外源基因在酵母菌中的表达
酵母表达外源蛋白(foreign protein)(1)
酵母表达外源蛋白（foreign protein）（1）1、菌株用GS115表达不出蛋白，换KM71H后，大部分克隆能表达。
2、温度：在28度和室温下诱导表达，表达水平可能都不低。
3、pH手册上用6.0，pH提高到6.8，不表达的蛋白可能就表达出来。
BMMY的pH7.0-7.5比较合适。
国内外做的最好的rHSA，最适pH大概 5-6左右。
pH3的时候yeast和peptone好像会沉淀的，可以用磷酸和磷酸二氢钾调，具体比例自己去试试。
4、偏爱密码子codon bias一般不是主要的问题，你要表达的蛋白特性才是主要问题，酵母对分子量大（30KD以上），结构复杂（如一些蛋白酶），二硫键含量多的蛋白往往不能有效表达，尤其是分泌表达。
密码子改造对一些较小的而且结构简单的蛋白表达量的提高可能有一些作用。
比如一位战友用Pichia酵母表达一个单链抗体，29KD，含有2对二硫键，表达量约几毫克每升，选用酵母偏好密码子全基因合成后，表达量没有什么提高。
5、表达时间与空质粒转化对照诱导时间长了以后，是会有很多蛋白分泌出来的，时间越长杂蛋白就越多，且分子量都比较大。
最好做一个空质粒转化的对照，这样就会比较肯定到底是不是自身的蛋白分泌的结果。
6、污染每个样品从G418板上挑10个左右单克隆于2ml BMGY摇菌（30ml玻璃管，比LB管大一点），纱布一般用8层，一天左右看着比较浑离心，留样1m l，余1ml换2ml BMMY诱导表达，3,4层纱布足够了。
污染一般都是跟瓶口覆盖有关的原因造成的，只盖纱布肯定会污染。
加盖报纸后，就再没遇到过污染。
如果只用6层纱布，污染的可能当然很大，100ml 三角瓶，装量10ml培养液，用橡筋把8层纱布和2层报纸拴紧封口，空气浴摇床。
7、不表达蛋白有没有表达就要看你的运气了，一般重复2－3次实验都没有表达菌株，这个蛋白就放弃表达了。
8、表达量30KD,10mg/L表达量已经很高，最直接的方法是发酵，一般提高5－10倍。
酵母表达(1)
酵母表达引言酵母是一类单细胞真核生物，被广泛应用于生物学研究中。
酵母表达系统是指利用酵母细胞表达外源基因的技术，被广泛应用于蛋白质的高效表达和产量大规模生产。
本文将介绍酵母表达系统的原理、优势和应用。
原理酵母表达系统的核心原理是将外源基因导入酵母细胞，并通过酵母细胞的转录、翻译和修饰机制，使外源基因在酵母细胞中得到表达和功能发挥。
通常情况下，酵母表达系统主要采用酵母菌属的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)或毕赤酵母(Pichia pastoris)作为宿主细胞。
1.酵母转录机制：酵母细胞的基因表达主要通过RNA聚合酶Ⅱ进行转录，产生mRNA分子。
2.酵母翻译机制：酵母细胞通过核糖体进行翻译，将mRNA翻译成蛋白质。
3.酵母修饰机制：酵母细胞具有多种修饰酶，可以对蛋白质进行翻译后修饰，如糖基化、磷酸化等。
优势相比其他常用的表达系统，酵母表达系统具有一系列的优势：1.高效表达能力：酵母表达系统能够实现高水平的外源基因表达，产量可达到克级。
2.翻译后修饰：酵母细胞具有多种修饰酶，可以对蛋白质进行翻译后修饰，使蛋白质得到正确的糖基化等修饰。
3.生长条件简单：酵母菌生长条件相对简单，可以在常规培养基中进行培养，对培养条件的要求相对较低。
4.可溶性蛋白质表达：酵母细胞具有较强的蛋白质折叠和修饰能力，能够高效地表达可溶性蛋白质。
应用酵母表达系统广泛应用于以下领域：1.蛋白质研究：酵母表达系统可用于大规模蛋白质表达和纯化，为蛋白质的结构、功能和相互作用研究提供了高效的工具。
