SOD(超氧化物歧化酶)活性测定
抗氧化酶(SOD、POD、CAT)活性测定方法
抗氧化酶（SOD、POD、CAT）活性测定方法一、超氧化物歧化酶（SOD）活性测定（氮蓝四唑光化还原法）1、试剂的配制（1）L磷酸缓冲液(PBS，：A母液：L磷酸氢二钠溶液: 取Na2HPO4·12H2O（分子量）71.7g；B母液：L磷酸二氢钠溶液：取NaH2PO4·2H2O（分子量）31.2g。
分别用蒸馏水定容到1000ml。
L PBS（）的配制：分别取A母液(Na2HPO4) ，B母液(NaH2PO4) ，用蒸馏水定容至1000ml。
参考文献：李合生主编：植物生理生化实验原理和技术.高等教育出版社，2000：267～268。
（2）甲硫氨酸溶液：取 Met用磷酸缓冲液（）定容至1000ml。
（3）30μM EDTA-Na2溶液：取用磷酸缓冲液定容至100ml。
（4）60μM核黄素溶液：取核黄素用磷酸缓冲液定容至100ml，避光保存。
（5）氮蓝四唑(NBT)溶液：取 NBT用PBS定容至100ml，避光保存。
酶液制备：取（可视情况调整）样品（新鲜叶片或根系）洗净后置于预冷的研钵中，加入 50mmol/L预冷的磷酸缓冲液（）在冰浴上研磨成匀浆，转入离心管中在4℃、12000g下离心20min，上清液即为酶液。
2、酶活性测定（1）反应混合液配制(以60个样为准)：分别取Met溶液162ml，EDTA-Na2溶液，磷酸缓冲液，NBT溶液6ml，核黄素溶液6ml,混合后摇匀；（2）分别取3ml反应混合液和30μl酶液于试管中（3）将试管置于光照培养箱中在4000 lux光照下反应20min；同时做两支对照管，其中1支试管取3ml反应混合液加入30μl PBS（不加酶液）照光后测定作为最大光还原管，另1支只加缓冲液置于暗中测定时用于调零。
（4）以不照光的对照管（只有缓冲液并置于暗处）调零后，避光测OD560(出现颜色即可测定)。
（5）酶活性计算：SOD活性单位以抑制NBT光化还原50％所需酶量（测的样品值要在最大管的一半左右才合适，否则要调整酶量）为1个酶活单位（u）。
抗氧化酶(SOD、POD、CAT)活性测定方法
抗氧化酶（SOD、POD、CAT）活性测定方法一、超氧化物歧化酶（SOD）活性测定（氮蓝四唑光化还原法）1、试剂的配制（1）0.05mol/L磷酸缓冲液(PBS，pH7.8)：A母液：0.2mol/L磷酸氢二钠溶液: 取Na2HPO4·12H2O（分子量358.14）71.7g；B母液：0.2mol/L磷酸二氢钠溶液：取NaH2PO4·2H2O（分子量156.01）31.2g。
分别用蒸馏水定容到1000ml。
0.05mol/L PBS（pH7.8）的配制：分别取A母液(Na2HPO4) 228.75ml，B母液(NaH2PO4) 21.25ml，用蒸馏水定容至1000ml。
参考文献：李合生主编：植物生理生化实验原理和技术.高等教育出版社，2000：267～268。
（2）14.5mM甲硫氨酸溶液：取2.1637g Met用磷酸缓冲液（pH7.8）定容至1000ml。
（3）30μM EDTA-Na2溶液：取0.001gEDTA-Na2用磷酸缓冲液定容至100ml。
（4）60μM核黄素溶液：取0.0023g核黄素用磷酸缓冲液定容至100ml，避光保存。
（5）2.25mM 氮蓝四唑(NBT)溶液：取0.1840g NBT用PBS定容至100ml，避光保存。
酶液制备：取0.2g（可视情况调整）样品（新鲜叶片或根系）洗净后置于预冷的研钵中，加入1.6ml 50mmol/L预冷的磷酸缓冲液（pH7.8）在冰浴上研磨成匀浆，转入离心管中在4℃、12000g下离心20min，上清液即为酶液。
