凝胶过滤色谱原理
凝胶渗透色谱
GPC分离是基于样品分子的溶剂化体积
GPC 在色谱柱中的分离是基于分子在溶剂表现
出的体积而不是分子量
GPC分离原理
(1) 固定相是多孔填料，小分子样品可以进入孔 径内部
(2) 样品与固定相之间无作用力
(3) 迁样品移时间不同
填充物颗粒
大
中
孔穴
小
GPC分离原理示意图
solution
solvent
浓度检测器
体积大的分子先 被淋洗出来
体积小的分子后 被淋洗出来
GPC是如何工作的
GPC曲线
GPC曲线
浓度响应
W(M)
代代表表了了相分对子分量子的质大量小的--M大；小—M 浓度响应代表了了含含量量—--WW（(MM）)
样品制备的影响
样品浓度与分子量相关（分子量越大，浓度越低） 除非该样品可能会有剪切效应发生，聚合物溶液必须
过滤 为了增加样品的溶解，可轻微扰动（不要剧烈摇动或
1 凝胶色谱的任务
分子量的分布与高分子材料 的所有关键加工特性以及材料 性能紧密相关
聚合物的分子结构
PD = Mw / Mn
分子量分布
增加分子量
聚合物的各种平均分子量
用GPC测得的不同种平均分子量可对应于其他仪器所 测的值：
– Mn：用渗析计测出(Osmometry) – Mw：用光散射计测出(Light Scattering) – Mv：用粘度计测出(Viscometry) – Mz及Mz+1：用超速离心法测出(Ultracentrifuge) – Mw/Mn：为多分散性(Polydispersity) – Mn<Mv<Mw<Mz<Mz+1
高效凝胶渗透色谱法
高效凝胶渗透色谱法
高效凝胶渗透色谱法（Gel Permeation Chromatography，GPC），又称凝胶过滤色谱，是一种分离大分子化合物的色谱技术。
该技术基于样品分子在凝胶纳米孔道中的渗透性差异，通过溶液中大分子与凝胶孔道的相互作用，实现溶液中分子的分离。
高效凝胶渗透色谱法主要包括以下步骤：
1. 样品制备：将待分离的大分子溶于适当的溶剂中，并使用过滤器或超滤器去除杂质。
2. 色谱柱选择：根据溶液中分子的分子量范围选择合适的高分子凝胶柱。
常用的凝胶材料包括聚合物和硅胶。
3. 柱温控制：根据样品性质，可选择恒温柱柱温控制，提高分离效果。
4. 流动相选择：根据样品的性质选择合适的流动相，常用的流动相包括有机溶剂和缓冲溶液。
5. 柱体填充：将凝胶填充到柱体中，保证凝胶均匀分布。
6. 样品进样：将样品溶液注入柱体，通过凝胶孔道渗透分离。
7. 分离分析：样品分子在凝胶孔道中的渗透速度不同，根据渗透速度的大小进行分离分析。
8. 检测器检测：通过检测器检测分离后的样品，常用的检测器包括紫外-可见光谱仪和光散射检测器。
高效凝胶渗透色谱法广泛应用于聚合物、蛋白质、天然高分子等大分子的分离和纯化。
与其他色谱技术相比，高效凝胶渗透色谱法具有分辨率高、选择性好、样品制备简单等优点，是一种重要的分离技术。
凝胶渗透色谱法测高聚物的分子量分布
凝胶渗透色谱法测高聚物的分子量分布聚合物的分子量及分子量分布是聚合物性能的重要参数之一，它对聚合物的物理机械性能影响很大。
在聚合物分子量的测定方法中凝胶渗透色谱法（gel permeation chromatography, GPC）由于其快速方便的特点受到了广泛的应用。