2.药物筛选：酵母表达系统可用于药物靶点鉴定和药物分子筛选，加速药物研发过程。
3.疫苗研究：酵母表达系统可用于疫苗候选抗原的高效表达和产量大规模生产。
4.代谢工程：酵母表达系统可用于代谢工程领域，利用酵母细胞对外源代谢产物的高效合成能力，实现产生复杂化合物的目标。
5.生物制药：酵母表达系统已经被广泛应用于生物制药领域，用于生产重组蛋白和抗体等生物药物。
基因工程：第四章-酵母基因工程
UBC4-UBC5双突变型：
UBC4-UBC5双突变型能大幅度削弱泛
素介导的蛋白降解。
7个泛素连接酶基因的突变对衰减蛋白 降解作用同样有效。
6、内源性蛋白酶缺陷型的突变宿主菌
酿酒酵母具有20多种蛋白酶 空泡蛋白酶基因PEP4野生型和
pep4-3突变株
B-半乳糖苷酶活性明显升高
（三） 酵母菌的载体系统
酵母基因工程
酵母菌作为外源基因表达受体菌的特征 酵母菌的宿主系统 酵母菌的载体系统 酵母菌的转化系统 酵母菌的表达系统 利用重组酵母生产乙肝疫苗
1974 Clarck-Walker和Miklos发现在多数酿酒酵母 中存在质粒。
1978 Hinnen将来自一株酿酒酵母的leu2基因导入 另一株酿酒酵母，弥补了后者leu2的缺陷， 标志着酵母表达系统建立。
酵母菌有4个泛素编码基因：
UBI1 编码泛素-羧基延伸蛋白52 对数生长期表达 稳定期关闭
UBI2 编码泛素-羧基延伸蛋白52 对数生长期表达 稳定期关闭
UBI3 编码泛素-羧基延伸蛋白76 对数生长期表达 稳定期关闭
UBI4 编码泛素五聚体
对数生长期关闭 稳定期表达
酵母菌有7个泛素连接酶基因：
UBC1、UBC2、UBC3、UBC4、UBC5、UBC6、UBC7
酵母菌表达外源基因的优势： 全基因组测序，基因表达调控机理清楚，遗传 操作简便。 具有真核生物蛋白翻译后加工修饰系统。 能将外源基因表达产物分泌至培养基中。 大规模发酵工艺简单、成本低廉。
不含特异性病毒、不产毒素，被美国FDA认定为 安全的基因工程受体系统。
酵母菌表达外源基因的缺点：
表达产物的糖基化位点和结构特点 与高等真核生物有差距。
特点：
甲醇酵母系统表达的影响因素
酵母菌对外源基因的表达也和外源基因密码子的选用有关。
了解表达系统宿主在密码子使用上的偏爱性对从翻译水平分析基因表达的规律有重要意义，也可为改造外源基因或改造宿主细胞提供依据。
如果外源基因密码子中存在过多的宿主低利用密码子，位于起始密码子附近的低利用密码子对基因的表达就会产生很大影响。
解决这一问题的方法有2种：一是通过点突变的方法用同义高利用率密码子替代低利用密码子而不改变氨基酸序列；另一方法是截取基因中影响其生物活性的部分。
目前，这些方法在甲醇酵母表达系统中都能提高表达水平。
外源蛋白的空间构象、糖基化位点、水溶特性、氨基酸组成以及其他的理化特点都会影响毕赤酵母对其分泌，所以应根据外源蛋白自身的理化特点来选择胞内表达或分泌型表达方式。
外源基因在酵母基因组中的整合数也可以影响外源基因的表达水平，应该选用高拷贝整合来提高外源基因的表达水平。
2、表达框的染色体整合位点和方式虽然相对于自主复制载体来讲，整合性载体的转化率较低，但由于Pp没有天然质粒，所以设计表达载体偏向于染色体整合，通过同源重组，载体整合到细胞染色体中间。
整合性载体具有表达框稳定和可控制整合位点等优越性，并且能够发生多位点整合而获得多拷贝。
AOX1和组氨酸脱氢酶(histidinol dehydrogenase，HIS4)基因位点都已被成功用于表达外源蛋白。
Sreekrishna等注意到his基因座的lacZ表达框偶有缺失。
这种缺失源于表达框中his4染色体突变拷贝与完好的his4基因的基因转换。
