胚胎干细胞的培养及其影响因素
小鼠胚胎干细胞培养
以下培养针对于小鼠的R1胚胎干细胞系，其它胚胎干细胞的培养可以参考。
不过人的胚胎干细胞培养不可以采用下面的protocol，需要用专用的protocol和培养基。
一般培养－－维持ES细胞处于未分化状态ES细胞培养用含有LIF（白血病抑制因子）和Feed细胞的培养基（高糖）来阻止细胞的分化。
为细胞提供包被有0.1％明胶的平板作为粘附细胞的基质。
建议每2－3天从达到80％－90％融合的平板按1：8的比率传代细胞一次，细胞传代以后，在将细胞接种在0.1％明胶包被的培养皿之前，通过预先将细胞接种在没有经过包被的组织培养板2个小时，使分化细胞粘附，从而将分化和未分化细胞分开。
将细胞全程置于37℃，5％CO2，100％湿度条件下培养。
如果在Feed细胞，那么就需要采用MMC进行处理，抑制Feed细胞增殖，但仍然能保持其分泌LIF因子的活性。
下文中暂不提及Feed细胞。
Feed细胞可以来源于STO细胞或原代胚胎成纤维细胞。
培养基ES:配制一20×不含DMEM，HS，LIF的溶液（该溶液也能用于EB培养基－－见下文）。
分装在50ml 离心管中，（稀释为2×，每管42ml），贮存在-20℃。
通过将21ml该溶液，HS和LIF加入450ml DMEM中制备培养基，0.22 μm滤膜过滤。
贮存于4℃，时间不要超过2周。
贮存液DMEM（高糖）马血清（HS）L-谷氨酰胺（200mM）MEM NEAA（10mM）HEPES（1M）β-巯基乙醇（55Mm）PESTLIF复苏细胞细胞被冻存在10％二甲基亚砜（DMSO）中防止结晶的形成，结晶的形成会损害细胞。
然而，二甲基亚砜对细胞有毒性，快速的进行细胞复苏是很重要的。
步骤：1．从液氮中取出一管细胞；2．将冻存管置于37℃水浴中2分钟（或放到管内溶液恰好完全溶解）；3．将细胞转移到一15ml Falcon管中；4．加入5ml ES培养基（用培养基冲洗冻存管）；5．离心3分钟；6．弃上清，用2ml ES培养基重悬细胞，至少吹打10次；7．接种在明胶包被（见下文）的6孔或6cm组织培养皿；8．孵育。
胚胎干细胞体外诱导分化的研究进展
04
胚胎干细胞体外诱导分化的应用前景
疾病治疗与药物筛选
疾病治疗
胚胎干细胞具有多向分化潜能，可分化为特定类型的细胞，如神经细胞、心肌细 胞等，为疾病治疗提供了新的途径。例如，通过诱导胚胎干细胞分化为神经细胞 ，可以用于治疗帕金森病、阿尔茨海默病等神经系统疾病。
药物筛选
胚胎干细胞可在体外培养扩增，为药物筛选提供了大量的实验样本。通过比较胚 胎干细胞在药物处理前后的分化过程和表型变化，可以评估药物的疗效和副作用 ，为新药研发提供有力支持。
表观遗传修饰
表观遗传修饰可以影响胚 胎干细胞的分化，如DNA 甲基化、组蛋白乙酰化等 。
03
胚胎干细胞体外诱导分化方法
化学诱导分化方法
化学诱导分化是利用化学物质 调节胚胎干细胞的分化过程。
常用的化学物质包括细胞因子 、激素、小分子化合物等。
这些化学物质通过调节胚胎干 细胞的基因表达、信号转导等 途径，诱导细胞定向分化。
组织工程与器官移植
组织工程
胚胎干细胞具有发育成各种组织的潜力，为组织工程提供了理想的基础材料。例如，可以诱导胚胎干细胞分化 为软骨、肌肉、血管等组织，用于修复或替换受损的组织器官。
器官移植
胚胎干细胞可分化为多种器官细胞，为器官移植提供了新的来源。与传统的器官移植相比，胚胎干细胞诱导分 化的器官具有更好的组织匹配性和更少的不良反应，有望成为解决器官短缺和提高移植效果的重要途径。
研究方法
采用体外培养胚胎干细胞的方法，通过添加不同的诱导因子 或采用特殊的培养条件，观察细胞的分化过程和分化产物的 特性，同时结合分子生物学、细胞生物学等技术手段分析相 关机制。
02