一、实验目的1．了解凝胶渗透色谱法测高聚物分子量分布的原理2．熟悉安捷伦型凝胶渗透色谱仪的简单工作原理和操作。
二、GPC简单原理凝胶渗透色谱（Gel Permeation chromarography 简称GPC）为一种液体色谱，是一种很有效的分离技术。
其分离过程在装填有多种固体的“凝胶”小球的谱柱中进行。
凝胶多为高交联度的聚苯乙烯或多孔硅胶。
这些凝胶孔径的大小要与所分离聚合物的分子尺寸相同。
用待测样品的良溶剂不断淋洗色谱柱，当把用相同溶剂制备的试样稀溶液注入柱前淋洗液中后，待高聚物从柱的尾竿流出时，即得分级。
关于GPC的分离机理，目前尚无一完备的理论，但就目前存在的理论可以分为三大类：平衡排除理论；限制扩散理论；流动分离理论。
其中最常用的，认为起主要作用的是平衡排除理论；流速较低时扩散在分离过程中是不重要的；至于液动分离机理则只在液速很高时才起作用。
按照此理论，GPC是基于大分子尺寸不同而进行分级的。
凝胶孔洞的大小有一定的分布，当溶解的聚合物分子液以多孔小球时，扩散到凝胶孔结构内去的程度依赖于分子的尺寸和凝胶孔径的大小和分布。
尺寸大的分子只能进入凝胶内层的一小部分，或完全被排除在外；而尺寸小的分子则能渗透到大部分的凝胶内层中去，因此分子的尺寸越大，在柱中走的路程越短，相反，分子的尺寸越小，在柱中的路程越长，保留时间也就越长。
这样，当高聚物流经色谱柱时，就按其分子量的大小分开，大分子首先流出，达到分级的目的。
分离过程如图1。
图1 GPC 的分离原理柱子的总体积可分为三部分：凝胶粒间体积V 0，凝胶骨架体积V GM ，凝胶总孔洞体积V i ；如果柱子的总体积为V t则： V t ＝V 0＋V i ＋V GM （1）如果某种尺寸的大分子可进入的孔洞体积为V i acc ，则其淋出体积V c 应为：我们定义分配系数为：i i d V acc V /K ⋅= （2） i d c V K V V +=0 （3）如果K d ＝1，则该分子可进入全部孔洞，此时V c ＝V 0＋V i ；如果K d ＝0则该分子完全被排斥在孔洞之外，此时V ＝V 0。
中药化学名词解释
中药化学名词解释吸附⾊谱：吸附⾊谱是利⽤吸附剂对被分离化⽽实现分离的⼀类⾊谱。
（常⽤吸附剂包括硅胶、氧化铝、活性炭、聚酰胺）凝胶过滤⾊谱：凝胶过滤⾊谱原理主要是分分离化合物分⼦⼤⼩⽽达到分离⽬的。
（常⽤葡聚糖凝胶、羟丙基葡聚糖凝胶）离⼦交换⾊谱：主要基于混合物中各成分解离⼦交换剂有离⼦交换树脂、离⼦交换纤维和离⼦交换凝胶三种。
⼤孔树脂⾊谱：⼤孔树脂是⼀类没有可解离不溶于⽔的固体⾼分⼦物质。
它可以通过物理吸附有选择地吸附有机物质⽽达到分离的⽬的（反相⾊谱）。
分配⾊谱：利⽤被分离物质在固定相和流动（正相⾊谱：固定相极性⼤于流动相）ORD：旋光光谱，⽤不同波长（200-760nm）并利⽤波长对⽐旋光度或者摩尔旋光度作图所得的曲线即旋光谱。
CD：圆⼆⾊谱，根据眩光化合物对组成平⾯数的测定来推断化合物的构型和构象、确定某些官能团在⼿性分⼦中的位置。
糖（saccharides）：是多羟基醛或者多羟基苷类(glycosides)：是糖或糖的衍⽣物与另的⼀类化合物，⼜称为配糖体。
苷中的⾮糖部分称为苷元或配基。