因此，看起来aox1位点是较为理想的位点。
3、宿主的甲基营养表型：Mut+或Muts用末端与aox1基因5'和3'端同源的线性DNA转化Pp HIS4菌株可导致Mx1结构基因的特异性剔除。
aox1基因缺失的酵母在甲醇限制性培养基上生长缓慢(methanol utilization slow , MutＳ或Mut-)，它们只能利用弱的aox2基因启动合成aox2基因启动合成AOX；而aox1基因完整的酵母则生长正常(Mut＋)。
外源基因在酵母菌中表达讲义课件
• UBI 4 编码泛素五聚体对数生长期关闭稳定期表达
酵母菌共有七个泛素连接酶基因：
• UBC 1、UBC 2、UBC 3、UBC 4、UBC 5、UBC 6、UBC 7
•外源基因在酵母菌中表达讲义
•8
减少泛素依赖型蛋白降解作用的突变宿主菌
泛素降解途径衰减的酿酒酵母
• UBI 4缺陷型： 在酿酒酵母菌中，泛素主要由UBI 4基因表达，UBI 4-突变
•外源基因在酵母菌中表达讲义
•12
酵母菌克隆表达质粒的构建
含有ARS的YRpp质粒的构建 • ARS为酵母菌中的自主复制序列，0.8-1.5kb，染色体
上每30-40kb就有一个ARS元件。酵母菌自主复制型
质粒的构建组成包括复制子、标记基因、提供克隆 位点的大肠杆菌质粒DNA。
以ARS为复制子的质粒称为YRp
•外源基因在酵母菌中表达讲义
•27
酵母菌表达系统的选择
酿酒酵母表达系统 • 酿酒酵母的基因表达系统最为成熟，包括转录活性
较高的甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因GAPDH、磷酸甘油 激酶基因PKG、乙醇脱氢酶基因ADH所属的启动子，
多种重组外源蛋白获得成功表达。 • 酿酒酵母表达系统的最大问题在于其超糖基化能力，
基因工程受体系统（Generally Recognized As Safe GRAS） • 酵母菌是最简单的真核模式生物
•外源基因在酵母菌中表达讲义
•2
酵母菌的宿主系统
提高重组蛋白表达产率的突变宿主菌 抑制超糖基化作用的突变宿主菌 减少泛素依赖型蛋白降解作用的突变宿主菌 广泛用于外源基因表达的酵母宿主菌
列HARS已被克隆，并用于构建克隆表达载体，但与
巴斯德毕赤酵母相似，这种载体在受体细胞有丝分
基因在大肠杆菌、酵母中的高效的表达
c. 启动子与克隆基因间的距离对基因表达的影响
研究表明启动子和目的基因间的距离对基因的 表达效率影响很大，所以在构建新的表达载体时要考 虑到这一因素的影响。另外，在克隆基因的末端要就 近插入有效的终止子序列，否则会导致细胞能量的大 量消耗，或是形成不应有的二级结构，最终影响的目 的基因的表达效率。
影响目的基因在甲醇酵母中表达的因素
1.目的基因的特性 2.表达框的染色体整合位点与基因拷贝数 3.宿主的甲醇利用表型 4.分泌信号 5.产物稳定性 6.翻译后修饰
பைடு நூலகம்
b. 翻译起始序列对表达效率的影响
mRNA的有效翻译依赖于核糖体和其的稳定结 合，大肠杆菌的mRNA序列中，核糖体的结合位点是 起始密码子AUG和其上游的SD序列。所谓SD序列就 是由Shine-Dalgarno首先提出的一种位于位于起始密 码子上游的一段保守序列，为细菌核糖体有效结合和 翻译起始所必需。一般SD序列的长度约为3-9bp，位 于起始密码子上游3-11碱基的位置，它与16S核糖体 RNA的3‘端互补，控制了翻译的起始。 ５’--AGGAGGUXXXAUG--- mRNA ３’AUUCCUCCACUAG----- 16S rRNA3’ 末端
构建表达载体的策略
⑴将真核基因克隆到一个强大的原核启动子和SD序列
