.[9]江玉姬，邓优锦，刘新锐，等.一株能高效降解几种有机磷农药的菌株JS018的鉴定[J].微生物学报，2006，46（3）：463-466.[10]Kazufumi O,Takasuke K,Takashi S,et al.Biodegradation of organophosphorus insecticides by bacteria isolated from turf green soil[J].Journal of Fermentation and Bioengineering,1996,82（3）:299-305.。