纤维素酶发酵工艺的研究进展

河北农业科学，２００９，１３（１２）：３５－３６，４２ＪｏｕｒｎａｌｏｆＨｅｂｅｉＡｇｎｃｕｌｔｕｒａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ编辑索相敏

纤维素酶发酵工艺的研究进展曾青兰，王志勇（成宁职业技术学院，湖北咸宁４３７１００）

摘要：综述了纤雏素酶发酵生产的主要菌种、发酵培养基、固态发酵工艺和液态深层发酵＿Ｔ－艺。展望了纤维素酶发酵生产的前景。关键词：纤雏素酶；发酵工艺；固态发酵；液态深层发酵中图分类号：ＴＱ９２０．１文献标识码：Ａ文章编号：１００８—１６３１（２００９）１２－００３５－０２

ＡｄｖａｎｃｅｓｉｎＦｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙｏｆＣｅｌｌｕｌａｓｅＺＥＮＧＱｉｎｇ—ｌａｎ，ＷＡＮＧＺｈｉ—ｙｏｎｇ（ＸｉａｎｎｉｎｇＶｏｃａｔｉｏｎａｌＴｅｃｈｎｉｃａｌＣｏｌｌｅｇｅ，Ｘｉａｎｎｉｎｇ４３７１００，Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｔｈｅｓｔｒａｉｎｓ，ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎｍｅｄｉａ，ｓｏｌｉｄｓｔａｔｅｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙａｎｄｌｉｑｕｉｄｄｅｅｐｌａｙｅｒｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙｏｆｃｅｌｌｕｌａｓｅｐｒｏｄｕｃｅｄｂｙｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎｗｅｒｅｓｕｍｍａｒｉｚｅｄ．Ｔｈｅｐｒｏｓｐｅｃｔｗａｓｆｏｒｅｃａｓｔｅｄ．Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：Ｃｅｌｌｕｌａｓｅ；Ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ；Ｓｏｌｉｄｓｔａｔｅｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ；Ｌｉｑｕｉｄｄｅｅｐｌａｙｅｒｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ

纤维素酶是指能水解纤维素８．１，４葡萄糖苷键，将纤维素降解成纤维二糖和葡萄糖的一组酶的总称。纤维素酶的研究开发是利用新世纪的可再生资源——纤维素的关键，是缓解人类当前面临的“粮食、能源、环境”三大危机，实现农业可持续发展的有效途径之一。为了提高纤维素酶的产率、更好地利用纤维素，愈来愈多的国内外学者开始关注纤维素酶的发酵生产，纤维素酶的发酵工艺水平不断改进，生产效益和经济效益也不断提高。１纤维素酶发酵生产的主要菌种微生物是自然界中产纤维素酶的主要生物体。但细菌所产纤维素酶多为胞内酶，产量较低，在工业上应用得较少。真菌产生的纤维素酶多为胞外酶，提取纯化较容易，产酶量较高，且真菌所产纤维素酶的酶系结构较全，酶系中的各种酶相互发生强烈的协同作用，降解纤维素的效率高，是工业生产的主要菌种。如里氏木酶（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａｒｅｅｓｅｉ）和绿色木霉（Ｔｒｉｃｈ∞ｄｅ舢口ｉ础ｎ瑙．ｅｘＦｒ．）等是目前公认的较好的纤维素酶生产菌…。优良的诱变菌种，是纤维素酶发酵生产菌的另一来源。韩峰等旧１以拟康氏木霉（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａｐｓｅｕｄｏｋｏ加ｉｎｇｉｉ）ＴＨ为出发菌株，采用紫外诱变获得１株抗高浓度葡萄糖阻遏突变株ｕＶⅢ，纤维素酶产量显著提高。ＵＶⅢ对诱导物的敏感性增加了１００倍，并且对葡萄糖的吸收能力明显下降，使得该菌解除了部分葡萄糖的阻遏作用。随着现代分子生物学技术的发展，基因工程菌也成为了纤维素酶发酵生产菌的来源之一，如汤新等ｐｏ构建的工程菌Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓＥＧＩＶｌ，在甲醇诱导下，可以合成并分泌ＥＧｌＶ，ＣＭＣ活力达到２．１１ｕ／ｍＬ。收稿日期：２００９—１２－０４基金项目：湖北省教育科学“十一五”规划专项资助（２００８８１５２）作者简介：曾青兰（１９６５一），女，湖北咸宁人，硕士，副教授，主要从事酶分子进化工程的研究。纤维素酶发酵生产的重点之一是将２种以上产酶微生物一起接种进行混合发酵，利用它们所产各纤维素酶系的互补作用，生产出优质高效的混合纤维素酶。

