基因诊断(ppt)
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第五章基因组测序技术(共118张PPT)
从下到上依次读出DNA 片段的核苷酸序列
断裂产物分 别在4个泳 道电泳
G G+A T+C C
化学法测序实例
哌啶
改进的特异化学切割反应
1.基本原理
与链终止法测序原理相同,只是用不同 的荧光色彩标记ddNTP,如ddATP标记红 色荧光,ddCTP标记蓝色荧光, ddGTP标 记黄色荧光, ddTTP标记绿色荧光.由于 每种ddNTP带有各自特定的荧光颜色,而 简化为由1个泳道同时判读4种碱基.
②该酶能够用2‘，3’--双脱氧核苷三磷酸作底物并将 其聚合到新生寡核苷酸链的3‘-末端，从而终止其延 伸反应。
在DNA测序反应中，加入模板DNA，引物（特异 性引物），DNA聚合酶，dA，dT，dG，dC和一 种ddNTP。常用Klenow大片段，无5'→3'外切酶 活性。
制备单链模板
A 克隆于质粒中DNA→用碱或热变性 B M13克隆单链DNA C 噬粒克隆DNA D PCR产生单链DNA
C 参考人类基因组图,特别是大量的STS位标作为基点,进行
序列组装，排成重叠克隆群.
基于克隆群(contig-based)
鸟枪法策略
指导测序策略
遗传、物理图谱
人们对感兴趣的基因或与疾病相关的 基因优先测序.
如:人类主要组织相容性复合区位于第6号 染色体,与人类免疫系统有关，因而优先 测序.
EST是一种重要的基因组图分子标记,以EST为探针很 容易从 cDNA中筛选全基因,又可从BAC克隆中找到其
2. 人类基因组草图的完成
2000年6月26日是人类 上值得纪念的一天。人 类基因组的工作草图已 经绘制完毕并于这天向 全世界公布。最终完成 图要求测序所用的克隆 能忠实地代表常染色体 的基因组结构，序列错 误率低于万分之一。
断裂产物分 别在4个泳 道电泳
G G+A T+C C
化学法测序实例
哌啶
改进的特异化学切割反应
1.基本原理
与链终止法测序原理相同,只是用不同 的荧光色彩标记ddNTP,如ddATP标记红 色荧光,ddCTP标记蓝色荧光, ddGTP标 记黄色荧光, ddTTP标记绿色荧光.由于 每种ddNTP带有各自特定的荧光颜色,而 简化为由1个泳道同时判读4种碱基.
②该酶能够用2‘，3’--双脱氧核苷三磷酸作底物并将 其聚合到新生寡核苷酸链的3‘-末端，从而终止其延 伸反应。
在DNA测序反应中，加入模板DNA，引物（特异 性引物），DNA聚合酶，dA，dT，dG，dC和一 种ddNTP。常用Klenow大片段，无5'→3'外切酶 活性。
制备单链模板
A 克隆于质粒中DNA→用碱或热变性 B M13克隆单链DNA C 噬粒克隆DNA D PCR产生单链DNA
C 参考人类基因组图,特别是大量的STS位标作为基点,进行
序列组装，排成重叠克隆群.
基于克隆群(contig-based)
鸟枪法策略
指导测序策略
遗传、物理图谱
人们对感兴趣的基因或与疾病相关的 基因优先测序.
如:人类主要组织相容性复合区位于第6号 染色体,与人类免疫系统有关，因而优先 测序.
