实验三超氧化物歧化酶(SOD)的提取及活性测定
人超氧化物歧化酶(SOD)说明书活性
人超氧化物歧化酶（SOD）酶联免疫分析试剂盒使用说明书本试剂仅供研究使用目的：本试剂盒用于测定人血清，血浆及相关液体样本中超氧化物歧化酶（SOD）的活性。
实验原理：本试剂盒应用双抗体夹心法测定标本中人超氧化物歧化酶（SOD）水平。
用纯化的人超氧化物歧化酶（SOD）抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入超氧化物歧化酶（SOD），再与HRP标记的超氧化物歧化酶（SOD）抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物TMB显色。
TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。
颜色的深浅和样品中的超氧化物歧化酶（SOD）呈正相关。
用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），通过标准曲线计算样品中人超氧化物歧化酶（SOD）活性浓度。
试剂盒组成：试剂盒组成48孔配置96孔配置保存说明书1份1份封板膜2片（48）2片（96）密封袋1个1个酶标包被板1×481×962-8℃保存标准品：720U/L0.5ml×1瓶0.5ml×1瓶2-8℃保存标准品稀释液 1.5ml×1瓶 1.5ml×1瓶2-8℃保存酶标试剂3ml×1瓶6ml×1瓶2-8℃保存样品稀释液3ml×1瓶6ml×1瓶2-8℃保存显色剂A液3ml×1瓶6ml×1瓶2-8℃保存显色剂B液3ml×1瓶6ml×1瓶2-8℃保存终止液3ml×1瓶6ml×1瓶2-8℃保存浓缩洗涤液（20ml×20倍）×1瓶（20ml×30倍）×1瓶2-8℃保存样本处理及要求：1.血清：室温血液自然凝固10-20分钟，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。
仔细收集上清，保存过程中如出现沉淀，应再次离心。
2.血浆：应根据标本的要求选择EDTA或柠檬酸钠作为抗凝剂，混合10-20分钟后，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。
SOD活性测定
SOD活性测定：SOD的测定方法很多，常见的有化学法，免疫法等电点聚焦法等，化学法测定的原理主要是利用有些化合物如邻苯三酚，在自氧化过程中会产生有色中间物降超氧游离基(O2)这样就可以利用SOD分例(O2)。
阻止中间物的积累而测定其酶活性。
1、试剂及仪器(1)邻苯三酚分析纯，用10mmol/LECL配成50mmol/L溶液。
(2)UV－754紫外分光光度计。
2、测定方法：(1)邻苯三酚自氧化速度的测定。
在25度、45ml`50mmol/L、PH值8.3、K2HPO4－KH2PO4缓冲液中加入10mmol/L的邻苯三酚，迅速摇匀，倒入光径1cm的比色杯内，在325mm波长下每隔30秒测A值一次，要求自氧化速度控制在0.0700d/mm 左右。
(2)SOD或粗酶抽提液活性测定：测定方法同测邻苯三酚自氧化速度，在加入邻苯三酚前加入待测SOD样液，测得数据按以下公式计算酶活性。
0.0700－A325mm/min----------------------------------------＊100％度0.70样液稀释倍数样液稀释倍数酶活性(u/m1)＝------------＊反应液总体积＊----------------50％样液体积3、蛋白浓度(mg/ml)和蛋白的计算：SOD或粗酶抽提液，经280mm紫外比色测定后，查牛轿清白蛋的标准曲线，由此算出每ml含ug蛋白的量。
