第七章 层析技术
层析技术名词解释生物化学
层析技术名词解释生物化学
层析技术是一种用于分离化学物质、检测其组成以及研究它们之间相互作用的技术。
生物化学中层析技术是分离复杂组分，研究有机分子结构和行为的重要工具。
它通常用于研究大分子样品中小分子组分的组成，以及研究大分子行为的机理。
层析技术通常分为几种，包括高效液相色谱（HPLC）、柱层析和质谱法（MS）。
这些技术的主要原理是使用不同的条件来把一个大的物质分解成若干小的部分，以便更好地分析其结构。
HPLC分解液体原料的未知成分，它的原理是利用压力将液体溶质在固定条件下分解成不同组分。
而柱层析技术则是通过混合不同浓度的溶剂来萃取和精炼溶质，以便更好地观察它们的分子结构和行为。
MS则是利用电离和其他物理原理来辨别溶质的分子结构，这需要极强的精确度和精细度。
层析技术在生物学中用于研究生物体内各种物质的组成及其作用机理、行为和互作关系。
它用于分离有机化合物的各种组分，比如氨基酸、糖类、蛋白质和脂质。
它也可以研究有机物质、毒素和药物之间的相互作用，以及与生物物质的相互作用。
此外，层析技术可以以最佳状态和最佳梯度方式研究有机物质的组成和配合，用于精确测定有机物质的结构和性能。
此外，层析技术也用来研究血清中的各种成分的比例，以促进病毒或疾病的检测和诊断。
凝胶层析法
聚丙烯酰胺凝胶的性质
生物凝胶的编号反映出它的分离界限。 如Bio-Gel P-100。
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四、琼脂糖类凝胶 （Sepharose ）
（一）琼脂糖凝胶
结构是由β-D-半乳糖与3，6-脱水-L-半乳糖以α-1，3和β-1，4-糖苷键相间连接而成的链状分子。
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Sepharose
琼脂糖凝胶（agarose gel）可以分离葡聚糖凝
胶和生物胶所不能分离的大分子，使凝胶层析的分
离区间扩大到大分子和病毒颗粒，其最大范围可达 相对分子质量108，但是由于琼脂有强烈的吸附作用， 给使用造成了困难，后来，基；另一组分叫琼脂糖，它不含有带电基团，
其结构是有β-D-吡喃半乳糖和3，6脱水-L-吡喃半乳 糖相结合的链状多糖。
这种琼脂糖被用来进行凝胶层析，它既具有琼脂凝 胶相同的分离区间，又没有吸附作用。但其稳定性
远不如葡聚糖凝胶和生物胶P，强酸强碱能引起结构
破坏。最好使用条件控制在pH 4～9之间，温度0～ 40℃，超出此范围,可能被破坏。
（3）分离条件缓和。
（4）应用广泛。 （5）分辨率不高，分离操作较慢。
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第二节 凝胶的结构和性质
一、葡聚糖凝胶 (Sephadex) 二、修饰葡聚糖凝胶 (Modified Sephadex) 三、聚丙烯酰胺凝胶 （Bio-Gel P） 四、琼脂糖类凝胶 （Sepharose ） 五、多孔玻璃微球 (Bio-glas) 六、疏水性凝胶（hydrophobic gels）
分离的目的。
（一）平衡排除理论
当溶质层流过一个填料颗料这段距离时，溶 质分子已多次进出于填料的孔，达到平衡。
层析技术及原理
实际计算理论塔板数时，只要在层析图谱 上测出某组分的保留值和在一定纸速下相应的 峰宽，就可计算出在某一实验条件下的理论塔 板数的近似值，以衡量柱效。若要得到真正的 塔板数时，必需扣除未被固定相所占有的空间 死体积(如柱的接口、连接柱接口的管路体积) 和流动相为充满死体积时所需的时间，此时得 到的塔板数称为有效塔板数(neff)。故上述公 式可转化为：
层析中的常用术语
一、保留值(Retention Value)
保留值表示样品中各组分 在层析柱中停留时间的长短或 组分流出时所需流动相体积的 多少。它用来描述层析峰在层 析图上的位置(图3-1)
图3-1 A、B两组分的保留值 A保留值tR1’=tR1-tm B保留值tR2’=tR2-tm