EST是一种重要的基因组图分子标记,以EST为探针很 容易从 cDNA中筛选全基因,又可从BAC克隆中找到其
2. 人类基因组草图的完成
2000年6月26日是人类 上值得纪念的一天。人 类基因组的工作草图已 经绘制完毕并于这天向 全世界公布。最终完成 图要求测序所用的克隆 能忠实地代表常染色体 的基因组结构，序列错 误率低于万分之一。
第8章_第1节_基因诊断(3_LMJ)
(allele-specific oligonucleotide hybridization, ASOH)
4.DNA 芯片(DNA chip)技术
15:49:32
6
1.斑点印迹(dot blotting)杂交
方法： 将核酸(DNA或RNA)样品点在NC膜上，变性 后与标记探针结合，显影或显色，密度测
(6)等位基因特异性PCR(AS-PCR)
针对等位基因的序列差异区域设计引物，使 引物的 3’端与等位基因序列的差异碱基对应， 仅能与突变型或野生型互补。
以DNA分子为模板，加入与拟扩增DNA片段两 端分别互补的一对寡核苷酸链作为引物，在 DNA 聚合酶的催化下，按照半保留复制的形式分别合 成两股新的DNA互补链，可使两引物间的DNA片段 拷贝数增加一倍。
多次重复这一过程，可使这段 DNA拷贝数随 复制次数以指数形式扩增。
15:49:32
16
2. 基因诊断中常用的PCR及其衍生技术
（4）早期诊断：易在疾病尚无临床表现时作出诊断； （5）应用广泛：可检测自体基因和外源基因。
15:49:32
4
二、基因诊断的主要技术方法
(一)核酸分子杂交（NA hybridiza单链构象多态性分析（SSCP）
(四)DNA分子多态性（DNA polymorphism）分析 (五)限制性片段长度多态性（RFLP）分析 (六)显微切割（microdissection）技术 (七)DNA序列测定（DNA sequencing）
DNA微阵列 (DNA microarray)——通过计 算机控制点样和图像扫描的高密度集成探 针的杂交技术。
应用： 单核苷酸多态性(SNP)、基因表达谱和遗传 性疾病的分析；病原微生物的大规模检测。
4.DNA 芯片(DNA chip)技术
15:49:32
6
1.斑点印迹(dot blotting)杂交
方法： 将核酸(DNA或RNA)样品点在NC膜上，变性 后与标记探针结合，显影或显色，密度测
(6)等位基因特异性PCR(AS-PCR)
针对等位基因的序列差异区域设计引物，使 引物的 3’端与等位基因序列的差异碱基对应， 仅能与突变型或野生型互补。
以DNA分子为模板，加入与拟扩增DNA片段两 端分别互补的一对寡核苷酸链作为引物，在 DNA 聚合酶的催化下，按照半保留复制的形式分别合 成两股新的DNA互补链，可使两引物间的DNA片段 拷贝数增加一倍。
多次重复这一过程，可使这段 DNA拷贝数随 复制次数以指数形式扩增。
15:49:32
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2. 基因诊断中常用的PCR及其衍生技术
（4）早期诊断：易在疾病尚无临床表现时作出诊断； （5）应用广泛：可检测自体基因和外源基因。
15:49:32
4
二、基因诊断的主要技术方法
(一)核酸分子杂交（NA hybridiza单链构象多态性分析（SSCP）
(四)DNA分子多态性（DNA polymorphism）分析 (五)限制性片段长度多态性（RFLP）分析 (六)显微切割（microdissection）技术 (七)DNA序列测定（DNA sequencing）
DNA微阵列 (DNA microarray)——通过计 算机控制点样和图像扫描的高密度集成探 针的杂交技术。
应用： 单核苷酸多态性(SNP)、基因表达谱和遗传 性疾病的分析；病原微生物的大规模检测。
临床遗传学PPT课件
分析酶变型的方法：电泳速率、酶动力学、指纹分析和 免疫反应
分析蛋白质变型的方法：电泳、肽链和氨基酸顺序分析 测定中间代谢产物
苯丙酮尿症 PKU
酶活性检查
PAH
血液滤片法 Guthrie test
FeCl3显色反应
苯丙氨酸
苯丙酮酸
肝脏 血
尿 绿色
上海：1981～1987年对284,396名新生儿进行PKU筛查， 查出PKU患儿15名，高苯丙氨酸血症4名。