胚胎干细胞特性与分化机制
胚胎干细胞特性
胚胎干细胞在再生医学中的应用及其局限性
胚胎干细胞在再生医学中的应用及其局限性随着科技的发展，再生医学成为了一个备受关注的领域，其中胚胎干细胞作为再生医学的“明星”，备受关注。
但是，对于跨越正常生理的应用还存在伦理道德问题，以及一些局限性。
本文将探讨胚胎干细胞在再生医学中的应用及其局限性。
一、胚胎干细胞的定义与特点胚胎干细胞指来源于早期胚胎的一类具有自我复制和分化潜能的干细胞，可以区分为内胚层干细胞和外胚层干细胞。
胚胎干细胞具有以下特点：①自我更新②可分化成不同细胞类型③可以体外繁殖因此，胚胎干细胞可用于再生医学和基础研究。
二、胚胎干细胞在再生医学中的应用1. 代替病变细胞胚胎干细胞可以通过体外培养形成各种组织和器官细胞，如心脏细胞、神经元细胞、肝细胞等。
因此，如果人体某个部位的细胞暴露于病变或正常衰老的威胁，那么胚胎干细胞可以用于替代这些病变的细胞，从而治疗许多疾病，如心脏病、糖尿病、帕金森病等。
2. 治疗疾病胚胎干细胞可以用于治疗许多不可治愈的疾病，如心脏病、糖尿病、癌症等。
利用胚胎干细胞治疗疾病的方法是，将干细胞注射到病人的体内，让其分化成需要的细胞类型从而修复破损组织。
三、胚胎干细胞的局限性1. 伦理、道德问题人类胚胎的获得是胚胎干细胞应用的基础。
因此，胚胎干细胞的研究与使用在伦理和道德方面引起了争议和质疑。
对于胚胎干细胞的使用可能侵犯被使用的这些胚胎的尊严和权利。
如果利用胚胎干细胞进行研究和应用，需要在相应的法律与伦理规范、社会共识以及利益平衡的基础上来进行。
2. 值得注意的潜在风险在应用胚胎干细胞过程中的潜在的风险包括，潜在的细胞突变风险、组织排异反应、T细胞和自身免疫细胞的反应等。
此外，由于胚胎干细胞具有无限制自我复制的能力，其对人体的潜在恶性肿瘤形成风险也需要被考虑到。
3. 模式性问题胚胎干细胞只可以形成特定的细胞类型，并不适合于所有的修复需求。
此外，由于体内的生产环境具有的多样性，使用胚胎干细胞时存在与体内环境之间的差距，这也会影响再生医学的实用性。
动物克隆 第三章胚胎干细胞分离培养
第三章胚胎干细胞分离培养1981年，Evens等首次发现小鼠胚胎干细胞(embryonic stem cells，ESCs)在体外具有稳定增殖并维持未分化状态及分化全能性潜能的特性，并成功建立小鼠ESCs系[1]。
由于ESCs独特的生物学特性，ESCs方面的研究迅速成为生命科学研究领域的热点之一，1999年－2000年连续两年被评为世界十大科技新闻。
ESCs已成为分子遗传学、发育生物学、细胞工程、组织工程等研究的重要工具，在研究细胞分化机制、临床治疗、转基因等方面有着重要的意义。
随着对干细胞研究的不断深入，人们将逐渐掌握和利用干细胞，还将推动相关学科的发展。
文章综述了ESCs的研究概况、体外分离培养、生物学特性、鉴定方法、影响ESCs分离培养的因素、存在问题以及应用前景等。
1 胚胎干细胞研究概况ESCs的研究最早要追溯到畸胎瘤细胞的发现，但真正意义上的开始却是1981年Evens等首先从延缓着床的胚泡分离培养到小鼠的ESCs，并建立小鼠的ESCs系，之后ESCs研究迅速发展，已在大鼠、仓鼠、猪、牛、水貂、兔、山羊、绵羊、恒河猴和人等多种哺乳动物上建立了类ESCs系[2]。
近几年来，ESCs研究在ESCs来源与培养方法、探索建立和维持ESCs系的条件、定向诱导分化、遗传操作、疾病动物模型的治疗等方面取得了一定的进展。
研究人员利用体细胞核移植技术进行胚胎重建，从克隆胚胎中成功得到小鼠、兔和人等多种哺乳动物ESCs[3-5]；利用孤雌激活技术建立小鼠和非人灵长类孤雌激活胚胎源的ESCs系[6]，这些为ESCs的分离克隆开辟了新的途径。