醌类化合物：是中药中⼀类具有醌式结构的苯丙素类（phenylpropanoids）：是指基本母机化合物类群，是⼀类⼴泛存在于中药中的天然产物，具有多⽅⾯的⽣理活性。
⾹⾖素（coumarins）：是⼀类具有苯骈α－在结构上可以看成是顺势邻羟基桂⽪酸脱⽔⽽形成的内酯类化合物。
⽊脂素（lignans）:⼀类由两分⼦苯丙素衍⽣物聚合⽽成的天然化合物，主要存在于植物的⽊部和树脂中，多数呈游离状态，少数与糖结合成苷。
黄酮类化合物（flavonoids）：主要是指基本母核为2-苯基⾊原酮的⼀系列化合物，（泛指两个苯环通过三个碳原⼦相互联结⽽成的⼀系列化合物）在植物体内由莽草酸和⼄酸-丙⼆酸复合途径转化⽽成。
诊断试剂：其主⽤作⽤是使样品⽣成其酚盐。
其结果引起样品在ＵＶ中的吸收波长发⽣位移，根据位移变化的⼤⼩来判断其结构特点从⽽提供重要的信息。
凝胶渗透色谱法
凝胶渗透色谱法（GPC）一、凝胶渗透色谱凝胶渗透色谱Gel Permeation Chromatography（GPC)，一种新型的液体色谱，原理是利用高分子溶液通过一个装填凝胶的柱子，在柱子中按分子大小进行分离。
柱子为玻璃柱或金属柱，内填装有交联度很高的球形凝胶。
其中的凝胶类型有很多，都是根据具体的要求而确定（常用的有聚苯乙烯凝胶）。
然而，无论哪一种填料，他们都有一个共同点，就是球形凝胶本身都有很多按一定分布的大小不同的孔洞（见图1）。
图1 GPC分离原理不仅可用于小分子物质的分离与鉴定，而且可作为用来分析化学性质相同但分子体积不同的高分子同系物。
可以快速、自动测定高聚物的平均分子量及分子量分布。
现阶段，已经成为最为重要的测定聚合物的分子量与分子量分布的方法。
二、测定原理凝胶色谱法的固定相采用凝胶状多孔性填充剂，是根据样品中各种分子流体力学提及的不同进行分离的。
比凝胶孔径大的分子完全不能进入孔内，随流动相沿凝胶颗粒间流出柱外，而娇小的分子则可或多或少地进入孔内。
因此大分子流程短，保留值小；小分子流程长，保留值大，所以凝胶色谱是按分子流体力学体积的大小，从大到小顺序进行分离的。
（见图2）图2 GPC淋出曲线溶质分子的体积越小，其淋出体积越大，这种解释不考虑溶质与载体间的吸附效应以及溶质在流动相和固定相中的分配效应，其淋出体积仅仅由溶质分子的尺寸和载体的孔径尺寸决定，分离完全是由于体积排除效应所致。
凝胶色谱的特点是样品的保留体积不会超出色谱柱中溶剂的总量，因为保留值的范围是可以推测的，这样可以每隔一定时间连续进样而不会造成谱峰的重叠，提高了仪器的使用率。
三、分子量校正曲线（LogM-V曲线）凝胶色谱图计算样品的分子量分布的关键是把凝胶色谱曲线中的淋洗体积V转化成分子量M，这种分子量的对数值与淋洗体积之间的曲线(LogM-V)称之为分子量校正曲线（见图3）。
图3 分子量校正(LogM-V)曲线➢排阻极限排阻极限是指不能进入凝胶颗粒空穴内部的最小分子的分子量。
凝胶过滤层析简介
凝胶
层析柱
加样洗脱
再生保存
柱的选择 柱的装填
同样直径的层析柱 同样长度的层析柱 同样体积的层析柱 理想的层析柱
长层析柱比短的分辨率高； 直径大的比小的分辨率高； 层析柱长的比短的分辨率高。 直径与长度之比是1：25-1：100
常用的支持物有棉花、玻璃纤维、玻璃珠、垂熔玻璃等。 空柱中应留约1/5的水或溶剂。 不断搅拌下使胶粒均匀沉降，使不发生凝胶分层和胶面倾斜。