➢对中期染色体或间期核的DNA进行荧光原位杂交检测可完成非 整倍体的检测。 ➢进行中期染色体荧光原位杂交还可检测染色体微小缺失、插入、 易位、倒位或扩增等结构异常。 DAPI、喹吖因、PI用于染色体着色显示红色 AMCA、FITC、Bidopy标记探针显示绿色 罗丹明、Texas red标记探针显示红色
片段，99bp片段是来自母亲而成为携带者。 3）Ⅲ1为99bp片段
如果是 男性 为患者（99bp片段来自母亲）；女性为携带 者（来自父母双方）
4）PCR产物变性梯度凝胶电泳（DGGE）
➢ 条件：尿素甲酰胺浓度梯度，恒温水浴（＞30℃）
➢ 过程：DNA逐渐由低强度进入高强度，解离温度较低 的DNA片段先达到其解离强度（变性梯度）解离 成局部单链，泳动减慢，通过溴化乙啶或银染观 测区带的变化。
和传统的诊断方法主要差异在于直接从基因型推断表型， 即可以越过产物（酶和蛋白质）直接检测基因结构而作出 诊断，这就改变了传统的表型诊断方式,故基又称为逆向诊 断（reverse diagnosis）。
➢ 特点：针对性强、特异性高、灵敏度高、适应性强
基因诊断两个必要的条件
一．特异的基因探针． 二．基因组DNA
HbS 镰型细胞贫血
正常人 Mst II
分析蛋白质变型的方法：电泳、肽链和氨基酸顺序分析 测定中间代谢产物
苯丙酮尿症 PKU
酶活性检查
PAH
血液滤片法 Guthrie test
FeCl3显色反应
苯丙氨酸
苯丙酮酸
肝脏 血
尿 绿色
上海：1981～1987年对284,396名新生儿进行PKU筛查， 查出PKU患儿15名，高苯丙氨酸血症4名。
➢对中期染色体或间期核的DNA进行荧光原位杂交检测可完成非 整倍体的检测。 ➢进行中期染色体荧光原位杂交还可检测染色体微小缺失、插入、 易位、倒位或扩增等结构异常。 DAPI、喹吖因、PI用于染色体着色显示红色 AMCA、FITC、Bidopy标记探针显示绿色 罗丹明、Texas red标记探针显示红色
片段，99bp片段是来自母亲而成为携带者。 3）Ⅲ1为99bp片段
如果是 男性 为患者（99bp片段来自母亲）；女性为携带 者（来自父母双方）
4）PCR产物变性梯度凝胶电泳（DGGE）
➢ 条件：尿素甲酰胺浓度梯度，恒温水浴（＞30℃）
➢ 过程：DNA逐渐由低强度进入高强度，解离温度较低 的DNA片段先达到其解离强度（变性梯度）解离 成局部单链，泳动减慢，通过溴化乙啶或银染观 测区带的变化。
和传统的诊断方法主要差异在于直接从基因型推断表型， 即可以越过产物（酶和蛋白质）直接检测基因结构而作出 诊断，这就改变了传统的表型诊断方式,故基又称为逆向诊 断（reverse diagnosis）。
➢ 特点：针对性强、特异性高、灵敏度高、适应性强
基因诊断两个必要的条件
一．特异的基因探针． 二．基因组DNA
HbS 镰型细胞贫血
正常人 Mst II
地中海贫血筛查及基因示意图精选幻灯片
地中海贫血
特点
地域性疾病 溶血性疾病 遗传性疾病
热带、亚热带-丛林地区-沿海洋地带：蚊虫、疟疾。
突变的地贫基携因带者红细胞能抵御疟原虫的侵袭
ppt课件.
3
中国南方人群地贫基因携带率
地区
广西 广东 海南 云南 贵州 江西
地贫
17.6 8.5 12.7 9.8 4.2 ６.2
携带率(%) β地贫
--/αα
中间型
- -/ α α
- - αα -- αα
轻型
-α/αα
中间型
--/αα
-α αα -- αα
--/αα
αα/αα （25%）
正常
--/--
--/αα （25%）
中间型
-α/αα （25%） 轻型
--/αα （25%）
中间型
-α --
αα/αα （25%）
正常
中间型
--/αα
-- αα -- -α
--/αα -α/αα
（25%） （25%）
中间型
轻型
-- --
-α/-α
（25%） 中间型
β-地中海贫血
β地中海贫血
β地中海贫血是由于β珠蛋白基因缺陷所致β 珠蛋白合成障碍
（主要是基因点突变，少数是基因片段缺失）
β
11号染色体
β-地中海贫血基因型
β-地中海贫血基因位于第11号染色体上（2条单体
β+/ β
重型
（纯合子）
β0/β
（25%） 轻型
β0 / β
β /β
（25%） （25%）
轻型
正常
表现
轻型 （β+ / β）无症状，轻度贫血，肝脾不肿大。 中间型（β+ / β+）幼童期后，肝脾肿大，轻度黄疸，地贫面容。 重型（ β0 / β0、β + / β0）地贫面容，重度贫血，必须输血维持生命。
特点
地域性疾病 溶血性疾病 遗传性疾病
热带、亚热带-丛林地区-沿海洋地带：蚊虫、疟疾。
突变的地贫基携因带者红细胞能抵御疟原虫的侵袭
ppt课件.