的下游，使得真核基因处于原核调控体系中。 ⑵采用真核基因的cDNA序列作为构建表达载体的目的 基因，这样就解决了原核细胞没有RNA剪接功能的 问题。
⑶构建载体时，将真核基因插在几个原核密码子的后 面，翻译后就得到了原核多肽和真核多肽的融合 蛋白，这样就可以避免被原核蛋白酶的识别和降 解，最后可以将融合多肽切除。
3. mRNA合成后穿过核膜进入细胞质中后才进行翻译 工作，而且通常都有复杂的成熟和剪接过程； 4. 基因的启动子区和原核基因差异很大，而且有增强 子序列存在。
重组法酵母转基因的操作流程
重组法酵母转基因的操作流程1.酵母基因组DNA的提取酵母基因组DNA提取的目的是获取酵母菌体内的DNA用于后续的操作。
一般采用裂解酵母菌体的方法提取DNA，具体步骤如下：-通过酵母预培养，得到酵母菌悬浮液。
-沉淀酵母菌悬浮液，去除培养基。
-使用细胞裂解缓冲液裂解酵母细胞，释放DNA。
-使用丙酮沉淀DNA，去除其他杂质。
-通过洗涤、溶解等步骤得到纯化的酵母基因组DNA。
2.外源DNA的构建外源DNA的构建是将目标基因或其他DNA片段经过特定的操作，构建成可用于转基因的载体DNA。
-针对目标基因，进行PCR扩增或使用其他适当的方法获得目标DNA片段。
-将目标DNA片段与载体DNA进行连接，一般采用限制酶切和DNA连接酶的方法。
-外源DNA还可以构建其他特殊序列，如启动子、标记基因等，以实现特定的目标。
3.酵母菌体的转化转化是将外源DNA导入酵母中，使酵母细胞能够表达外源基因。
酵母菌体转化一般有两种方法：化学法和电转化法。
-化学法转化：-制备酵母靶菌株，包括选择合适的酵母菌株及对应培养基成分的调整。
-制备产生低盐胆固醇溶液和转化缓冲盐溶液。
-稀释酵母导入质粉末，并加入充足的低盐胆固醇溶液。
-在冰上孵育一段时间，将混合液通过热激冷冻的方法转移到电泳气泡中。
-通过勺子串入导入液，冻结导入液后，电泳电环泵注入电泳。
-电泳过程中伴有导入液的减量。
结束电泳时，针尾切割成小片。
-电转化法转化：-将酵母细胞培养至对应的生长期。
-调整酵母细胞浓度。
-准备转化缓冲盐溶液和性相为空凝气泡的溶液。
-将酵母细胞和目标DNA溶液混合。
-通过不同电压的电击法将酵母细胞进行电转化。
-回收转化后的酵母菌体并进行培养。
4.筛选转基因酵母为了筛选出成功转基因的酵母细胞，一般采用标记基因的方法。
-构建一个可表达特定筛选标记基因的转基因酵母菌株。
-将转化后的酵母菌种悬浮液培养在含有选择性的培养基中，使只有转基因酵母能够存活下来。
-通过对菌落进行PCR扩增或其他方法，确认是否成功获得目标基因的酵母菌株。
酵母文库筛选原理
酵母文库筛选原理
酵母文库是一种用于筛选和保存酵母菌株的资源库，它在酵母研究中起着重要的作用。
酵母菌是一种单细胞真菌，常用于生物学和生物工程学中的研究。
酵母文库的原理是通过将酵母菌的基因组片段插入到载体中，然后将载体转化到酵母细胞中，形成一个酵母细胞库。
通过对这个酵母细胞库进行筛选，可以筛选出具有特定性状或功能的酵母菌株。
酵母文库的筛选过程通常分为两个步骤，即初步筛选和深度筛选。
初步筛选是通过对酵母文库进行大规模的筛选，以找到具有所需特性的酵母菌株。
这一步骤通常使用高通量的筛选方法，例如基因芯片或高通量测序技术。
深度筛选是对初步筛选得到的菌株进行进一步的筛选和验证，以确保其具有所需特性的稳定性和可重复性。
酵母文库筛选的原理主要基于酵母菌细胞内的基因组重组和表达机制。
通过将外源基因片段插入酵母基因组中的适当位置，可以实现外源基因的表达。
通过对酵母文库进行筛选，可以找到具有所需特性的酵母菌株，并进一步研究其相关基因的功能和调控机制。
酵母文库筛选的原理虽然简单，但其应用广泛。