２纤维素酶发酵生产的培养基纤维素酶是诱导酶，其生物合成的调控受诱导物的约束。通常采用经过粉粹并预处理的富含植物纤维原料、废纸、各种酒糟等作为诱导物和主要碳源，添加适宜的氮源和无机盐等。瓮佩芳等Ｈ１在啤酒糟中添加１５％麸皮、２％尿素、ｌ％硫酸铵和０．１５％的ＫＨ：ＰＯ。，可以明显提高产物的酶活力和蛋白含量。进行液态发酵时，另外需要将物料与过量的水配成液体培养基，多数研究者采用干物料占液体培养基３％的用量∞１。余晓斌等旧１用响应面法对里氏木霉ＷＸ．１１２液体发酵产纤维素酶的培养基进行了优化，通过岭脊分析，确定了滤纸酶活达最大值１０．５３ＩＵ／ｍＬ时的最佳组合条件：豆饼粉３．１８％，麸皮２．９５％，ＫＨ２Ｐ０４０．２５％，Ａｖｉｃｅｌ３。７９％。

３纤维素酶固体发酵工艺

３．１固体发酵工艺３．１．１固体发酵工艺特点

固体发酵法又称麸曲培养

法，是以秸秆粉、废纸、玉米秸秆粉为主要原料，拌入种曲后．装入盘或帘子上，摊成薄层（厚约１ｃｍ），在培养室一定温度和湿度（ＲＨ９０％一１００％）下进行发酵。其主要特点是发酵体系没有游离水存在，微生物是在有足够湿度的固态底物上进行反应，发酵环境接近于自然状态下的微生物生长习性，产生的酶系更全，有利于降解天然纤维素，且投资低、能耗低、产量高、操作简易、回收率高、无泡沫、需控参数少、环境污染小等。但固体发酵法易被杂菌污染，生产的纤维素酶分离纯化较难．且色素不易去除。３．１．２固体发酵设备浅盘发酵器是比较常用的一种