3
中国南方人群地贫基因携带率
地区
广西 广东 海南 云南 贵州 江西
地贫
17.6 8.5 12.7 9.8 4.2 ６.2
携带率(%) β地贫
--/αα
中间型
- -/ α α
- - αα -- αα
轻型
-α/αα
中间型
--/αα
-α αα -- αα
--/αα
αα/αα （25%）
正常
--/--
--/αα （25%）
中间型
-α/αα （25%） 轻型
--/αα （25%）
中间型
-α --
αα/αα （25%）
正常
中间型
--/αα
-- αα -- -α
--/αα -α/αα
（25%） （25%）
中间型
轻型
-- --
-α/-α
（25%） 中间型
β-地中海贫血
β地中海贫血
β地中海贫血是由于β珠蛋白基因缺陷所致β 珠蛋白合成障碍
（主要是基因点突变，少数是基因片段缺失）
β
11号染色体
β-地中海贫血基因型
β-地中海贫血基因位于第11号染色体上（2条单体
β+/ β
重型
（纯合子）
β0/β
（25%） 轻型
β0 / β
β /β
（25%） （25%）
轻型
正常
表现
轻型 （β+ / β）无症状，轻度贫血，肝脾不肿大。 中间型（β+ / β+）幼童期后，肝脾肿大，轻度黄疸，地贫面容。 重型（ β0 / β0、β + / β0）地贫面容，重度贫血，必须输血维持生命。
医学分子生物学 第三部分 基因诊断和基因治疗 共66页
第三部分 基因诊断与基因治疗
1
第一节 基因诊断
一、基因诊断的概念 基因诊断：它是以DNA和RNA为诊断材料，通过检
查基因（内源、外源）的存在、缺陷或表达异常， 对人的状态和疾病作出诊断的方法和过程。
2
基因诊断的特点
特异性强，可对患者作出诊断，可检测致病基因的 携带者，某些基因的易感者。
杂交技术和PCR技术具有放大效应，灵敏度高。
39
操作： 提DNA
多重PCR
电泳
分析
优点：STR分布于整个基因组中， 故可分析部分降解样品。 简单、方便。
40
2019年Lins对12个STR位点进行复合扩增， 个体匹配几率小于3.3×10-12。
目前已有13个STR位点，进行复合扩增。
STR-PCR技术在法医学的个人识别和亲子鉴 定中已逐步占主导地位。
45
（二）基因添加augmentation
• 一是针对特定的缺陷基因导入其相应的正常基 因，而细胞缺陷的基因并未除去,通过导入的 正常基因表达正常的产物，从而补偿缺陷基因 的功能。
• 二是向靶细胞中导入它本来不表达的基因或没 有的基因，利用其表达产物达到基因治疗的目 的。
46
（三）基因干预interference
（2）northern杂交
（3） dot blotting 斑点杂交 1981 Dot blot和Slot blot:将 DNA或RNA不经消化和电泳，变性后直接点样于NC膜或尼 龙膜上，用于基因组中特定基因及其表达的定性定量研究.