在生物医学研究中，酵母文库筛选可用于发现新的药物靶点和治疗方法。
在生物工程学中，酵母文库筛选可用于改良酵母菌的产酶性能，提高其产酶效率。
此外，酵母文库筛选还可用于研究基因的功能和调控机制，进一步揭示生物体内的生物学过程。
总的来说，酵母文库筛选是一种重要的酵母研究工具，通过对酵母菌株进行筛选和保存，可以获得具有特定性状或功能的酵母菌株，为生物学和生物工程学研究提供有力的支持。
酵母文库筛选的原理简单易行，但其应用潜力巨大，将在未来的研究中发挥更加重要的作用。
酵母菌表面展示基因的构建和转化
酵母菌表面展示基因的构建和转化酵母菌表面展示基因是一种常用的蛋白表达技术，通过将外源基因插入酵母菌表面展示基因载体中，使其能够在酵母菌细胞表面表达并展示出来。
这一技术可以应用于酵母菌的蛋白质工程和药物筛选等领域。
本文将介绍酵母菌表面展示基因的构建和转化流程。
一、酵母菌表面展示基因的构建1. 选择适合的酵母菌表面展示基因载体。
常用的载体有pCTCON2、pCTPAS2等，这些载体含有表面展示基因所需的信号序列和适当的启动子。
2. 选择合适的启动子和信号序列。
启动子决定了表达基因的强弱，信号序列决定了基因能否正确的表达在酵母菌细胞表面。
3. 将目标基因插入载体中。
可以使用PCR方法扩增目标基因或通过合成基因片段插入载体中。
注意选择合适的引物设计和错配扩增条件。
4. 确认基因插入正确。
可用酶切鉴定、测序和限制性片段长度多态性（RFLP）分析等方法进行确认。
二、酵母菌表面展示基因的转化1. 构建表达酵母菌表面展示基因的受体菌株。
选择合适的酵母菌株，如Saccharomyces cerevisiae。
构建基因敲除/插入的方法可以用来降低背景信号和增加基因表达效率。
2. 转化酵母菌。
可采用化学转化、电击转化或基因枪等方法。
注意转化体系的优化，如转化时间、转化剂的浓度和pH值等因素。
3. 选择性培养和筛选。
转化后的酵母菌需在含所需选择因子的培养基上进行培养，并去除未转化的酵母菌。
可利用选择性培养基或对抗物质的添加进行筛选。
4. 筛选高表达菌株。
通过检测表面展示蛋白的活性、测定蛋白产量或使用特异性抗体等方法进行筛选。
三、酵母菌表面展示基因的应用1. 酵母细胞表面展示蛋白质工程。
通过酵母菌表面展示基因技术可以进行蛋白质工程研究，可以展示和表达各种蛋白质、抗体、酶、蛋白质片段等物质，以便进行蛋白质相互作用研究、蛋白质功能分析等。
2. 药物筛选。
通过酵母细胞表面展示基因的技术，可以用来筛选化合物对目标蛋白的结合能力、激活能力或抑制能力。
毕赤酵母表达载体及宿主菌介绍
由于甲醇营养型酵母菌体内无天然质粒，所以携带外源基因的重组体必须整合于染色体中才能实现外源基因的表达。
整合表达的优点在于保持外源基因稳定性并可产生多拷贝基因。
典型的毕赤氏酵母表达载体含有醇氧化酶基因的调控序列，主要的结构包括：5’AOX1启动子片段、多克隆位点(MCS)、转录终止和polyA形成基因序列(TT)、筛选标记(His4或Zeocin)、3’AOX1基因片段，作为一个能在大肠杆菌中繁殖扩增的穿梭质粒，它还有部分pBR322质粒或COLE1序列。
如果是分泌型表达载体，在多克隆位点的前面，外源基因的5’端和启动子的3’端之间插人了分泌作用的信号肽序列。
在这个分泌信号的引导下，外源蛋白在内质网和高尔基体中经修饰和加工后能够由胞内转移至胞外，将成熟的蛋白质分泌到细胞外。
为方便于操作，通常表达载体都是穿梭质粒。
表达载体与酵母染色体有单交换和双交换整合2种方式，单交换整合时，或插入A0X1位点，或插入his位点。
有文献报道，以his4作为整合位点时，染色体突变株与表达盒间存在基因转换，偶而可使Laz表达盒丢失，故AOX1位点更好。