利用定向诱导分化技术成功将ESCs分化为造血细胞、内皮细胞、肝细胞、脂肪细胞、软骨细胞、神经细胞、胰岛细胞、心肌细胞、成骨细胞，甚至滋养层细胞和生殖细胞等所有3 个胚层的细胞类型[7-13]。
试验表明，人ESCs 能有效治疗心肌梗死、糖尿病、中风等疾病。
国内在ESCs方面的研究起步较晚，但发展迅速，在相关领域做了大量的研究。
人胚胎干细胞的分离、培养及建系的开题报告
人胚胎干细胞的分离、培养及建系的开题报告题目：人胚胎干细胞的分离、培养及建系的研究一、论文背景胚胎干细胞（ES）是一种具有自我更新和多能性的细胞，能够分化为各种不同类型细胞的祖细胞。
ES细胞可以应用于疾病治疗、组织工程、毒理学研究等领域。
因此，分离、培养及建系人胚胎干细胞对于应用于医学治疗方面具有广泛的应用前景。
二、研究内容简介本研究以人胚胎为材料，从人体内获取的胚胎细胞将经过几个重要的步骤：胚胎的获取，胚胎的培养和胚胎的建系。
这些步骤将使用先进的技术来成功地完成：体外受精（IVF）和胚胎细胞分离技术（ICM）。
三、研究方法和技术路线1.体外受精：用体外受精法获得人类胚胎；2.胚胎细胞分离技术（ICM）：通过ICM技术从胚胎内部取出细胞（包括外胚层细胞和内胚层细胞），并培养在适当的培养基中；3.胚胎细胞建系：接种内胚层细胞到培养皿上形成胚胎体外诱导体系，进一步分离、筛选并筛选出具有自我更新和多能性的细胞。
四、预期创新点和意义本研究将利用最新的实验室技术方法，成功地分离、培养及建系人胚胎干细胞，建立人胚胎干细胞库，为疾病治疗、组织工程和毒理学研究提供了重要的细胞材料。
此外，本研究还将为更深入的胚胎细胞研究提供参考。
五、研究进度安排1.前期准备（2个月）：查阅相关文献，了解研究现状，为研究做出详细的计划；2.胚胎获取（2个月）：借助医院的胚胎移植技术，收集细胞材料；3.体外受精法（1个月）：借助内科医生协作，使用体外受精法获得人类胚胎；4.胚胎细胞分离技术（ICM）（2个月）：本研究将使用ICM技术从胚胎内部取出细胞，包括外胚层细胞和内胚层细胞；5.建立胚胎体外诱导体系（2个月）：接种内胚层细胞到培养皿上构建胚胎体外诱导体系；6.筛选出具有多能性的细胞（2个月）：进一步分离、筛选并筛选出具有自我更新和多能性的细胞；7.讨论和总结（1个月）：研究结果的讨论和总结。
六、预期研究成果本研究将成功分离、培养及建系人胚胎干细胞，建立人胚胎干细胞库，为疾病治疗、组织工程和毒理学研究提供重要的细胞材料，同时为更深入的胚胎细胞研究提供参考。
哺乳动物胚胎干细胞的分离和培养
哺乳动物胚胎干细胞的分离和培养随着科技的发展，胚胎干细胞已经成为了诸多领域中相当受重视和关注的一种细胞，其独特的生物学特性在组织再生、细胞治疗、疾病研究等方面得到了广泛的应用。
而胚胎干细胞的获取途径，主要有胚胎干细胞的分离和培养，后来又发展了生殖细胞干细胞和诱导多能干细胞等变体。
其中，胚胎干细胞的分离和培养是获取胚胎干细胞的最主要方式之一。
实现胚胎干细胞的分离和培养，需要克服很多技术难题，因此需要结合内分泌学、遗传学、细胞学等许多知识和方法。
一、哺乳动物胚胎干细胞的来源和种类体内的胚胎其实是非常珍贵的资源，而哺乳动物胚胎是分离并培养胚胎干细胞的最主要来源之一。
而胚胎干细胞又分为内胚层干细胞和外胚层干细胞两种。
内胚层干细胞发源于极早期的胚胎，负责形成所有的胚胎层组织和器官。
而外胚层干细胞则起源于滋养层，是胚胎和胎儿的外层，主要分化为胎盘和涵盖胚胎的腔囊。
二、胚胎的提取和悬浮培养胚胎干细胞的提取是分离和培养胚胎干细胞的最基本步骤。
其实胚胎的提取有很多种方法，如体外受精、腹腔注射、放置细胞培养皿等。
其中，放置细胞培养皿的方法成本较低且技术难度较低，成为了主要的选项之一。
在胚胎提取之后，需要进行悬浮培养。
悬浮培养的目的是维持胚胎在一定的温度和湿度下进行生长和发育，同时也为胚胎干细胞的分离、培养提供了条件。