反向斑点杂交
4
Southern印迹杂交法 内切酶
1 2M
基因组DNA
17
A B C
D
A：CD17 (A→T)
1
第一节 基因诊断
一、基因诊断的概念 基因诊断：它是以DNA和RNA为诊断材料，通过检
查基因（内源、外源）的存在、缺陷或表达异常， 对人的状态和疾病作出诊断的方法和过程。
2
基因诊断的特点
特异性强，可对患者作出诊断，可检测致病基因的 携带者，某些基因的易感者。
杂交技术和PCR技术具有放大效应，灵敏度高。
39
操作： 提DNA
多重PCR
电泳
分析
优点：STR分布于整个基因组中， 故可分析部分降解样品。 简单、方便。
40
2019年Lins对12个STR位点进行复合扩增， 个体匹配几率小于3.3×10-12。
目前已有13个STR位点，进行复合扩增。
STR-PCR技术在法医学的个人识别和亲子鉴 定中已逐步占主导地位。
45
（二）基因添加augmentation
• 一是针对特定的缺陷基因导入其相应的正常基 因，而细胞缺陷的基因并未除去,通过导入的 正常基因表达正常的产物，从而补偿缺陷基因 的功能。
• 二是向靶细胞中导入它本来不表达的基因或没 有的基因，利用其表达产物达到基因治疗的目 的。
46
（三）基因干预interference
（2）northern杂交
（3） dot blotting 斑点杂交 1981 Dot blot和Slot blot:将 DNA或RNA不经消化和电泳，变性后直接点样于NC膜或尼 龙膜上，用于基因组中特定基因及其表达的定性定量研究.
反向斑点杂交
4
Southern印迹杂交法 内切酶
1 2M
基因组DNA
17
A B C
D
A：CD17 (A→T)
基因功能研究PPT课件
-
32
芯片特点
优点：
①微型化 ：平方厘米大小，实验所需试剂用量少
②高通量：一次检测数万个分子
③自动化
④标准化 ： 传统方法检测众多基因要经历多次实 验，因而每次实验之间是存在系统误差的。
缺点： 在同一温度下杂交，不同探针杂交效率不
同。
-
33
生物芯片的应用
① 基因表达水平的检测
② 基因诊断
③ 药物筛选
-
18
Northern的应用
检测样品中是否有基因的转录产物 及其含量。
-
19
3 检测基因的表达水平---Northern的应用实例
WT SBEIII OX
SBEIII
WT
SBEIII OX
-
20
三 种
分
子
杂
交 技
术
的
比
较
Southern
- Nor杂交(in situ hybridization)
-
29
芯片发展历史
Southern & Northern Blot
Dot Blot
Macroarray
Microarray
-
30
芯片种类
按固定分子：
基因芯片(Gene Chip) 蛋白质芯片(Protein Chip) 细胞（组织）芯片（Cell/tissue Chip）
-
31
根据用途
信息生物芯片（information-biochip）和功能生物 芯片（function-biochip）。
1979，Towbin，Western blotting：蛋白质印记
基因芯片
-
8
复性
肿瘤基因检测肿瘤早筛个性化用药PPT课件
结直肠癌筛查方法的创新变革
基因甲基化发生在大肠癌早期
《中国早期结直肠癌筛查及内镜诊治指南》专家共识
产品优势
产品优势
检测流程
适宜人群
肠癌甲基化报告
肺癌甲基化
中国癌症统计数据
中国肺癌不同分期的存活率
肺癌早期筛查的益处
肺癌早筛的技术途径
肺癌传统检测方法
肺结节与LDCT
欧洲对LDCT的担心
CTC的细胞学特点
稀有性
抗原异质 性
非典型形 态
• 每克肿瘤每日有大量肿瘤 • 蛋白表达具有不稳定性 • CTC入血后随血液快速流动
细胞脱落入血，但只有极 • 不同实体瘤来源CTC、 • 与其它细胞碰撞、受到血
少数存活
不同患者CTC表面抗原
管壁的挤压
• 每10mL血液中可能仅含
表达、分布存在差异化 • 受机体免疫系统以及药物
2015年中国癌症统计数据揭示，预计2015年有新发浸 润性癌病例数429.2万，相当于平均每天新发12000例 癌症，有281.4万癌症死亡病例，相当于平均每天7500 人死于癌症。