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２００９莅

固态发酵设备，培养基经灭菌冷却后装入浅盘，通过空气增湿器调节空间的温湿度进行发酵，工业化程度较低。固体发酵设备发展的趋向是机械化发酵罐，尤其是流化床式固体发酵设备，发酵效果将更好＂Ｊ。３．１．３固体发酵工艺流程斜面试管一小三角瓶培养一大三角瓶培养一种子罐培养Ｉ（髫雾）一粉碎一（麸皮、袈盐等）一混合一蒸煮灭菌一冷却接种ｌ成品一包装一千燥＋－过滤一盐析一浓缩一过滤一浸提一固体发酵３．１．４固体发酵工艺条件固体发酵过程中的温度、湿度、时间、水分、ｐＨ值等因素及其交互作用对发酵有显著影响，对周态发酵而言，温度是首要因素。培养基及培养条件的优化，是降低酶制剂成本、提高酶活、实现其工业化生产的重要措施。一般认为利用真菌进行固态发酵最好将培养基的起始ｐＨ值调为酸性，这样有利于真菌的生长而抑制细菌的滋生。固态发酵培养基的初始含水量，应视纤维素材料种类不同而异。玉米秸秆培养基适宜的含水量为１：（２—２．５）（ｗ／ｗ），麦秸培养基适宜的含水量为１：（１—１．５），啤酒糟培养基的含水量为１：ｌ¨１。靖德兵等一。采用均匀设计Ｕ１５（５８）和双温度培养法（前３０ｈ恒温３０℃，后续恒温２７℃）进行康氏木霉产酶固体发酵生产纤维素酶条件的研究，结果表明，应用双温度培养法进行康氏木霉固体发酵生产纤维素酶时，在自然补给氧气、培养基ｐＨ值自然（约６．５）并保持环境湿度约６０％的条件下，７２ｈ是适宜的发酵周期。徐福建等‘１０‘提出了纤维素酶气相双动态固态发酵的方式：在优化条件下（最佳压力脉冲范围、脉冲频率及气体内循环速率），发酵温度得到较好地控制，９１０ｃｍ高的填料层中最大温度梯度为０．１２ｏＣ／ｃｍ；以汽爆秸秆为底物，发酵水活度得到较好的保持；动态培养发酵周期（６０ｈ）比静态发酵周期（８４ｈ）缩短了１／３，酶活（２０１３６ＩＵ／ｇ）比静态酶活（１０１８２ＩＵ／ｇ）提高了１倍，压力脉动固态培养的料层上中下微生物生长状况均匀一致且疏松，而静态固态发酵的料层中部几乎没有菌体生长。利用气相双动态固态发酵可为纤维素酶大规模生产奠定基础。４纤维素酶液态深层发酵工艺４．１液态深层发酵工艺特点液态深层发酵又称全面发酵，是将秸秆等原料粉碎、预处理并灭菌后送至具有搅拌桨叶和通气系统的密闭发酵罐内，接入菌种，借强大的无菌空气或自吸的气流进行充分搅拌，使气、液面积尽量加大而进行发酵。其主要特点是培养条件容易控制，不易染杂菌，生产效率高。液态深层发酵是现代生物技术之一，已成为国内外重要的研究和开发工艺。４．２液态深层发酵设备液态深层发酵一般采用具有搅拌桨叶和通气系统的密闭发酵罐，从培养基的灭菌、冷却到发酵都在同一发酵罐内进行。４．３液态深层发酵工艺流程

斜面试管一小三角瓶培养一大三角瓶培养一种子罐培养Ｉ

（芸蒜）一粉碎一（麸皮、蒜盐等）一混合一蒸煮灭扑冷却接种

‘Ｉ成品—包装一喷雾干燥一超滤浓缩一压滤一液体深层发酵

４．４液体深层发酵工艺条件液体发酵时问约为７０ｈ，温度一般低于６０℃。液态发酵中使用的接种量明显低于固态发酵，其接种量浓度一般为２％一１０％（ｖ／ｖ）。张冬艳等【１¨研究了绿色木霉ＡＳ．３．３７１１、康宁木霉ＡＳ．３．２７７４、木霉ＡＳ．３．３０３２和康宁木霉ＡＣＣ．３．１６７的适宜发酵产酶条件，结果表明，最适温度为２８℃，产酶适宜的起始ｐＨ值为４．５—５．５。曾青兰等¨２。对丝状真菌菌株ＧｉｂｂｅｒｅＵａｆ可ｉｋｕｒｏｉ产纤维素酶的条件进行了研究，结果表明，接种量为

５％、培养时间为１２０ｈ、培养温度为２８～３７℃、培养基初始ｐＨ值为５—６时，产酶可以达最佳值。

５纤维素酶发酵生产的前景２１世纪是可持续发展的世纪，随着人们对纤维素酶研究工作的深入，必将研制出更为有效的纤维素酶发酵生产的新工艺，较好地解决纤维素的生物转化问题，从而切实地缓解人类当前面临的“粮食、能源、环境”３大危机。纤维素酶的工业化发酵生产必将成为大有发展前途的新兴工业产业之一。

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ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ

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