蛋白浓度＝ug蛋白/ml＊样液稀释倍数＊10负3次方＝mg蛋白/ml总蛋白＝mg蛋白/ml＊原液总体积＝mg蛋白。
4、比活(u/mg蛋白)的计算：单位活力(u/ml) 总活力比活＝-----------------------＝-----------------＝u/mg蛋白蛋白的浓度(mg蛋白/ml) 总蛋白超氧化物歧化酶的活性测定超氧化物岐化酶(Superoxide dismutase，简称 SOD)广泛存在于生物体内的含Cu、Zn、Mn、Fe的金属类酶。
食叶草提取SOD探索
食叶草提取SOD探索北京军信泉盛环境科学技术研究院农业课题组食叶草提取SOD：SOD也叫超氧化物歧化酶，是一种源于生命体的活性物质，是一种含有金属元素的活性蛋白酶。
能消除生物体在新陈代谢过程中产生的有害物质。
对人体不断地补充 SOD具有抗衰老的特殊效果。
SOD是一种广泛存于动物、植物和微生物的生物酶，国外药用SOD系从血中提取，国内SOD已开发的品种已超过20种，证明我国对SOD的研究和应用已进入新时期。
用食叶草提取 SOD来源丰富，成本低，提取和纯化较方便SOD的应用技术：SOD是中国卫生部批准的具有延缓衰老功能的物质之一。
可抑制心脑血管疾病、抗衰老作用、自身免疫性疾病、肺气肿、辐射病及辐射防护、老年性白内障等。
食叶草SOD提取及测定：一、实验目的1、掌握食叶草细胞SOD提取和活力测定方法。
2、熟悉有关生化技术的基本原理和基本操作。
二、实验原理：食叶草和悬浮培养的食叶草细胞中含有丰富的SOD，通过组织或细胞破碎后，可用PH为7.8的磷酸缓冲液提取出。
由于SOD不溶于丙酮，可用丙酮将其沉淀析出。
三、实验步骤：1、细胞组织破碎：称取5克食叶草，置于研砵中研磨。
2、SOD提取：破碎后的组织中加入2～3倍体积的0.05mol/L磷酸缓冲液（PH 值=7.8），继续研磨20min，使SOD充分溶解到缓冲液中在5000rpm下离心15min,取上清液。
3、除去杂蛋白：上清液加入0.25体积的氯仿-乙醇混合液搅拌15min,5000r/min离心15min,得到的上清液为粗酶液。
4、SOD分离：粗酶液中加入等体积的冷丙酮，搅拌15min,5000r/min离心15min,得到SOD沉淀。
5、测SOD酶的活性①取约0.2gSOD测酶活，剩下的放入真空干燥机内干燥。
②取10ml缓冲液溶解，取2只离心管离心，取上清液，编号为 0,1,2。
③在3个离心管中分别家人200ul酶液。
④在0号管加400ulTCA，1、2号管分别加200u底物，从加入时开始计时，放入37℃水浴箱中10min。
丙二醛MDA、总抗氧化能力、超氧化物歧化酶（SOD）的测定
丙⼆醛MDA、总抗氧化能⼒、超氧化物歧化酶（SOD）的测定丙⼆醛MDA、总抗氧化能⼒、超氧化物歧化酶（SOD）的测定丙⼆醛MDA测定测试所需仪器设备：可见光分光光度计，可调到95℃左右的恒温⽔浴箱（或者铝锅内放⼏个去掉盖⼦的易拉罐，将罐壁及底部穿数⼗个孔，以便⽔的进⼊，⽤来代替⽔浴箱）。
离⼼机。
100Ｔ试剂盒组成与配制：试剂⼀：液体20mL*1瓶，室温保存．（天冷时会凝固，每次测试前适当⽔浴加温以加速溶解，直⾄透明⽅可应⽤）。
试剂⼆：液体12mL*1瓶，⽤时每瓶加340mL双蒸⽔混匀，4℃冷藏。
试剂三：粉剂*1⽀，4℃冷藏。
1.按规范操作⽅法来配制MDA3号试剂：将1⽀100Ｔ的MDA3号粉剂倒⼊烧杯内加90℃～100℃的热蒸馏⽔64mL,充分溶解（溶解过程中可适当加热）。
冷却后加冰醋酸60mL混匀。
2.再将上述配好的MDA3号试剂⽤50％冰醋酸按2：1进⾏稀释，⽤多少配多少。