2、酶活性测定（1）反应混合液配制(以60个样为准)：分别取Met溶液162ml，EDTA-Na2溶液0.6ml，磷酸缓冲液5.4ml，NBT溶液6ml，核黄素溶液6ml,混合后摇匀；（2）分别取3ml反应混合液和30μl酶液于试管中（3）将试管置于光照培养箱中在4000 lux光照下反应20min；同时做两支对照管，其中1支试管取3ml反应混合液加入30μl PBS（不加酶液）照光后测定作为最大光还原管，另1支只加缓冲液置于暗中测定时用于调零。
抗氧化酶活性测定方法
抗氧化酶活性测定方法抗氧化酶是一类对抗氧化反应具有重要作用的酶。
其主要功能是清除体内的自由基，抑制过氧化物形成和脂质氧化反应，从而保护细胞免受氧化应激的伤害。
测定抗氧化酶活性有助于评估生物体内的氧化应激水平，为疾病的诊断和治疗提供重要的指导。
本文将介绍几种常见的抗氧化酶活性测定方法。
1.超氧化物歧化酶（SOD）活性测定方法：SOD能够催化超氧阴离子（O2-）的还原反应，将其转化为较为稳定的氧气和过氧化氢。
常见的SOD活性测定方法有：-标准醛缩法：根据SOD催化的还原反应，利用NBT（硝基蓝盐）和醛缩剂的变色反应来测定SOD活性。
-自动化测定法：利用包含其中一种还原物质和pH染料的较为稳定的底物，通过测定底物的氧化程度来确定SOD活性。
-XTT法和WST-1法：由于SOD具有还原型的性质，可以通过测定细胞培养基中的还原型琼脂糖（XTT）或水溶性四硝基噻唑盐（WST-1）的还原动力学来测定其活性。
2.过氧化氢酶（CAT）活性测定方法：CAT主要参与还原过氧化氢（H2O2），将其转化为氧和水。
常见的CAT活性测定方法有：-色素法：利用黄曲霉素作为还原剂，观察黄曲霉素的消费量来测定CAT活性。
-光度法：通过测定样品中H2O2浓度的下降程度来间接测定CAT活性。
-氧化还原电极法：通过测定样品中H2O2浓度的下降速度来测定CAT活性。
3.过氧化物酶（POD）活性测定方法：POD主要参与氧气与还原型供体之间的氧化还原反应，转化为过氧化物（ROO-）。
常见的POD活性测定方法有：-色谱法：利用酚类底物的氧化反应，测定产生的醌类产物的含量来测定POD活性。
-酶标法：POD催化氧化反应会形成有色产物，通过测定产物的吸光度来测定POD活性。
4.谷胱甘肽过氧化物酶（GPx）活性测定方法：GPx主要参与还原过氧化物，将其转化为相对稳定的醇和水。
常见的GPx活性测定方法有：-碳酸盐法：根据GPx还原底物中的碳酸盐，观察样品溶液pH值的变化来测定GPx活性。
SOD酶活力测定实验
摘要：通过对绿豆种子的研磨破碎获得SOD粗酶，经过硫酸铵分级分离、透析除盐和浓缩等过程，除去粗酶液中的杂质及干扰蛋白，采用葡聚糖（Sephadex G-100）凝胶层析得到纯化的SOD酶。
跟踪提纯过程活性的分布，并评价提取过程各步骤的效率。
实验结果证实随着不断的分离提纯，总活力以及总蛋白不断减小，比活力不断上升，最终得到的结果为总纯化倍数为0.68，活性得率为5.24%。
一、前言：超氧化物歧化酶简称SOD，是一种新型酶制剂，属金属酶。
分布很广，几乎从哺乳动物到细菌，以及植物中均存在。
在微生物中主存于需氧菌。
SOD是催化超氧阴离子（O2-）歧化反应的酶类，能通过歧化反应清除生物细胞中的超氧自由基（O2.－），生成H2O2和O2.H2O2由过氧化氢酶（CAT）催化生成H2O 和O2，从而减少自由基对有机体的毒害。
它的存在与生物体内的解毒作用有关，也发现与机体的衰老、肿瘤及免疫性疾病等有关。
自1968 年发现SOD 后，立刻引起科学界的高度重视，近40 年来这方面的研究进展非常迅速，它的应用领域日益拓宽，SOD 也有了产品.国外从牛红细胞中制得的超氧化物歧化酶，其商品名为Orgotein.不少人研究Orgotein的药理性质，证明它无毒，无抗原性，能抗发炎、抗超氧离子、抗病毒感染。