测定分子量
当Kd=1时，洗脱体积Ve=V0+Vi，为全渗入。 当Kd=0时，洗脱体积Ve=V0，为全排阻。
0＜Kd＜1时，洗脱体积Ve=Vo+KdVi，为部分渗入。
|分类与性质
凝胶
分类性质
凝 胶 含大量液体的具三维网状开孔弹性结构的多聚体结构，
一般制成球状颗粒。
性
能 多孔、亲水、惰性、稳定、色谱性能好
凝胶过滤层析技术
凝胶过滤层析技术 content
凝胶过滤的基本原理
凝胶分类与性质 凝胶过滤的基本操作
凝胶过滤层析的应用
|基本原理
原理
分子
洗脱体积
分配系数
凝胶过滤法又称为分子筛层析、凝胶 层析或排阻层析,是利用凝胶 的网状结构根据分子大小进 行分离的一种方法。凝胶过
Services 滤所用的介质是由交联葡萄
| 基本操作
凝胶
层析柱
加样洗脱
再生保存
凝胶再生 凝胶保存
仅使用过一次的凝胶柱，通常进行更新平衡后 即可再次使用； 湿法：洗净的凝胶悬浮于蒸馏水和缓冲液中，应加入 适量的防腐剂如氯仿、0.05％NaN3或20％乙醇等，不 先用水反复进行逆向冲洗，再用缓冲液进行 然微生物将生长。 平衡，平衡毕，即可重复使用 干法：用浓度逐步升高的乙醇洗净凝胶，使其脱水收 把凝胶倒出，用低浓度的酸或碱按其预处理 缩，再抽干乙醇，用60-80℃的暖风吹干，在室温下 方法进行，处理后重新装柱即可再行使用 保存。 半缩法：是过度法，用60%-70%的乙醇使凝胶部分脱 水，然后封口，4 ℃保存。
凝胶渗透色谱GPC课件
19
GPC色谱柱选择
按照样品所溶解的溶剂来选择柱子所属系 列
THF、氯仿、 DMF 必须选择合适的溶剂来溶解聚合物
按照样品分子量范围来选择柱子型号
样品分子量应该处在排阻极限和渗透极限范围 内，并且最好是处在校正曲线线性范围内
2
标样
聚苯乙烯(PS，溶于各种有机溶剂) 聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)
将公式(2)代入公式(3)和(4)，则：
(5)
(6)
标样的Mw和Mn已知，将Hi,Vi代入，软件自动算出A,B值。
3
GPC分析大致步骤
根据样品的特点选择合适的GPC柱子和标 样，并且确定采用的GPC校正方法
配制标样和样品，用LCsolution进样得到色 谱图
用LCsolution GPC生成校正曲线并计算样 品平均分子量，制作报告
渐进试差法(宽分布标样校正法)
这种方法不需要窄分布样品，其标样可为1~3 个不同相对分子质量的宽分布标样(平均相对
2
分子质量精确测量， Mw和Mn为已知)，采用
窄分布标样校正法
要有5个以上的不同分子量的单分散标样来 制作校正曲线
样品最好与标样是相同的结构。
如果样品与标样结构完全一样，则结果不需再 修正
3
渐进试差法(宽分布标样校正法)
不需要窄分布标样，只需要宽分布标样 标样和样品为同一种物质
标样数量最少可以只有1个 标样的分子量Mw和Mn必须已知 标样校正曲线呈线性
3
渐进试差法(宽分布标样校正法)
在一定条件下，有： (1)
将标样色谱峰分成若干个切片，则： (2)
根据定义，有：
(3)
(4)
用重量分数W对分子量作图的曲线叫做微分分 布曲线；
第5章 凝胶渗透色谱
•