一般认为，单交换转化效率比双交换效率高，且易得到多拷贝整合，其发生机制可能是重复单交换引起的。
携带外源基因的表达载体可通过电穿孔、原生质体生成法或全细胞法转化酵母细胞。
甲醇酵母转化和大肠埃希氏菌转化不同之处是前者较为复杂。
对于大肠埃希氏菌而言，只要把重组表达载体导入细胞体内即可。
因其载体上携带有自身复制原点，可随染色体复制而复制，重组表达载体能够稳定存在。
在甲醇酵母系统中，所有的表达载体均不含酵母复制原点。
这就是说，导入酵母体内的重组表达载体只有和酵母染色体上的同源区发生重组，整合到染色体上，外源基因才能够稳定存在，外源蛋白才能得到稳定表达，这种整合的转化子一旦形成就非常稳定。
如果转化后的重组表达载体未能整合到染色体上，而是以游离的附加体形式存在，这种转化子就不稳定，重组表达载体极易丢失。
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提高重组蛋白表达产率的突变宿主菌
能导致酿酒酵母中重组蛋白产量提高或质量改善的突变类型
抑制超糖基化作用的突变宿主菌
许多真核生物的蛋白质在其天门冬酰胺侧 链上接有寡糖基团，它们常常影响蛋白质 的生物活性。整个糖单位由糖基核心和外 侧糖链两部分组成。
酵母菌普遍拥有蛋白质的 糖基化系统，但野生型酿 酒酵母对异源蛋白的糖基 化反应很难控制，呈超糖 基化倾向，因此超糖基化 缺陷株非常重要。
酵母菌克隆表达质粒的构建
含有CEN的YCp质粒的构建 • CEN为酵母菌染色体DNA上与染色体均匀 分配有关的序列 • 将CEN DNA插入含ARS的质粒中，获得的 新载体称为YCp • YCp质粒具有较高的有丝分裂稳定性，但拷 贝数只有1 - 5个 • 含有TELL的YAC质粒的构建
酵母菌克隆表达质粒的构建
减少泛素依赖型蛋白降解作用的突变宿主菌
泛素介导的蛋白质降解作用
减少泛素依赖型蛋白降解作用的突变宿主菌
酵母菌泛素依赖型蛋白降解系统的编码基因 酵母菌共有四个泛素编码基因 • UBI 1 编码泛素-羧基延伸蛋白52（CEP52） 对数生长期 表达稳定期关闭 • UBI 2 编码泛素-羧基延伸蛋白52（CEP52） 对数生长期 表达稳定期关闭 • UBI 3 编码泛素-羧基延伸蛋白76（CEP76） 对数生长期 表达稳定期关闭 • UBI 4 编码泛素五聚体对数生长期关闭稳定期表达 酵母菌共有七个泛素连接酶基因： • UBC 1、UBC 2、UBC 3、UBC 4、UBC 5、UBC 6、 UBC 7
乙型肝炎病毒的结构与性质
乙型肝炎病毒的包装蛋白编码基因
乙型肝炎病毒的结构与性质
传统乙肝疫苗的制备 • 乙肝病毒在体外细胞培养基中并不能繁殖， 因此第一代的乙肝疫苗是从病毒携带者的 肝细胞质膜上提取出来的。虽然这种质膜 来源的疫苗具有较高的免疫原性，但由于 原材料的限制难以大规模产业化。
酵母菌的转化程序
酵母菌原生质体转化法 • 早期酵母菌的转化都采用在等渗缓冲液中稳定的 原生质体转化法，在Ca2+和PEG的存在下，转化 细胞可达原生质体总数的1-2%。 • 但该程序操作周期长，而且转化效率受到原生质 再生率的严重制约 • 原生质体转化法的一个显著特点是，一个受体细 胞可同时接纳多个质粒分子，而且这种共转化的 原生质体占转化子总数的25-33%
显性标记基因
酵母菌的表达系统
• 外源基因在酵母菌中表达的限制因素 • 酵母菌启动子的可控性 • 酵母菌表达系统的选择
酵母菌启动子的可控性
超诱导型启动子 酿酒酵母的半乳 糖利用酶系由 GAL1 GAL7和GAL10 基因编码
外源基因在酵母菌中表达的限制因素