二十世纪80 年代后期，我国关于SOD 的研究及应用也形成了热点，如今已在化妆品添加剂、饮料及医药方面显示了特殊效果。
SOD作为治因而受到医药界的关注。
目前中国国内已进入临床试验阶段。
本实验以绿豆为原料提取SOD，通过各步的分离提纯，应测得酶总活力逐渐减小，比活逐渐升高.通过本实验掌握物质分离纯化的实验设计过程，以及硫酸铵分离、透析除盐、浓缩和葡聚糖凝胶层析等物质分离技术。
二、实验材料与方法：<一>材料:绿豆种子,市售新鲜绿豆种子浸泡蒸馏水24小时备用.<二>试剂:葡聚糖（sephadexG-100）, NaCl（AP）, 磷酸氢二钠（AP）, 磷酸二氢钠（AP）, 三羟甲基氨基甲烷（Tris）, 盐酸（浓盐酸），硫酸铵（AP）, PEG6000 ，考马斯亮蓝G250 , 磷酸，乙醇（95%），牛血清蛋白BSA , 连苯三酚(焦性没食子酸), EDTA(钠盐) , 超氧化物歧化酶（sigma公司）。
超氧化物歧化酶（SOD）的分离纯化及活力测定、同工酶电泳
超氧化物歧化酶（SOD）的分离纯化及活⼒测定、同⼯酶电泳实验⼆猪⾎中超氧化物歧化酶(SOD)的分离纯化及活⼒测定、同⼯酶电泳⼀、实验原理超氧化物岐化酶SOD⼴泛存在于⽣物体内的含Cu、Zn、Mn、Fe的⾦属类酶。
它作为⽣物体内重要的⾃由基清除剂，可以清除体内多余的超氧阴离⼦，在防御⽣物体氧化损伤⽅⾯起着重要作⽤。
SOD是⼀种酸性蛋⽩，对热、pH和蛋⽩酶的⽔解较⼀般酶稳定。
根据⾦属辅基的不同，它可以分为四类，分别为Mn-SOD、Cu-Zn-SOD、Fe-SOD、Ni-SOD，其中最常见是(CuZn-SOD)，主要存在于真核细胞的细胞质中。
CuZn-S0D酶蛋⽩的分⼦量约为3.2×104，每个酶分⼦由2个亚基通过⾮共价键的疏⽔基相互作⽤缔合成⼆聚体，每个亚基(肽链)含有铜、锌原⼦各⼀个，活性中⼼的核⼼是铜。
SOD作为机体内最重要的抗氧化酶体之⼀，可以直接清除过量的超氧⾃由基，阻⽌机体的过氧化，对机体有较⾼的防护作⽤及保健价值。
本实验采⽤有机溶剂沉淀法以新鲜猪⾎为原料，从中提取SOD硬进⾏纯化。
酶活⼒测定可⽤以下⽅法：黄嘌呤氧化酶法、细胞⾊素C法、肾上腺素⾃氧化法亚硝酸法、NBT光还原法、化学发光法以及邻苯三酚⾃氧化法等。
⽽该实验SOD酶活性采⽤邻苯三酚⾃氧化法测定。
酶活性单位定义为:在1ml的反应液中，每分钟抑制邻苯三酚⾃氧化速率达50%时的酶量定义为⼀个活⼒单位。
SOD同⼯酶奠定采⽤不连续聚丙烯酰胺-的作⽤，因此，电泳分离SOD后，凝凝胶电泳技术分离鉴定。
⽤“负”显⾊法显⽰。
由于SOD能够抑制O2胶上⽆SOD处显⽰为蓝⾊，⼜SOD处为⽆⾊透明，由此可以鉴定SOD同⼯酶酶谱。
⼆、实验试剂与器材ACD抗凝剂、0.9%Nacl、丙酮、95%⼄醇、氯仿、考马斯亮蓝G-250、50mmol/L pH8.3磷酸缓冲液、10mmol/L EDTA钠盐溶液、3mmol/L 邻苯三酚溶液等以及752分光光度计、分析天平、具塞试管、刻度吸管、离⼼机、烧杯、电泳装置、微量进样器、注射器等。
抗氧化酶(SOD、POD、CAT)活性测定方法
抗氧化酶（SOD、POD、CAT）活性测定方法一、超氧化物歧化酶（SOD）活性测定（氮蓝四唑光化还原法）1、试剂的配制（1）0.05mol/L磷酸缓冲液(PBS，pH7.8)：A母液：0.2mol/L磷酸氢二钠溶液: 取Na2HPO4·12H2O（分子量358.14）71.7g；B母液：0.2mol/L磷酸二氢钠溶液：取NaH2PO4·2H2O（分子量156.01）31.2g。
分别用蒸馏水定容到1000ml。