二、层析峰区域宽度(Peak Width)
三.分离度(Rs)
指相邻两峰的保留差值是两峰宽平均值的几倍(图3-2)。
Rs tR 1 2
2
tR
1
(W 1 W 2 )
W1 W 2Rs Nhomakorabea tR W
若 Rs愈大，说明分离效果愈好。在实际分离过程中，各组分含量 不同，因而峰面积和峰宽在绝大多数情况下是不一致的，故一般用垂直 线法来计算。具体是连接两峰顶，再从两峰间的峰谷向基线作一垂线， f Rs g 此线和上述连线交于3处。从3到峰谷的距离为f，从3到基线距离为g (图 3-3)。
图3-2 Rs计算示意图
图3-3 垂直线法计算Rs示意图
若Rs=1，则组分定会分离；Rs<1，则组分部分分离；Rs=0，组分不能分离或分离极差。
四.分配系数
在层析分离过程中，物质既进入固定相，又进入流 动相，此过程称分配过程。无论哪一种层析法，在一定条 件下，物质在固定相和流动相达到平衡时，它在两相中平 均浓度的比值称分配系数(K)。 分配系数是由溶质的性质(分子大小、电荷、分子量等) 所决定的。不同的层析机制，其K值涵义不同。吸附层析 中，K值表示吸附平衡常数；分配层析中，表示分配系数； 离子交换层析中，表示交换常数；亲和层析中，表示亲和 常数。K值大表示其溶质在固定相中浓度大，在洗脱过程 中，溶质出现较晚。K值小表示其溶质在流动相中浓度大， 故在洗脱液中出现较早。 若两组分在同一条件下具有相似的K值，则表明两组 分层析峰重叠大，分离效果差。为达到分离目的，需重新 选择实验条件，包括层析方式和流动相的改变。
层析技术名词解释生物化学
层析技术名词解释生物化学
层析技术是一种分离、鉴定物质的技术，用于分离、鉴定和分析
生物分子的组成，以及它们之间的作用关系。
它将生物体的组成成分
分离出来，使得各成分可以进一步深入地分析和研究。
生物化学是一门研究生物体内的化学过程的多领域学科，它涉及
生物体中的活动物质，如氨基酸、蛋白质、核酸、糖类、脂类、核苷
酸和多糖等，以及这些物质之间的相互关系。
它也涉及分子生物学部分，以及生物体如何在环境条件变化时反应的机制。
层析技术在生物化学研究中具有重要意义。
它通过高效液相色谱法、液相色谱联用串联质谱法、质谱联用液相色谱法以及质谱联用质
谱法等技术，能够快速、准确地研究生物体内的活性物质，并分析其
相互关系。
该技术能够彻底检测出未知物质，可以解决复杂的生物化
学问题，为新药物开发提供可靠的理论和实验技术支持。
层析技术可以有效地揭示生物体中物质的细节，即物质在不同状
态和环境中的行为，还可以深入研究复杂生物体的构造、功能及活性，并发现物质间的相互作用。
此外，该技术也可以用于研究生物体内的
元素循环、营养的传递和调节、物质的识别及代谢过程等，从而确定
物质的作用机制，为治疗疾病提供有效的手段。
总之，层析技术是一种重要的研究生物化学的技术，能够深入研
究生物体组成的构造、功能及活性，及其之间的相互作用，为药物开
发及治疗疾病提供方法和技术支持，是生命科学研究的重要工具。
层析技术电泳技术
⑤亲和层析
亲和层析是利用待分离的生物大分 子和它的特异性配体间具有的特异亲和 力，使之与杂质成分分离的一类特殊层 析技术。
具有专一亲和力的“生物分子对”主要有： 抗原和抗体；酶和底物或辅酶或抑制剂；激素和受 体；RNA和其互补的DNA、糖蛋白-植物凝集素等。
磺酸基（强酸型） 羧基、酚羟基（弱酸型） 阴树脂引入碱性基团（带正电荷） 季铵基（强碱型） 氨基、仲胺基、叔胺基（弱碱型）
层析的基本原理： 各组分有性质差异——分配系数 不同——在层析系统中移动速度 不同——由此而分离。
各组分的性质差异包括理化性质及生 物学性质：（如溶解度、吸附力、分 子形状及大小、立体化学性质、荷电 特性、特异的生物学亲和力等）
层析法是通过分离而实现分析。 既可以定性分析，也可以定量分析。
根据层析峰的位置及峰高或峰面 积，可以定性及定量。
③离子交换层析
以离子交换剂为固定相，根据物质的 带电性质及带电量不同而与固定相的静电 作用力差异，以电解质溶液为流动相，通 过离子置换实现对目标物质的分离。
④凝胶过滤层析