例如您需要⽤微量法测MDA需要试剂三为15mL，则可以取上述按规范操作法配好的试剂三10mL加冰醋酸5mL，混匀即可。
配好的试剂避光4℃冰箱冷藏（冰醋酸⾃备）注：因蒸馏⽔热胀冷缩，加热过程要蒸发，本应加60mL现多加4mL，冷却后在60mL。
50％冰醋酸的配制是50mL双蒸⽔加50mL冰醋酸混合⽽成的。
冰醋酸⼜名⼄酸，⼀般的医药公司、化剂公司均有售，要购AR级分析纯级的⼄酸较好，⼄酸含量为99％以上。
⽤时将粉剂加⼊到90℃～100℃的热双蒸⽔60mL中，（在溶解过程中可适当加热），充分溶解后⽤双蒸⽔补⾜⾄60mL再加冰醋酸60mL，混匀，配好的试剂避光冷藏。
冰醋酸⾃备。
标准品：10nmoL/mL四⼄氧基丙烷5mL*1瓶，4℃冷藏。
测试盒冷藏⾄少可保存⼀年。
操作步骤：混匀（摇动⼏下试管架）旋涡混匀器混匀，试管⼝⽤保鲜薄膜扎紧，⽤针头刺⼀⼩孔，95℃⽔浴（或⽤锅开盖煮沸40分钟），取出后流⽔冷却，然后3500～4000转/分，离⼼10分钟，取上清***，532nm处，1cm光径，蒸馏⽔调零，测各管吸光度值。
测量酶方法
氮蓝四唑（NBT）法测定超氧物歧化酶（SOD）活力一、原理超氧物歧化酶（superoxidedismutase , SOD）普遍存在于动、植物体内，是一种清除超氧阴离子自由基的酶。
本实验依据超氧物歧化酶抑制氮蓝四唑（NBT）在光下的还原作用来确定酶活性大小。
在有氧化物质存在下，核黄素可被光还原，被还原的核黄素在有氧条件下极易再氧化而产生02,可将氮蓝四唑还原为蓝色的甲腙，后者在560nm处有最大吸收。
而SOD可清除02，从而抑制了甲腙的形成。
于是光还原反应后，反应液蓝色愈深，说明酶活性愈低,反之酶活性愈高。
据此可以计算出酶活性大小。
二、材料、仪器设备及试剂（一）材料；水稻或小麦叶片（二）仪器设备： 1.高速台式离心机； 2.分光光度计； 3.微量进样器； 4.荧光灯（反应试管处照度为4000Lx）； 5.试管或指形管数支。
（三）试剂:1. 0.05mol/L 磷酸缓冲液（pH7.8）；2. 130mmol/L 甲硫氨酸（Met ）溶液：称1.9399gMet 用磷酸缓冲液定容至100ml（现用现配）；3.750卩mol/L氮蓝四唑溶液：称取0.06133gNBT用磷酸缓冲液定容至100ml,（避光保存）；4. 100卩mol/L EDTA- Na2溶液：称取0.03721gEDTA— Na2用磷酸缓冲液定容至1000ml ；5. 20卩mol/L核黄素溶液：称取0.0753g核黄素用蒸馏水定容至1000ml（避光保存）。
三、实验步骤1. 酶液提取取一定部位的植物叶片（视需要定，去叶脉）0.5g于预冷的研钵中，1ml预冷的磷酸缓冲液在冰浴上研磨成浆，加缓冲液使终体积为5ml。
取1.5〜2ml于1000rpm下离心20min，上清液即为SOD粗提液。
2. 显色反应取5ml指形管（要求透明度好）4支，2支为测定管，另2支为对照管，按下列加入各溶液：试剂（酶）用量（ml）终浓度（比色时）0.05mol/L磷酸缓冲液 1.5130mmol/L Met溶液0.313mmol/L 750 卩mol/L NBT 溶液0.375 卩mol/L 100 卩mol/L EDTA—Na2 液0.310 卩mol/L 20 卩mol/L核黄素0.320卩mol/L酶液0.052支对照管以缓冲液代替酶液蒸馏水0.25总体积3.0 混匀后将1支对照管置暗处，其它各管于4000LX日光下反应20min （要求各管受光情况一致,温度高时间缩短,低时延长）。
超氧化物歧化酶(SOD)提取液