0.05mol/L PBS（pH7.8）的配制：分别取A母液(Na2HPO4) 228.75ml，B母液(NaH2PO4) 21.25ml，用蒸馏水定容至1000ml。
加入10gPVP（聚乙烯吡咯烷酮）参考文献：李合生主编：植物生理生化实验原理和技术.高等教育出版社，2000：267～268。
（2）130mmol/L甲硫氨酸溶液：取1.399g Met用磷酸缓冲液（pH7.8）定容至100ml。
网上说定容到100ML我也不懂。
拜托（3）100μmol/L EDTA-Na2溶液：取0.03721g EDTA-Na2用磷酸缓冲液定容至1000ml；（4）100μM核黄素溶液：取0.0075g核黄素用蒸馏水定容至100ml，避光保存，随用随配，并稀释10倍（5）750μmol/L氮蓝四唑（NBT）溶液：称取0.06133g NBT用磷酸缓冲液定容至100ml 避光保存；酶液制备：取一定部位的植物叶片（视需要定，去叶脉）0.5g于预冷的研钵中，加2ml 磷酸缓冲液在冰浴下研磨成浆，加缓冲液使终体积为10ml。
取5ml于10000r/min下离心10min，上清液即为SOD粗提液。
提取酶液时如何保存;如果没有测完的需要放在4℃的冰箱里。
2、酶活性测定2．显色反应取试管（要求透明度好）5支，3支为样品测定管，1支为对照管，另外1支作为空白，按表39-1加入各溶液。
混匀后将空白管置暗处，其它各管于4000lx日光灯下反应20min（要求各管受光情况一致，反应室的温度高时时间可适当缩短，温度低时时间可适当延长）。
氮蓝四唑(NBT)法测定超氧化物歧化酶(SOD)的活力
氮蓝四唑（NBT ）法测定超氧化物歧化酶(SOD)的活力一、 目的与要求SOD 在植物抗逆过程中发挥着重要的作用，通过本实验理解其抗逆机理，熟悉其操作步骤及其计算方法。
二、原理SOD 是普遍存在于动、植物体内，是一种清除超氧阴离子自由基的酶。
本实验依据超氧物歧化酶抑制氮蓝四唑（NBT ）在光下的还原作用来确定酶活性大小。
在有氧化物质存在下，核黄素可被光还原，被还原的核黄素在有氧条件下极易再氧化而产生O 2-，可将氮蓝四唑还原为蓝色的甲腙，后者在560nm 处有最大吸收。
而SOD 可清除O 2-，从而抑制了甲腙的形成。
于是光还原反应后，反应液蓝色愈深，说明酶活性愈低，反之酶活性愈高。
一个酶活力单位定义为将NBT 的还原抑制到对照一半（50％）时所用的酶量。
222222SOD O H H O O -+−−−→+222222CAT H O H O O −−−→+三、材料、仪器设备及试剂（一）材料：水稻或小麦叶片（二）仪器设备：1.高速台式离心机；2.分光光度计；3.微量进样器；4.荧光灯（反应试管处照度为4000Lx ）；5.试管（三）试剂：1. 0.05mol/L 磷酸缓冲液（pH7.8: 0.2mol/L Na 2HP04 91.5 ml; 0.2mol/L NaH 2P048.5 ml ）；2. 130mmol/L 甲硫氨酸（Met ）溶液：称1.9397gMet 用磷酸缓冲液定容至100ml ；3. 750μmol/L 氮蓝四唑溶液：称取0.06133gNBT 用磷酸缓冲液定容至100ml ，避光保存；4. 100μmol/L EDTA －Na 2溶液：称取0.03721gEDTA －Na 2用磷酸缓冲液定容至1000ml ；5. 20μmol/L 核黄素溶液：称取0.0753g 核黄素用蒸馏水定容至1000ml 避光保存。
四、实验步骤1. 酶液提取：取叶片0.5g 于预冷的研钵中，加2ml 预冷的PH 7.8的磷酸缓冲液，在研钵上研磨成匀浆，加缓冲液使终体积为10ml ，取5ml 于4度下4000rpm 离心15min ，上清液即为SOD 粗提液。