以具有网状结构的凝胶颗粒作为固定相， 根据筛分原理（反筛），利用物质的分子大 小差异进行分离的技术。也叫分子筛层析、 排阻层析。
◈保留时间(retention time，tR) 从进样开始到某个组分在柱后出现
浓度最大值的时间。
◈保留体积(retention volume，VR) 从进样开始到某组分在柱后出现浓
度最大值时流出溶剂的体积。又称洗脱 体积。
◈死时间
不被固定相滞留的组分，从进样至出 现浓度最大值时所需的时间称为死时间 (dead time，tM ) 。 ◈死体积
层析技术
3 5 5 5
4905(50) 3434(35) 1472(15) 981(10)
凝胶层析的基本操作
1．层析柱的选择 层析柱大小主要是根据样品量的多少以及对分辨率的要求来 进行选择。 一般来讲，主要是层析柱的长度对分辨率影响较大，长的层 析柱分辨率要比短的高；但层析柱长度不能过长，否则会引起 柱子不均一、流速过慢等实验上的一些困难。 层析柱的直径和长度比一般在1：25～1：100之间。 用于分组分离的凝胶柱，如脱盐柱由于对分辨率要求较低，所 以一般比较短。
掉，以免污染凝胶柱。样品的黏度不能过大，否则会影响
分离效果。
5.洗脱速度
洗脱速度也会影响凝胶层析的分离效果，一般洗脱速 度要恒定而且合适。 保持洗脱速度恒定通常有两种方法，一种是使用恒流 泵，另一种是恒压重力洗脱。 洗脱速度取决于很多因素，包括柱长、凝胶种类、颗 粒大小等，一般来讲，洗脱速度慢一些样品可以与凝胶基 质充分平衡，分离效果好。 但洗脱速度过慢会造成样品扩散。 一般凝胶的流速是2～10 ml／h，市售的凝胶一般会提 供一个建议流速，可供参考。
2.装柱
1）除去气泡的溶胀凝胶应与层析柱操作温度一致， 装柱过程中温度也要恒定。 2）应调节有利于装柱的凝胶浆稀稠度，适当稀释有 利于装柱过程中气泡的排除。 3）将柱子固定在稳定的支架上，并保证其垂直。 4）先向柱内加满洗脱剂，检查是否漏水；再打开出 液口，排出里面的气泡，特别是要捧除床底支持物 上的气泡。关闭出液口，使柱中洗脱剂的体积约占 总柱体积的15％（保持柱内湿润）。
4.加样量
加样量对实验结果也可能造成较大的影响，加 样过多，会造成洗脱峰的重叠，影响分离效果； 加样过少，提纯后各组分量少、浓度较低，实验 效率低。 加样量的多少要根据具体的实验要求而定：凝 胶柱较大，当然加样量就可以较大；样品中各组 分相对分子质量差异较大，加样量也可以较大。 注意：要尽量快速、均匀。
层析(包括：吸附层析、分配层析、离子交换层析、亲和层析等)
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3、按操作形式不同分类
柱层析法
名称
薄层层析法
纸层析法 薄膜层析法
操作形式
固定相装于柱内，使样品沿着一个 方向前移而达分离
将适当粘度的固定相均匀涂铺在薄 板上，点样后用流动相展开，使各 组份分离 用滤纸作液体的载体，点样后用流 动相展开，使各组份分离
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分配系数与迁移率的关系
❖ K值大，就表明该组分与固定相结合力大，迁移率小； 反之则结合力小，迁移率大
❖ K增加，Rf减少；反之，会减少，Rf增加 ❖ 不同物质的分配系数或迁移率是不同的。分配系数
或迁移率的差异程度是决定几种物质采用层析方法能 否分 离的先决条件。其差异越大，分离效果越理想。
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几个概念：
外水体积、内水体积、基质体积、柱床体积 、洗脱体积
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对某物质在凝胶柱 内洗脱体积Ve、Vo和 Vi之间的关系可用下 式表示：
Ve＝Vo＋Kd.Vi
可改写为：
（Ve-Vo） Kd = －－－－
Vi