超氧化物歧化酶(SOD)提取液简介：超氧化物岐化酶(Superoxide Dismutase, SOD)是含金属辅基的酶，能催化超氧化物阴离子发生岐化作用，生成过氧化氢(H 2O 2)和氧气(O 2)，是生物体内一种重要的抗氧化酶。
由于超氧自由基是不稳定的的自由基，寿命极短，SOD 活性一般用间接方法测定，并利用各种呈色反应来测定SOD 活力，其中显色剂有NBT(四氮唑蓝)、WST-1、WST-8等。
Leagene 超氧化物歧化酶(SOD)提取液主要用于裂解组织样本、细胞样本，提取样品中的过氧化物酶。
该试剂仅用于科研领域，不宜用于临床诊断或其他用途。
组成：自备材料：1、 蒸馏水2、 离心管或试管3、 匀浆器或研钵4、 低温离心机操作步骤(仅供参考)：1、植物组织样品：取正常或逆境下的新鲜植物组织，清洗干净，擦干，切碎，迅速称取，按植物组织：超氧化物歧化酶(SOD)提取液=的比例，加入预冷的超氧化物歧化酶(SOD)提取液，冰浴情况下充分捣碎或研磨，用超氧化物歧化酶(SOD)提取液冲洗研钵或匀浆器，合并冲洗液至该离心管，补加超氧化物歧化酶(SOD)提取液至10ml ，离心10min ，取上清液(SOD 粗提液)用于酶活性的测定。
2、动物组织样品：动物用含有20U/ml Heparin 的生理盐水(0.9% NaCl containing 20U/ml Heparin)灌流清除血液后获取组织样品。
按照每100mg 组织加入500μl SOD 检测缓冲液的比例，用玻璃匀浆器在4℃或冰浴匀浆，离心10min ，取上清液(SOD 粗提液)用于酶活性的测定。
3、血浆或含红细胞的样品：从待测样品中分理出的血清或血浆不应有溶血，如果含有应去除红细胞后检测，如超过检测范围，用超氧化物歧化酶(SOD)提取液稀释后检测。
血清去除红细胞的简易方法如下：用抗凝管收集血液，颠倒混匀，取至少500μl 全血，4℃ 3000g 编号 名称 CS0395 Storage 超氧化物歧化酶(SOD)提取液 500ml RT 使用说明书 1份离心5min，转移上清至另一新的1ml离心管中，适量生理盐水稀释后待测。
SOD酶活力测定实验
摘要：通过对绿豆种子的研磨破碎获得SOD粗酶，经过硫酸铵分级分离、透析除盐和浓缩等过程，除去粗酶液中的杂质及干扰蛋白，采用葡聚糖（Sephadex G-100）凝胶层析得到纯化的SOD酶。
跟踪提纯过程活性的分布，并评价提取过程各步骤的效率。
实验结果证实随着不断的分离提纯，总活力以及总蛋白不断减小，比活力不断上升，最终得到的结果为总纯化倍数为0.68，活性得率为5.24%。
一、前言：超氧化物歧化酶简称SOD，是一种新型酶制剂，属金属酶。
分布很广，几乎从哺乳动物到细菌，以及植物中均存在。
在微生物中主存于需氧菌。
SOD是催化超氧阴离子（O2-）歧化反应的酶类，能通过歧化反应清除生物细胞中的超氧自由基（O2.－），生成H2O2和O2.H2O2由过氧化氢酶（CAT）催化生成H2O 和O2，从而减少自由基对有机体的毒害。
它的存在与生物体内的解毒作用有关，也发现与机体的衰老、肿瘤及免疫性疾病等有关。
自1968 年发现SOD 后，立刻引起科学界的高度重视，近40 年来这方面的研究进展非常迅速，它的应用领域日益拓宽，SOD 也有了产品.国外从牛红细胞中制得的超氧化物歧化酶，其商品名为Orgotein.不少人研究Orgotein的药理性质，证明它无毒，无抗原性，能抗发炎、抗超氧离子、抗病毒感染。
二十世纪80 年代后期，我国关于SOD 的研究及应用也形成了热点，如今已在化妆品添加剂、饮料及医药方面显示了特殊效果。
SOD作为治因而受到医药界的关注。
目前中国国内已进入临床试验阶段。