悬浮培养要注意的是，其浓度和成分的选择应当因胚胎发育的不同阶段而有所不同。
三、哺乳动物胚胎干细胞的分离哺乳动物胚胎干细胞的分离是胚胎干细胞的获取的最关键的步骤之一，也是技术难度最大的步骤。
目前主要有三种方法来从胚胎中分离胚胎干细胞，即机械分离法、酶消化分离法和选择性黏附法。
相比于其他两种方法，机械分离法是分离胚胎干细胞的常用方法。
首先，需要用小胚胎钳和针管将胚胎的外壳和滋养层取出，释放出内部的细胞块。
然后用切割或挤压的方式分离胚胎内部的细胞并编集成单个细胞，萃取出胚胎干细胞。
四、哺乳动物胚胎干细胞的培养哺乳动物胚胎干细胞的培养在细胞注重环境及其能力与组合方面具有极高的要求。
利用培育技术进行胚胎干细胞培养的操作步骤
利用培育技术进行胚胎干细胞培养的操作步骤胚胎干细胞（Embryonic Stem Cells，简称ESCs）是一种具有无限分裂潜能的细胞，可以分化成人体中任何类型的细胞。
这使得胚胎干细胞培养成为研究和治疗许多疾病的潜在方法。
在利用培育技术进行胚胎干细胞培养的操作步骤中，有几个关键的步骤是必须仔细考虑和执行的。
首先，需要获取胚胎。
这个过程通常是通过体外受精(In Vitro Fertilization，简称IVF)完成的。
医生会收集女性的卵子和男性的精子，然后将它们结合在一起，在实验室环境中进行体外受精。
这一步骤要确保卵子和精子的质量，并控制好培养环境的温度和湿度。
接下来，受精后的卵子会不断分裂，形成胚胎。
为了获取胚胎干细胞，最常用的方法是在胚胎发育到八细胞阶段时，将其分离成单个细胞。
这个过程被称为细胞扩增(Cell Expansion)。
细胞扩增的关键是确保每个细胞的健康和稳定性。
细胞扩增过程中，常常需要添加培养基和生长因子，以促进细胞的分裂和生长。
当细胞扩增到一定数量时，就可以开始进行胚胎干细胞的分化。
分化过程通常涉及将胚胎干细胞移植到特定的培养基中，并加入适当的生长因子和细胞信号转导分子。
这些因子和分子可以模拟人体内特定发育时期的信号，从而促使胚胎干细胞向特定种类的细胞分化。
例如，通过添加一种叫作“Noggin” 的蛋白质，胚胎干细胞可以被诱导分化为神经细胞。
分化的结果取决于培养的时间和添加的生长因子，以及其他培育条件的调节。
通过对胚胎干细胞的培养和分化过程进行精确控制，研究人员可以获得一系列不同类型的细胞，包括心脏细胞、肝细胞、胰岛细胞等。
这些特定的细胞类型可以应用于研究、药物测试和再生医学等领域。
需要注意的是，胚胎干细胞培养涉及许多伦理和法律问题。
在进行胚胎干细胞研究和应用时，必须确保遵守伦理准则和法律规定，保护人类生命和尊严。
总结来说，利用培育技术进行胚胎干细胞培养涉及从胚胎获取细胞、进行细胞扩增和细胞分化的过程。
胚胎干细胞保存方法
胚胎干细胞保存方法引言胚胎干细胞作为一种具有高度潜能的细胞类型，被广泛认为是未来医学领域的重要研究方向之一。
由于其能够分化为各种不同类型的细胞，提供了治疗众多疾病的潜在可能性。
因此，胚胎干细胞的保存方法变得至关重要，能够确保其长期保存和有效利用。
本文将介绍胚胎干细胞保存的各种方法及其优劣势。
冷冻保存冷冻保存是最常用的胚胎干细胞保存方法之一。
其原理是将胚胎干细胞在非常低的温度下（通常为-196C）停止其新陈代谢过程，以保持其生物活性。
这种方法具有以下优势：- 冷冻保存可以长时间保存胚胎干细胞，并确保其品质不受损害。
- 冷冻保存相对简单，需要的设备和材料较为常见。
- 冷冻保存可以经过适当的处理，使胚胎干细胞能够在需要时被再次使用。
然而，冷冻保存也存在一些限制和挑战：- 冷冻保存的过程对胚胎干细胞很有挑战性，可能导致部分细胞无法恢复生活活性。
- 冷冻保存的设备和条件要求非常严格，不易达到普遍可行的水平。