死Hale Waihona Puke 间•调整保留时间 与固定液用量有
关
• 比保留体积 相对保留值 保留指数
• 色谱过程方程: VR=VM+VR’
•
VR=VM+KVS
•
色谱的保留值与热力学系数联系起来
• 色谱流出曲线方程：——研究色谱峰形
•
塔板理论：高斯分布曲线
•
c 标准偏差：
nc0
2 tR
exp
1 2
n 1
t tR
2
3.2分离机理简介
• 在现在，虽然GPC已经得到了广泛的应用， 但是就连基本的分理机理都处在百花争鸣 的阶段。目前模型机理可分为4大类：
3.2.1平衡排除理论
• 依据色谱方程，认为分离处于平衡时，即溶质在 胶体孔洞内的停滞时间大于它扩散入与扩散出孔 洞所需的时间，分离的过程就既不受扩散控制也 不受扩散影响。
tR / n
c
c0
2
exp
t tR
2 2
2
• 描述色谱峰大小的参数：
•
峰高h h c0
2
• 峰宽Ｗ W 4
• 分离度：描述峰分离情况
R
2
tR2 W1
tR1 W2
•
分离因素：保留值 峰窄
•
• 色谱定性分析－－依据保留值
• 与已知组分的保留值相比
• 与其它分析方法连用 如ＩＲ
• 第5章 凝胶渗透色谱法
•
• 色谱原理 • 流动相:载气 • 固定相:固体吸附剂等
•
图 气相色谱对样品分离过程示意图
• 色谱谱图解析
• 一 谱图表示方法: 横坐标 时间
•
纵坐标 检测器响应信号的大小 色谱图
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凝胶过滤色谱原理
凝胶过滤色谱是一种常用的生物分离技术，它基于分子在凝胶基质中的大小和
形状差异而进行分离。
在凝胶过滤色谱中，样品中的大分子会被排除在凝胶颗粒外部，而小分子则能够渗透进入凝胶颗粒内部，从而实现分离。
本文将介绍凝胶过滤色谱的原理及其应用。
凝胶过滤色谱的原理主要包括两个方面，凝胶基质和分子分离。
首先，凝胶基
质是凝胶过滤色谱的关键组成部分。
凝胶基质通常由聚合物构成，其孔隙大小可以根据实验需要进行调控。
大分子无法进入较小的孔隙，因此会被排除在凝胶颗粒外部；而小分子则可以进入较小的孔隙，从而被分离。
其次，分子分离是凝胶过滤色谱的核心原理。
在样品通过凝胶基质时，大分子会受到阻滞而流经凝胶基质的速度较慢，而小分子则能够快速通过凝胶基质。
通过这种方式，不同大小和形状的分子可以被有效地分离。
凝胶过滤色谱在生物分离和分析中有着广泛的应用。
首先，凝胶过滤色谱可以
用于分离蛋白质。
蛋白质通常具有不同的大小和形状，因此可以通过凝胶过滤色谱进行分离。
其次，凝胶过滤色谱也可以用于寡核苷酸和多核苷酸的分离。
由于寡核苷酸和多核苷酸的大小差异较大，因此可以通过凝胶过滤色谱进行有效的分离。
此外，凝胶过滤色谱还可以用于分离细胞器和病毒等生物颗粒。
通过调控凝胶基质的孔隙大小，可以实现对不同大小的生物颗粒进行分离。
总之，凝胶过滤色谱是一种重要的生物分离技术，其原理简单而有效。
通过调
控凝胶基质的孔隙大小，可以实现对不同大小和形状的分子进行有效的分离。
在生物领域中，凝胶过滤色谱有着广泛的应用，可以用于蛋白质、寡核苷酸、多核苷酸、细胞器和病毒等生物颗粒的分离。
因此，凝胶过滤色谱在生物分离和分析中具有重要的地位，对于生物科学研究具有重要的意义。