本实验以绿豆为原料提取SOD，通过各步的分离提纯，应测得酶总活力逐渐减小，比活逐渐升高.通过本实验掌握物质分离纯化的实验设计过程，以及硫酸铵分离、透析除盐、浓缩和葡聚糖凝胶层析等物质分离技术。
二、实验材料与方法：<一>材料:绿豆种子,市售新鲜绿豆种子浸泡蒸馏水24小时备用.<二>试剂:葡聚糖（sephadexG-100）, NaCl（AP）, 磷酸氢二钠（AP）, 磷酸二氢钠（AP）, 三羟甲基氨基甲烷（Tris）, 盐酸（浓盐酸），硫酸铵（AP）, PEG6000 ，考马斯亮蓝G250 , 磷酸，乙醇（95%），牛血清蛋白BSA , 连苯三酚(焦性没食子酸), EDTA(钠盐) , 超氧化物歧化酶（sigma公司）。
动物血中超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)的提取
动物血中超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)的提取[原理]l969年，McCord和Fridovich第一次从牛血中提纯到超氧化物岐化酶。
自然界中SOD分布极广，其含量随生物体的不同而不同，即使同一种生物的不同组织或同一组织的不同部位，其SOD的种类和含量也有很大差别。
迄今为止人们已从细菌，真菌、原生动物。
藻类、昆虫、鱼类、植物和动物等各种生物体内分离得到SOD。
为拓宽提取SOD的原料，筛选或基因过程开发产SOD量较高的菌株。
目前，研究开发最多的资源还是从动物血液、动物组织中制备提纯SOD。
从动物血液材料中制备Cu Zn-SOD纯化工艺分为三个主要步骤：（1）原材料的预处理；（2）粗酶液的制备；（3）离子交换柱层析精制。
国内多采用Mccord和 Fridovich法，其主要工艺过程为：第一步，乙醇-氯仿除去血红蛋白；第二步，有机溶剂和硫酸铵分级沉淀；第三步，离子交换柱层析精制。
[试剂和器材]1、试剂（1）3.8%（质量分数）柠檬酸三钠（2）0.9%（质量分数）氯化钠（3）95%（体积分数）乙醇（4）氯仿（5）丙酮（6）pH7.6、 2.5mmol/L K2HPO4-KH2PO4缓冲液（7）DEAE-Sephadex A-502、器材（1）猪血（2）恒温水浴（3）离心机（4）布氏漏斗、抽滤瓶（5）烧杯、量筒、搅棒（6）透析袋[方法和步骤]1、从猪血中提取SOD（1）分离血球取新鲜猪血，加入到3.8%柠檬酸三钠抗凝液中，新鲜猪血与抗凝液的比例为3：1，轻轻搅拌均匀，4 000r/min离心20min，收集红血球。
（2）除血红蛋白红血球用3倍体积生理盐水洗涤，4 000r/min离心20min，重复三次，然后向洗净的红血球加入1～1.1倍体积去离子水，搅拌溶血30min，再向溶血液中分别缓慢加入0.25倍体积的预冷95%乙醇和0.15倍体积的预冷氯仿，剧烈搅拌15min左右，静置1h，然后 4 000r/min离心20min除去变性血红蛋白沉淀，取清液，过滤，收集滤液（记录体积，测酶活性和蛋白浓度）。
SOD的活性测定
SOD活力测定（NBT还原法）植物叶片在衰老过程中发生一系列生理生化变化，如核酸和蛋白质含量下降、叶绿素降解、光合作用降低及内源激素平衡失调等。
这些指标在一定程度上反映衰老过程的变化。
近来大量研究表明，植物在逆境胁迫或衰老过程中，细胞内自由基代谢平衡被破坏而有利于自由基的产生。
过剩自由基的毒害之一是引发或加剧膜脂过氧化作用，造成细胞膜系统的损伤，严重时会导致植物细胞死亡。
自由基是具有未配对价电子的原子或原子团。
生物体内产生的自由基主要有超氧自由基（O2－）、羟自由基（OH.）、过氧自由基（ROD）、烷氧自由基（RO）等。