CA：A Cancer Journal for Clinicians ，Cancer Statistics in China, 2015
CTC临床应用方向 3、术后复发转移预测与监测 拟行手术的肿瘤患者 已行手术定期接受复查的患者
CTC临床应用方向 4、预后评估 需评估的肿瘤患者
CTC临床应用方向 5、疗效评估（耐药性监测）
行术前新辅助化疗的患者 根治性术后，行术后辅助化疗的患者 行放化疗、靶向治疗、生物治疗等的患者
肺癌甲基化报告解读
肺癌甲基化报告解读
临床建议
阴性结果：建议随访，每年进行一次肺癌早筛检测；
基因、遗传与优生伦理ppt课件
21
④应了解咨询者对于所患疾病的态度和心 理、对发病危险率的理解、文化程度等 相关情况；
⑤应了解咨询者家庭对于相关遗传疾病的 顾虑和态度，以及由此引发的家庭矛盾， 询问应注意语气和策略；
⑥要尊重咨询者的隐私权，相关信息要注 意保密，不得泄露，不得随意转移或发 表（公布）相关信息。
18
（4）保障当事人和家庭的隐私不受雇主、 保险商和学校的不公正侵害；
（5）告知当事人和家庭，相关的遗传信 息可能会被非当事的第三方所误用；
（6）告知当事人，他或她有道德义务去 告知其血亲的遗传风险；
（7）告知当事人，有必要将其携带者身 份透露给配偶/伴侣，尤其是他们决定 生育之前；并告知当事人，公开此事对 他们的婚姻所存在的伤害的可能性；
20
• 遗传咨询门诊还应注意： ①遗传咨询要有原始的、准确的、完整的
记录，以便长期保存（可采用计算机的 数据库方式）； ②相关病历资料应作复印或扫描备份，由 遗传咨询门诊专门保存； ③遗传家系谱应由专业的遗传咨询人员亲 自绘制，最好一次完成（必要时以后加 以补充），以加强与咨询者及其家属之 间的良好的医患信任关系，不可由辅助 人员完成；
明或确保其诊断结果不会因误差而造成？ ⑤被诊断为基因缺陷阳性的人如何得到法律保障，
使他们不受人寿保险、招聘单位和社会的歧视？
2
• 对于基因诊断中所存在的伦理问题应该采 取适当办法加以解决：
①从思想上正确认识基因诊断的意义； ②注重提高医务工作者的素质，提高诊断方
法的科学性与权威性； ③注意在基因诊断过程中配备法律和心理咨
第十一章 基因、遗传与优生伦理
第一节 基因伦理 第二节 遗传与优生
1
第一节 基因伦理
一、基因诊断中的伦理问题
④应了解咨询者对于所患疾病的态度和心 理、对发病危险率的理解、文化程度等 相关情况；
⑤应了解咨询者家庭对于相关遗传疾病的 顾虑和态度，以及由此引发的家庭矛盾， 询问应注意语气和策略；
⑥要尊重咨询者的隐私权，相关信息要注 意保密，不得泄露，不得随意转移或发 表（公布）相关信息。
18
（4）保障当事人和家庭的隐私不受雇主、 保险商和学校的不公正侵害；
（5）告知当事人和家庭，相关的遗传信 息可能会被非当事的第三方所误用；
（6）告知当事人，他或她有道德义务去 告知其血亲的遗传风险；
（7）告知当事人，有必要将其携带者身 份透露给配偶/伴侣，尤其是他们决定 生育之前；并告知当事人，公开此事对 他们的婚姻所存在的伤害的可能性；
20
• 遗传咨询门诊还应注意： ①遗传咨询要有原始的、准确的、完整的
记录，以便长期保存（可采用计算机的 数据库方式）； ②相关病历资料应作复印或扫描备份，由 遗传咨询门诊专门保存； ③遗传家系谱应由专业的遗传咨询人员亲 自绘制，最好一次完成（必要时以后加 以补充），以加强与咨询者及其家属之 间的良好的医患信任关系，不可由辅助 人员完成；
明或确保其诊断结果不会因误差而造成？ ⑤被诊断为基因缺陷阳性的人如何得到法律保障，
使他们不受人寿保险、招聘单位和社会的歧视？
2
• 对于基因诊断中所存在的伦理问题应该采 取适当办法加以解决：
①从思想上正确认识基因诊断的意义； ②注重提高医务工作者的素质，提高诊断方
法的科学性与权威性； ③注意在基因诊断过程中配备法律和心理咨
第十一章 基因、遗传与优生伦理
第一节 基因伦理 第二节 遗传与优生
1
第一节 基因伦理
一、基因诊断中的伦理问题