- 冷冻保存可能对胚胎干细胞的质量产生一定的影响。
液氮保存液氮保存是一种类似于冷冻保存的方法，但其温度更低。
胚胎干细胞在液氮中保存的优势和挑战与冷冻保存相似。
值得一提的是，液氮保存可以更长时间地保持细胞的生物活性，因为液氮的温度低于冷冻保存的温度。
细胞培养保存细胞培养保存是另一种常见的胚胎干细胞保存方法，其原理是将细胞培养在适当的培养基中，并提供所需的营养物质和生长因子，以维持其生存和分化的能力。
这种方法具有以下优势：- 细胞培养可以保持细胞在一个相对稳定的状态，以防止其变异或损坏。
- 细胞培养保存可以在细胞需要时提供更好的控制。
- 细胞培养可以根据需要进行细胞增殖和分化。
然而，细胞培养保存也存在一些限制和挑战：- 细胞培养保存需要提供适当的培养环境，包括温度、气体组成、培养基等，条件较为复杂。
- 细胞培养保存需要对培养基进行定期更换和细胞分离，维持细胞的健康状态。
- 细胞培养保存可能受到细菌或其他污染物的影响，对保存的胚胎干细胞的质量产生影响。
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胚胎干细胞的培养及其影响因素前言胚胎干细胞（embryonic stem cell，ESC）是一种高度未分化的、具有发育多潜能性的细胞，可在体外培养扩增、遗传操作，在适当条件下可诱导分化为多种组织细胞，还可与受体胚胎发生嵌合，形成嵌合体，为细胞分化、胚胎发育、肿瘤发生、药物鉴定等方面的深入研究提供了理想的细胞模型，为组织工程、细胞移植、基因治疗等开创了取之不尽、用之不竭的细胞资源。
1981年Evans 和Kaufman 将延迟着床的小鼠囊胚接种在经丝裂霉素C处理的STO（一种已建系的鼠胚成纤维细胞）上，获得了增殖而未分化的内细胞（inner cell mass,ICM ），后经传代克隆，第一个建立了小鼠ES细胞系［1］。
由于小鼠的胚胎干细胞较易发生分化，昆明种属更是如此，成功分离和克隆胚胎干细胞的关键是一方面要促进其分裂增殖，一方面要最大限度抑制其分化。
体外生长的细胞直接生长在培养液中，培养液是细胞分离培养中重要的因素[9]。
胚胎干细胞对体外培养环境的要求更为严格，其很小的变化都会影响胚胎干细胞的增殖和分化。
本课题研究了三种不同培养液对小鼠胚胎干细胞生长的影响，为今后胚胎干细胞建系工作提供一定参考依据。
研究内容与方法1. 材料1.1 实验动物昆明白小鼠。
1.2 主要试剂：PMSG;HCG;DMEM培养液；、无Ca2+、Mg2+的PBS缓冲液；杜氏磷酸盐缓冲液（PBS液）；0.25% 胰酶-ETDA混合液；丝裂酶素C（Mitomycine,Sigma）；胎牛血清（FCS，浙江生物制品厂）；新生牛血清（NBS，天津生物制品厂）；白血病抑制因子；干细胞生长因子；牛胰岛素。
[2]2 小鼠胎儿成纤维细胞的原代培养[3][4][5]2.1 胚胎的获取昆明雌性小鼠选择阴道口粘膜色淡红、略湿润的性成熟母鼠，孕马血清（PMSG）16：00腹腔注射10U，48小时后腹腔注射HCG10U，即与雄鼠按1：1合笼交配。
次日10：00观察母鼠阴道栓有无，阴道口见阴栓（乳白色或淡黄色蜡状物）即记为妊娠0.5 d，并做标记，同时雌雄分笼喂养。
选妊娠11.5-16.5D母鼠进行胎儿成纤维细胞饲养层的制备；将妊娠3.5天孕鼠断颈处死，取出子宫，用含5%NBS的PBS液从子宫角冲出胚胎[6]。
2.2 组织原代培养2.2.1 改良组织块法[7](1）在离心管剪碎组织中，加0. 25%胰蛋白酶-0. 02%EDTA，按1 mL/6胎鼠加入，轻柔吹打30S。
（2）用2倍以上成纤维细胞培养液终止，室温静置5 min，弃上清液，尽量减少组织中消化酶的剩余量。
（3）再加MEF培养液（2.5 mL/胎），吹打混匀组织块。