植物细胞膜有酶促和非酶促两类过氧化物防御系统，超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）、过氧化物酶（POD）和抗坏血酸过氧化物酶（ASA-POD）等是酶促防御系统的重要保护酶。
抗坏血酸（VC）、VE和还原型谷胱甘肽（GSH）等是非酶促防御系统中的重要抗氧化剂。
SOD、CAT等活性氧清除剂的含量水平和O2－、H2O2、OH. 和O2等活性氧的含量水平可作为植物衰老的生理生化指标。
超氧自由基（O2.－）是生物细胞某些生理生化反应常见的中间产物。
自由基是本身带有不成对价电子的分子、原子、原子团或离子，化学性质非常活泼，是活性氧的一种。
如果细胞中缺乏清除自由基的酶时，机体就会受到各种损伤。
超氧化物歧化酶（Superoxide Dismutase），简称SOD，能通过歧化反应清除生物细胞中的超氧自由基（O2.－），生成H2O2和O2。
H2O2由过氧化氢酶（CAT）催化生成H2O和O2，从而减少自由基对有机体的毒害。
一、原理超氧物歧化酶（superoxidedismutase，SOD）普遍存在于动、植物体内，是一种清除超氧阴离子自由基的酶。
本实验依据超氧物歧化酶抑制氮蓝四唑（NBT）在光下的还原作用来确定酶活性大小。
在有氧化物质存在下，核黄素可被光还原，被还原的核黄素在有氧条件下极易再氧化而产生O2-，可将氮蓝四唑还原为蓝色的甲腙，后者在560nm处有最大吸收。
植物组织中SOD活性MDA含量的测定方法
植物组织中SOD活性MDA含量的测定方法超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活性和丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量是评价植物细胞的氧化应激程度和损伤程度的重要指标。
下面将介绍常用的测定植物组织中SOD活性和MDA含量的方法。
一、SOD活性测定方法：1. 混合植物组织提取液：将适量的植物组织（如叶片、根部等）加入冰冻磨碎器中，加入适量的冰冷提取液（Tris-HCl缓冲液，pH 7.8或其他适宜缓冲液），按比例加入少量酒石酸、酚酸、DTT等，然后将混合物离心10分钟。
2.处理提取物：将上述所得的植物组织提取液加入活性溶液，如NBT、PIP等，混匀后放置在37°C水浴中反应一定时间。
3. 停止反应：将反应液加入组织破壁液（甘油、NaCl、Tween-20等混合物），混匀后放置一段时间，离心10-15分钟。
4.测定光密度：取上清液用比色计测定光密度（OD）值，以反映SOD的活性，活性越高，OD值越低。
二、MDA含量测定方法：1.组织提取：将适量的植物组织加入冰冷提取液（如磷酸盐缓冲液，pH7.4），用冷磨具磨碎并移至离心管中，离心5分钟收集上清液。
2.加入TBA液：取上清液与TBA液（三硝基苞球菌素溶液）按比例混合，混匀后在水浴中加热（100°C，10分钟），然后迅速冷却至室温。
3.离心沉淀：将样品离心10分钟，取上清液。
4.测定光密度：分别取上清液测定OD值，OD值越高，MDA含量越高。
三、优化与改进：1.提取液的选择：根据不同植物组织的特点选择合适的提取液，以提高SOD活性和MDA含量的测定效果。
2.比色反应的时间和温度的调整：根据植物组织中SOD活性的变化调整反应时间和温度，以保证测定结果的准确性。
3.重复测量：为了提高实验结果的可靠性，可以重复测量同一样本，并取平均值作为最终结果。
4.与对照的比较：将测定样本与对照组进行比较，以评估SOD活性和MDA含量的变化，进一步分析植物组织的氧化应激程度和损伤程度。