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当Kd＝0时，Ve=Vo，说明这种溶质相对分子质量大，完 全不能进入凝胶颗粒微孔内，被排阻于凝胶颗粒之外而最先 洗脱下来；
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分配系数（distribution coefficient）
分配系数是指在一定的条件下（如温度、压力） ，某种组分在固定相和流动相中含量（浓度）的 比值，分配系数是层析中分离纯化物质的主要依 据，常用K来表示
K cs cm
Cs: 溶质在固定相中的浓度，Cm:溶质在流动相中的浓度
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❖ K值大表示其溶质在固定相中浓度大 ，
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琼脂糖凝胶（Sepharose）
层析技术简单介绍及其应用
层析法的主要介绍及其应用1.层析法的概念[1]．色层法或层离法（Chromatography层析法又称色谱法），是一种应用很广的分离分析方法。
1903年，俄国的植物学家M，C．UBeT在研究分离植物色素过程中，首先创造了色谱法，这是一种根据化合物的不同结构和不同的物理，化学特性，从而具有不同吸附性能的原理，以分离混合物中的化学成分的一种物理化学分离方法，最初用于有色物质，之后应用于大量的无色物质。
色谱法的名称虽然仍然沿用，但已失去原来的含义。
层析法和其他分离方法比较，具有分离效率高，操作又不太麻烦的优点。
因此，层析法的应用越来越广，对于近代化学科学的发展有巨大的影响。
在制药、化工、农业、医学等方面都有着广泛的应用。
2.层析法的历史及原理层析法的历史1903年3月21日俄国植物学家茨维特（Michael Tswett，1872-1919）在华沙自然科学学会生物学会议上发表了“一种新型吸附现象及其在生化分析上的应用”研究论文，介绍了一种应用吸附原理分离植物色素的新方法，并首先认识到这种层析现象在分离分析方面有重大价值。
1906年他在德国植物学杂志发表文章，首次命名上述分离后色带为色谱图，称此方法为色谱法（Chromatography）。
1907年在德国生物学会年会上，展示过带有色带的分离柱管和纯化过的植物色素溶液。
茨维特被世人公认为色谱创始人。
德籍奥地利化学家R.Kuhn 等利用他的方法在纤维状氧化铝和碳酸钙的吸附柱上将过去一个世纪以来公认为单一的结晶状胡萝卜素分离成a 和b 两个同分异构体，并由所取得的纯胡萝卜素确定出了其分子式。
Kuhn正是由于在维生素和胡萝卜素的离析与结构分析中取得了重大研究成果而获得了1938年诺贝尔化学奖.1952年，Martin和James发表第一篇气液色谱论文，首次用气体作流动相，配合微量酸碱滴定，发明了气相色谱，它给挥发性化合物的分离测定带来了划时代的革命。
2.2层析法的原理层析Chromatography(色谱),利用混合物中各组分的物理化学性质间的差异(溶解度、分子极性、分子大小、分子形状、吸附能力、分子亲合力等) ，使各组分在支持物上集中分布在不同区域，借此将各组分分离。
生物工程下游技术第七章_生物大分子的色谱分离和纯化
有关，塔板数越多，柱效能越高。
色谱柱的塔板数可以用理论塔板数和有效
塔板数来表示。
1．理论塔板数n：
tR 2 n 5.54( ) 16( ) Y1/ 2 Y
2
tR
式中：tR为某组分的保留时间；
Y1/2为某组分色谱峰的半宽度； Y为色谱峰的峰底宽度。
由式可见，柱子的理论塔板数与峰宽和保留时间
有关。保留时间越长，峰越窄，理论塔板数就越
描述色谱柱中组分在两相间的分配状况及评 价色谱柱的分离效能的一种半经验式的理论 。塔板理论将一根色谱柱当作一个由许
多塔板组成的精馏塔，用塔板概念来描
述组分在柱中的分配行为。该 理论成功
地解释了色谱流出曲线呈正态分布。
（一）塔板理论假定：
1）塔板之间不连续； 2）塔板之间无分子扩散； 3）组分在各塔板内两相间的分配瞬间达至平衡， 达一次平衡所需柱长为理论塔板高度H； 4）某组分在所有塔板上的分配系数相同； 5）流动相以不连续方式加入，即以一个一个的塔 板体积加入。