（4）培养瓶提前用MEF培养液湿润整个瓶底，弃多余汇集的培养液。
（5）将含有组织块的悬液均匀滴入瓶底，组织悬液随即均匀平铺于培养瓶底，不会出现组织块悬浮于培养液滴中现象。
（6）后置于37 ℃、5%CO2、100%RH培养箱中培养；（7）6小时后，将瓶底轻轻翻转平置，避免组织块脱落随培养液流动，后向组织块贴壁的背面补加液体量，继续入培养箱培养过夜；（8）第二天，轻轻翻转培养瓶，使培养液缓慢覆盖组织块，切忌动作过快，使液体产生的冲力让贴壁的组织块飘起，而造成原代培养失败。
37 ℃、5%CO2、100%RH培养箱继续培养。
（9）第三天，观察组织块贴壁及细胞游出情况，漂浮细胞多或培养液颜色变黄，将培养液及漂浮细胞全部转移至离心管中，2000rpm，8min离心去除死细胞及未贴壁组织，取上清液及新鲜培养液各一半加入培养瓶中。
2.2.2 简化酶消化法（1）向离心管剪碎组织中，加入0.05%胰蛋白酶-0. 02%EDTA，以2.5 mL/6胎鼠，轻柔吹打混匀组织，37℃水浴轻摇晃5min；（2）再加入同量的0.05%胰蛋白酶-0. 02%EDTA 轻柔吹打混匀，轻晃水浴10min；（3）超净工作台内加两倍鼠胚成纤维细胞培养液终止消化，轻吹打，最后可见絮状物将其弃之；（4）需要10cm培养皿个数=胚胎个数×0.8，培养皿个数×10 mL=最终接种细胞悬液量；（5）用培养液补足离心管中液体量，混匀均匀分配于培养皿中。
（6）将培养皿上下左右四个方向，呈“十”字型摇匀细胞，使细胞均匀分布于皿底，置37 ℃、5%CO2、100%RH培养箱中培养。
（7）第二天将培养皿中全部培养液吸弃，连同漂浮死细胞，更换为新鲜成纤维细胞培养液，进行全量换液。
2.3 继代MEF培养（1）MEF80%-90%长满培养瓶底，弃全部培养液。
（2）预先37 ℃预热的PBS清洗3遍，弃清洗液。
（3）加1ml 0. 05%胰蛋白酶-0. 02%EDTA于培养皿中，四个方向使消化液均匀流遍每个细胞表面。
（4）将培养瓶或皿置于显微镜下观察，见细胞间隙增大或大量细胞脱壁流动在消化液中时，加入两倍以上定量的培养液终止消化。
（5）弯头吸管吸取培养瓶/皿中的细胞悬液，均匀按顺序反复吹打瓶/皿各部分细胞，从瓶底部一边开始另一边结束，动作轻柔不能产生气泡，确保培养瓶细胞脱落。
（6）计数上述细胞悬液细胞数量。
（7）将上述细胞悬液一并转移入离心管中，1200rpm，5min，去除上清液。
（8）加新的培养液于离心管中，用吸管吹打使之形成均匀细胞悬液。
（9）按6×104-1×105个/mL 传代接种细胞。
原代成纤维细胞传代时可按1：8-1：10的比例进行，以后传代可按1：2-1：3进行传代。
2.4 胚胎培养将胚胎转移至预先制备好的饲养层的6孔板或12孔板，弃全部培养液，移入前1-3小时全（即，培养液1：DMEM液+10%NBS+10%FCS；部换成胚胎干细胞培养液，采用3种不同的培养液，培养液2：1+1000IU/ml LIF；培养液3:1+10mg/ml 胰岛素），置于37℃、5%CO2培养箱中培养，每天观察1次，加、换液1次，记录有关胚胎贴壁、ICM出现等生长情况。
2.5 内细胞团的分离胚胎接种到有饲养层的培养板中培养4~5天后，弃去原培养液，加入无Ca2+、Mg2+的PBS 液洗1次。
在解剖镜下剥去周围的滋胚层细胞，用吸管把转移到干净的培养皿中。
加一滴胰酶于ICM上，37℃，消化3min。
将ICM转移到新的培养液中，用吸管吹打将其打散。
把打散的细胞接种到有新鲜饲养层的培养板中，在37℃、5%CO2培养箱中继续培养。
[2]2.6 干细胞集落的分离分散的ICN细胞培养3~7d后，在倒置相差显微镜下观察细胞生长情况。