• 外源基因稳态mRNA的浓度 • 外源基因mRNA的翻译活性 • 酵母菌对密码子的偏爱性 在酿酒酵母中，高丰度的蛋白质（如甘油 醛-3-磷酸脱氢酶GAPDH、磷酸甘油激酶 PKG、乙醇脱氢酶ADH）中96%以上的 氨基酸是由25个密码子编码的
酵母菌表达系统的选择
酿酒酵母表达系统 • 酿酒酵母的基因表达系统最为成熟，包括转录活 性较高的甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因GAPDH、磷 酸甘油激酶基因PKG、乙醇脱氢酶基因ADH所属 的启动子，多种重组外源蛋白获得成功表达。 • 酿酒酵母表达系统的最大问题在于其超糖基化能 力，往往使得有些重组蛋白（如人血清白蛋白等） 与受体细胞紧密结合，而不能大量分泌。这一缺 陷可用非酿酒酵母型的表达系统来弥补
利用重组酵母生产乙肝疫苗
• 乙型肝炎病毒的结构与性质 • 产乙肝表面抗原的重组酿酒酵母 • 产乙肝表面抗原的重组巴斯德毕赤酵母
乙型肝炎病毒的结构与性质
• 乙肝病毒是一种蛋白包裹型的双链DNA病毒，具 有感染力的病毒； • 乙型肝炎病毒的结构颗粒呈球面状，直径为42 nm，基因组仅为3.2 kb。病毒颗粒的主要结构蛋 白是病毒的表面抗原多肽（HBsAg）或S多肽， 它具有糖基化和非糖基化两种形式。颗粒内的蛋 白成份包括核心抗原（ HBcAg ）和病毒DNA聚 合酶、微量病毒蛋白； • 除此之外，被乙肝病毒感染的人的肝脏还能合成 并释放大量的22nm的空壳亚病毒颗粒，其免疫原 性是未装配的各种包装蛋白组份的1000倍。包装 蛋白共有三种转膜糖蛋白：S、M、L多肽。
酵母菌的载体系统
• 酵母菌克隆表达质粒的构建 • 酵母菌中的野生型质粒
酵母菌中的野生型质粒
酿酒酵母中的2μ环状质粒 几乎所有的酿酒酵母中都含有2μ双 链环状质粒，拷贝数达50至100 个。 • IRs 反向重复序列，600 bp，重组 • FLP 编码产物驱动IRs的同源重组 • REP 编码产物控制质粒的稳定性 • STB REP的结合位点 接合酵母属中的pSR1和pSB1，以 及克鲁维酵母属中的pKD1等均与 2μ质粒类似。
减少泛素依赖型蛋白降解作用的突变宿主菌
泛素降解途径衰减的酿酒酵母 • UBI 4缺陷型： 在酿酒酵母菌中，泛素主要由UBI 4基因表达，UBI 4-突 变株能正常生长，但细胞内游离泛素分子的浓度比野生株 要低得多，因此UBI 4缺陷突变株是外源基因表达理想的 受体 • UBA 1缺陷型： UBA1编码泛素激活酶E1，UBA1突变株是致死性的，但 其等位基因缺陷是非致死性的，而且也能削弱泛素介导的 蛋白降解 • Ubc4 - ubc5 双突变型： 七个泛素连接酶基因的突变对衰减蛋白降解作用同样有效
用于转化子筛选的标记基因
营养缺陷型的互补基因 • 用于酵母菌转化子筛选的标记基因主要有 营养缺陷型互补基因和显性基因两大类 • 营养缺陷型互补基因主要有氨基酸和核苷 酸生物合成基因，如：LEU、TRP、HIS、 LYS、URA、ADE • 但对于多倍体酵母来说，筛选营养缺陷型 的受体非常困难
用于转化子筛选的标记基因
酵母菌表达系统的选择
多型汉逊酵母表达系统 • 多型汉逊酵母也是一种甲基营养菌。其自主复制 序列HARS已被克隆，并用于构建克隆表达载体， 但与巴斯德毕赤酵母相似，这种载体在受体细胞 有丝分裂时显示出不稳定性。所不同的是， HARS质粒能高频自发地整合在受体的染色体 DNA上，甚至可以连续整合100多个拷贝 • 目前，包括乙型肝炎表面抗原在内的数种外源蛋 白在该系统中获得成功表达。 ，因此重组多型汉 逊酵母的构建也是采取整合的策略。
酵母菌的宿主系统