在色谱分析中，尤其是GC中广泛用于定性的依据！
h. 色谱峰的高度、宽度及面积：
标准偏差：峰高0.607 倍处峰宽度的一半。
半峰宽Y1/2：峰高一半处的峰宽。Y1/2=2.355
峰底宽Y：色谱峰两侧拐点上切线与基线的交点间
的距离。Y= 4
峰面积A：色谱定量的依据。A=1.065hY1/2
,[A=1.065h(Y0.15+Y0.85)/2]。
Vr' ：某组份的保留体积扣 f. 调整保留体积 除死体积后的体积。
V Vr V0 t Fco
' r ' r
g. 相对保留值2,1或i,s ：组份2的调整保留值 与组份1的调整保留值之比。
层析技术基本原理及应用
层析技术（Chromatography）是一种用于分离混合物中不同成分的重要方法，广泛应用于化学、生物化学、药学等领域。
以下是层析技术的基本原理及应用：
基本原理：
1. 分离原理：
-层析技术利用不同物质在固定相（stationary phase）和移动相（mobile phase）之间的分配系数不同来实现分离。
-样品在固相上受到吸附力和解吸力的影响，在移动相的推动下，不同组分以不同速度迁移，最终实现分离。
2. 类型：
-按照相对位置可分为吸附层析、分配层析、离子交换层析等。
-常见的层析技术包括气相色谱、液相色谱、离子色谱、薄层色谱等。
应用领域：
1. 生物化学：
-在蛋白质纯化、药物筛选、基因分析等方面广泛应用。
-用于分离和鉴定生物样品中的蛋白质、氨基酸、核酸等生物分子。
2. 制药工业：
-用于药物分析、药物提取和纯化等环节。
-常用于药物配方中主成分和杂质的分离和检测。
3. 环境监测：
-用于水质、大气、土壤等环境样品中有害物质的检测与分析。
-能够帮助监测环境中的污染物并进行有效处理。
4. 食品安全：
-在食品中添加剂、残留农药、重金属等的检测和分析中发挥作用。
-有助于确保食品安全和合规。
总的来说，层析技术通过精密的分离原理和操作流程，可以对复杂混合物进行高效分离和分析，为科学研究和工业生产提供了重要的技术支持。
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层析技术
生物化学与分子生物学教研室
徐宏伟
目录
层析法也称色谱法(chromatography)，是1906 年俄国植物学家Michael Tswett发现并命名的。他 将植物叶子的色素通过装填有吸附剂的柱子，各 种色素以不同的速率流动后形成不同的色带而被 分开，由此得名为“色谱法”。
1941年，英国生物学家Martin和Synge首先提 出了色谱塔板理论，为后来各种色谱技术的发展 奠定了基础。
(六)洗脱 注意控制流速 降低流速通常能提高分辨率 流速过慢，则纵向扩散和对流反会限制分辨率的 提高
流出液用人工或自动部分收集器定量地分部收集 (七)保存 加防腐剂或灭菌后，可置冰箱中保存数月
目录
四、凝胶过滤层析的应用
1、主要用于大分子物质：如蛋白质、核酸、
多糖等的分离
目录
层析法最基本的特征是有一个固定相和一个 流动相，当两相作相对运动时，由于混合物 中各组分在物理化学性质 (如吸附力、溶解
度、分子的形状与大小、分子的电荷性及亲
和力等)上的差别，使各组分在两相间进行
反复多次的分配而得到分离。
目录
目录
层析类别
吸附层析
主要依据的理化性质
吸附力
此类的层析方法举例
多孔性亲水性凝胶 一是随洗脱液垂直向下移动
二是无定向的扩散运动。
凝胶颗粒内部具有多孔网状结构，被分离的混合物流过层
析柱时，比凝胶孔径大的分子不能进入凝胶孔内，在凝胶
颗粒之间的空隙向下移动，并最先被洗脱出来；比网孔小 的分子能不同程度的自由出入凝胶孔内外，在柱内经过的 路程较长移动速度较慢，最后被洗脱出来。
↓ ↓
五、注意事项
(一) 柱床支持物使用不当
(二) 凝胶膨胀过程中操作不当
(三) 凝胶柱、毛细管和流出口处有气泡
(四) 工作压过高
(五) 层析柱的保洁差