此时形成的干细胞集落为F1代，在解剖镜下将F1代干细胞集落挑出，按照ICM分离法离散F1代干细胞集落，再获得的干细胞集落称为F2代，将F2代干细胞集落挑出，再进行分离传代数次，直至获得纯净的ES细胞集落。
[2]2.7胚胎干细胞鉴定2.7.1 细胞形态学观察[7]未分化胚胎干细胞呈克隆性生长，有明显的聚集倾向，集落呈“鸟巢”状生长，圆形或椭圆形，表面光滑，结构致密，与周围饲养层细胞分界清；集落内细胞小而圆，胞浆较亮，边界不清，排列紧密，胞核较大。
2.7.2 APK染色鉴定将待测细胞用含7.5%蔗糖的1%多聚甲醛固定，底物buffer平衡，室温避光染色：75mg/ml NBT 溶于70%DMF，50 mg/ml BCIP溶于100% DMF ，染色前分别取45μl、35μl 溶于10ml底物buffer中，新鲜配制。
ES（PGC、EG)APK染色被染为深蓝紫色，饲养层细胞、分化细胞不着色[2]。
2.8 检测指标[8]实验过程中，主要比较三种不同培养液中贴壁率（贴壁胚胎数/培养胚胎数）、出现率（ICM 出现胚胎数培/养胚胎数）、F1出现率（出现F1胚胎数/培养胚胎数）、F2出现率（出现F2胚胎数/培养胚胎数4个与干细胞建系相关的指标。
3 预期结果与培养液1比较，培养液2、3对胚胎培养极更加有利，贴壁率、ICM出现率以及F1、F2出现率差异显著。
培养液2和培养液3对胚胎贴比率、ICM出现率以及F1、F2出现率比较差异不显著。
参考文献［1］Evans MJ et al. Nature,1981,292(5819):154-156.[2] 小数胚胎干细胞培养、克隆、分离、传代研究.畜牧兽医学报，2002,33（5），433-438.[3] Sohyun L. McElroy, Renee A. Reijo Pera. Preparation of mouse embryonic fibroblast feeder cells for human embryonic stem cell culture. Cold Spring Harb Protoc, 2008:5041.[4] Sohyun L. McElroy, Renee A. Reijo Pera. Culturing Human Embryonic Stem Cells with Mouse Embryonic Fibroblast Feeder Cells. Cold Spring Harb Protoc. 2008;2008:pbd. prot5042.[5] ohyun L. McElroy, Renee A. Reijo Pera. Preparation of mouse embryonic fibroblast feeder cells for human embryonic stem cell culture. Cold Spring Harb Protoc, 2008:5041.[6] 黄治军, 吕中华, 郑鹏等. 昆明小白鼠胚胎干细胞分离培养的影响因素[J]. 黑龙江畜牧兽医, 2010, 01:16-18.[7] 李济强, 马天驰等. 小鼠囊胚在胚胎成纤维细胞饲养层上向胚胎干细胞的生长发育[J]. 中国组织工程研究与临床康复, 2009, 13(14):2779-2782.[8] 杨奇, 史远刚, 窦忠英. 影响小鼠胎儿成纤维细胞饲养层的因素[J]. 动物医学进展, 2001, 22(4):45.[9] Miyabayashi T, Yamamoto M, Sato A, et al. Indole derivatives sustain embryonic stem cell self-renewal in long-term culture[J]. Biosci Biotechnol Biochem, 2008. 72(5):1242-1248.。