• • • • 提高重组蛋白表达产率的突变宿降解作用的突变宿主菌 广泛用于外源基因表达的酵母宿主菌
广泛用于外源基因表达的酵母宿主菌
目前已广泛用于外源基因表达和研究的酵母菌包括： • 酵母属如酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae） • 克鲁维酵母属如乳酸克鲁维酵母（Kluyveromyces lactis） • 毕赤酵母属如巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris） • 裂殖酵母属如非洲酒裂殖酵母（Schizosaccharoyces pombe） • 汉逊酵母属如多态汉逊酵母（Hansenula polymorpha） 其中酿酒酵母的遗传学和分子生物学研究最为详尽，但巴斯 德毕赤酵母表达外源基因最理想。
转化质粒在酵母细胞中的命运
• 单双链DNA均可转化酵母菌，但单链的转化率是 双链的10-30倍； • 含有复制子的单链质粒进入细胞后，能准确地转 化为双链并复制； • 不含复制子的单链质粒进入细胞后，能高效地同 源整合入染色体,这对于体内定点突变酵母基因组 极为有利； • 克隆在YIp整合型质粒上的外源基因，如果含有受 体细胞的染色体DNA的同源序列，会发生高频同 源整合，整合子占转化子总数的50-80%。
F利用重组酵母生产乙肝疫苗
• 由乙型肝炎病毒（HBV）感染引起的急慢 性乙型肝炎是一种严重的传染病，每年约 有220000万病人死亡，并有33亿人成为 HBV携带者，其中相当一部分人可能转化 为肝硬化或肝癌患者。目前对乙型肝炎病 毒还没有一种有效的治疗药物，因此高纯 度乙型疫苗的生产对预防病毒感染具有重 大的社会效益，而利用重组酵母大规模生 产乙型疫苗为其广泛应用提供了可靠的保 证。
含有酵母菌染色体DNA同源序列的YIp质粒的构建
• 在大肠杆菌质粒上组装酵母菌染色体DNA 特定序列和标记基因， • 构建出来的质粒称为Yip。目的基因表达盒 通常插在染色体DNA特定序列中，这样目 的基因就能高效整合入酵母菌特定的染色 体DNA区域.
酵母菌的转化系统
• 转化质粒在酵母细胞中的命运 • 酵母菌的转化程序 • 用于转化子筛选的标记基因
酵母菌表达系统的选择
乳酸克鲁维酵母表达系统 • 乳酸克鲁维酵母的双链环状质粒pKD1已被 广泛用作重组异源蛋白生产的高效表达稳 定性载体，即便在无选择压力的条件下， 也能稳定遗传40代以上。 • 乳酸克鲁维酵母表达分泌型和非分泌型的 重组蛋白，性能均优于酿酒酵母表达系统。
酵母菌表达系统的选择
巴斯德毕赤酵母表达系统 • 巴斯德毕赤酵母是一种甲基营养菌，能在低廉的 甲醇培养基中生长，甲醇可高效诱导甲醇代谢途 径中各酶编码基因的表达，因此生长迅速、乙醇 氧化酶基因AOX11所属强启动子、表达的可诱导 性是巴斯德毕赤酵母表达系统的三大优势。 • 由于巴斯德毕赤酵母没有合适的自主复制型载体， 所以外源基因的表达序列一般整合入受体的染色 体DNA上。在此情况下，外源基因的高效表达在 很大程度上取决于整合拷贝数的多寡。目前已有 20余种具有经济价值的重组蛋白在巴斯德毕赤酵 母系统中获得成功表达。
酵母菌作为表达外源基因受体菌的特征
酵母菌表达外源基因的优势
• 全基因组测序，基因表达调控机理比较清楚，遗传操作简 便 • 能将外源基因表达产物分泌至培养基中 • 具有原核细菌无法比拟的真核蛋白翻译后加工系统 • 大规模发酵历史悠久、技术成熟、工艺简单、成本低廉 • 不含有特异性的病毒、不产内毒素，美国FDA认定为安全 的基因工程受体系统（Generally Recognized As Safe GRAS） • 酵母菌是最简单的真核模式生物
酵母菌的转化程序