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第二节 离子交换层析技术
离子交换层析(ion-exchange chromatography)
是根据物质所带电荷的差别进行分离纯化的一种
集及组分鉴定
加样
离子交换剂的清洗、 再生和保存
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↓
三、离子交换层析的实验技术
（一）离子交换剂的选择与处理
有阴阳离子之分外，还有强弱之分
应根据被分离物质的物理化学性质，即根据其
所带电荷的种类、数量及所处的环境，尤其是
环境中是否有其它离子，这些离子的电性、数
量等因素进行选择。
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对吸附性强的离子或不稳定的物质，常选用弱 酸性或弱碱性离子交换树脂，这样易于洗脱和
柱L/D值的选择 用于分组分离 短而粗 L/D值＜10 用于分级分离 L/D值比较大 对很难分离的组分一般需要100cm
左右长的层析柱，其直径在1～5cm范围内，小于1cm产 生管壁效应，大于5cm则稀释现象严重。
目录
装柱前，凝胶基质用蒸馏水或洗脱液中充分溶胀。
凝胶柱填装后通常可以采用一种有色的物质，如蓝 色葡聚糖-2000、血红蛋白等上柱，以检测凝胶柱的 均匀程度。
离心或过滤，去除溶胀的凝胶
↓
浓缩的高分子溶液
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5、蛋白质复性研究
高浓度变性剂 存在，蛋白呈 无规则卷曲 变性蛋白加入凝胶柱
变性蛋白体积大，只 能进入颗粒间隙，迁 移速度快 缓冲液洗脱蛋白
变性剂分子量小， 进入颗粒内部，迁 移速度慢
变性剂浓度降低，转成复性缓冲液 变性蛋白复性，以天然形态洗脱出柱
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分配系数(kd)
Ve为某一被分离成分被洗脱时所用洗脱液的体积，称为洗脱体积； Vo为凝胶颗粒间自由空间的总容积，称为空白体积或外水体积；
Vi为凝胶颗粒内部孔穴的总容积，称为内水体积或进人体积。
目录
体积参数
分子在柱中移动的速度取决于该分子在固定相和流
动相间的分配系数Kd，Kd表示某一分子在特定的凝胶柱内
目录
离子交换剂的基质
离子交换 纤维素
离子交换 交联葡聚糖
琼脂糖 离子交换剂
聚苯乙烯
目录
二、常用离子交换剂的种类及其性质
1、离子交换纤维素树脂 以纤维素为母体，结合一定的离子基团而成。 离子交换纤维素上的交换基团排列疏散，对蛋 白质等大分子的吸附不太牢固，用温和的条件 便可将其洗脱下来，因此不会引起大分子变性， 是分离蛋白质、核酸、抗生素等不太稳定的生 化物质的理想介质。
实验室常用Vt－Vo代替Vi来计算分配系数， 所得值称为平均分配系数，用Kav表示，其定义为
对于某一特定的凝胶柱，Kav与kd之比是1个常数， 它不随溶质的性质或浓度而改变，因此可代替kd来度量被分离物的洗脱行为。
目录
影响分离效果的因素
流速
加样体积 样品浓度
离子强度
目录
二、常用凝胶的种类和性质
2、脱盐 ，放射性同位素，荧光素
3、蛋白质的分子量的测定
离心柱层析法 ：分子克隆
目录
3、测定高分子物质的分子量
测大于所用载体上 限分子的洗脱体积 标定凝胶过 滤柱的Vo
蓝色葡聚糖
↓
测小于下限的分子的 洗脱体积 标定凝胶过滤 柱的Vi
氨基酸、有色盐类
↓ ↓
测定一系列已知 分子量的标淮样 品在柱上的洗脱 体积Ve
再生，也不易破坏被分离物质
对于吸附性弱的离子，常选用强酸性或强碱性 离子交换树脂，这样可利用碱性或酸性条件增 强被吸附物的离子化作用。
目录
分离蛋白质时
若在高于其等电点的pH条件下不发生变性，则可 选用阴离子交换剂；
若在低于其等电点的pH条件下，不发生变性，则 可选用阳离子交换剂；
如果某蛋白质在高于或低于其等电点1个pH单位的 条件下都很稳定，则选用两种离子交换剂中的任何 一种均可达到分离目的。
的洗脱行为。
Kd＝(Ve一Vo)／Vi
Ve Vo Vi
洗脱体积 外水体积 内水体积
目录
目录
洗脱行为可以有三种可能的情况:
Ve=Vo 该成分的分子全部被排阻在凝胶颗粒的间隙中， 因而洗脱速度最快。即该成分的Kd＝0。
Vi＝Ve-Vo 该成分不被排阻而可完成进入凝胶颗粒内部,
因而洗脱速度最慢。即该成分的Kd=l。
细粒 ：洗脱曲线峰形对称、峡窄、分离度好 超细颗粒 ：能给予最好分离，但流速慢，实验 时间长
目录
(二) 层析柱的选择 柱子要直，内径均一；下端死区小 柱的有效长度越大，洗脱峰之间的距离则越宽， 分辨率越高。
过细的柱子，会因管壁效应而影响分离效果
目录
柱层析的L/d比值
目录
2、凝胶柱的制备
目录
三、凝胶过滤层析的实验技术
(一) 凝胶的选择与处理
根据被分离物质分子的大小、形状和分离目的进行选择 1.分离分子量相差悬殊的两种物质，如蛋白质脱盐 2.纯化蛋白质时，则需要根据各组分的分子量分布范围及各
种凝胶的分离范围选用合适的凝胶
目录
粗粒 ，中粒 ：分离效果差，但流速快 ，可用 于工业上物质的制备
与不同类型离子交换剂以不同的亲和力相互交换吸附。
当缓冲液中的离子基团与结合在交换剂上的蛋白质相竞争时
亲和力小的蛋白质分子首先被解吸而洗脱
亲和力大的蛋白质则后被解吸与洗脱 因此，依靠增加缓冲液的离子强度和/或改变酸碱度，可改变 蛋白质的吸附状况，使不同亲和力的蛋白质得以分离。
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ目录
目录
（3）对于能部分扩散入凝胶颗粒内部的大分子物质，Kd在0～ 1之间
（4）凡Kd＞1的物质，表明它们能被凝胶吸附或具有离子交换作用，而
不仅仅是分子筛效应
（5）Kd值越接近1，表明分子越小，洗脱越慢；相反，Kd值越接近0，表 明分子越大，洗脱越快。
目录
柱床体积 (Vt) 为凝胶基架的总体积 (Vr) 与内水体积 (Vi) 及外水体积 (Vo) 之和。
利用某些化学惰性的多孔网状结构的物质(多
为凝胶)为填料，使混合物中的各种物质按其
分子大小不同得到分离。
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优点：凝胶属于惰性载体，不带电荷，吸附力弱，操作条
件比较温和，温度范围广，不需要有机溶剂，分离效果好
缺点：样品被不断稀释，上样量不能太大，否则分辨率变
差
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一、凝胶过滤层析的基本原理
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常用：DEAE-纤维素（二乙基氨基纤维素） CM-纤维素（羧甲基纤维素）
优点：
开放性长链和松散的网状结构，有较大的表面积，大 分子可自由通过，使它的实际交换容量要比离子交换树 脂大的多。 亲水性，对蛋白质等生物大分子物质吸附的不太牢， 用较温和的洗脱条件就可达到分离的目的，因此不致引 起生物大分子物质的变性和失活。 回收率高
立体多孔网状结构，惰性
对pH和温度的稳定性
能反复使用
颗粒大小比较均匀
葡聚糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶及琼脂糖凝胶。
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凝胶过滤层析的介质
葡聚糖系列 琼脂糖系列 聚丙烯酰胺系列 多孔硅胶
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基本操作
凝胶的选择 凝胶柱的制备 上样 洗脱 凝胶柱的重复 使用与保存
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2、离子交换葡聚糖凝胶
葡聚糖凝胶为母体，结合一定的离子基团而成
交换容量大，一般为离子交换纤维素的3-5倍
由于其是网状结构，因而其不仅具有离子交换 能力，还同时兼有分子筛的作用。