SOD测定方法
超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase，简称SOD）的测定方法2009年12月08日 16:17法适用于以各类鲜活的动植物组织器官及初加工品（如生鱼片、动物血等初加工肉制品）、乳制品、各类水果蔬菜、果汁等食品中超氧化物歧化酶活性的测定。
超氧化物歧化酶是催化以下反应的金属酶，测酶活方法很多，本文介绍氮蓝四唑法与连苯三酚自氧化法。
（一）氮蓝四唑法1. 方法提要在电子供体如甲硫氨酸存在下，核黄素受光激发，与电子供体反应被还原。
在氧气中，还原的核黄素与氧化反应产生，将无色（或微黄）的氮蓝四唑还原为蓝色的不溶性僭，SOD通过催化歧化反应，生成O2与H2O2，从而抑制蓝色形成。
按抑制蓝色特形成的50%为一酶活单位。
酶活力越高，抑制50%蓝色形成所需酶量越少。
2. 仪器荧光灯管。
离心机。
分光光度计。
pH计。
3. 试剂（1）磷酸氢二钾（K2HPO4·3H2O），磷酸二氢钾（KH2PO4），甲硫氨酸（Met），氮蓝四唑（NBT），核黄素，乙二胺四乙酸（EDTA），以上试剂均为分析纯级；所用水为离子水或同等纯度蒸馏水。
（2）pH7.8, 5.0×10-2mol/L的K2HPO4- KH2PO4缓冲液（于冰箱中保存）。
4. 测定步骤（1）酶液的制备：称取5~10g样品，加预先在冰箱中放置的上述K2HPO4- KH2PO4缓冲液，缓冲液的量为所用样品的10倍以上，在4℃条件下或冰浴中研磨成匀浆，四层纱布过滤，滤液经4000r/min离心20min，取上清液用于酶活测定。
（2）酶反应酬体系液的制备：取上述K2HPO4- KH2PO4缓冲液30ml，依次溶入Met，NBT，核黄素与EDTA，使它们的浓度分别为1.3×10-2mol/L, 6.3×10-5mol/L, 1.3×10-6mol/L与1×10-4mol/L，放冰箱中避光保存。
（3）测酶活在暗光下，取上述酶反应体系液3mL，移入试管中，试管放在一反应小室中，反应小室壁上贴锡箔纸，应将每个试管摆放在照光后所接受光强一致的位置。
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SOD(超氧化物歧化酶)活性测定
氮蓝四唑法
一、原理
超氧化物歧化酶(superoxide dismutase ，SOD)普遍存在动、植物的体内，是一种清除超氧阴离子自由基的酶，它催化下面的反应：
o 2.-+H O 2
22+O H ＋
反应产物H 2O 2可由过氧化氢酶进一步分解或被过氧化物酶利用。
超氧化物歧化酶抑制氮蓝四唑(NBT)在光下的还原作用来确定酶活性的大小。
在有氧化物质存在下，核黄素可被光还原，被还原的核黄素在有氧条件下极易被氧化而产生超氧阴离子，超氧阴离子可将氮蓝四唑还原为蓝色的甲腙，后者在560nm 处有最大吸收。
而SOD 可清除超氧阴离子，从而抑制了甲腙的形成。
于是光还原反应后，反应液蓝色愈深，说明酶的活性愈低，反之酶的活性俞高。
据此可计算出酶活性的大小。
二、材料、仪器设备及试剂
(一)材料
植物器官(花瓣、叶片等)
(二)仪器设备
冰箱、低温高速离心机、微量加样器 (1mL 、20μL 、100μL)、移液管、精密电子天平、UV-752型紫外分光光度计、试管、研钵、剪刀、镊子、荧光灯(反应试管处照度为4000Lux 或Lx)
(三)试剂
(1) 0.05mol/L 磷酸缓冲液(PH7.8)。
(2) 130mmol/L 甲硫氨酸(Met)溶液：称1.9399gMet 用磷酸缓冲液定溶至100mL 。
(3)750μmol/L 氮蓝四唑溶液：称取0.06133gNBT 用磷酸缓冲液定溶至100mL ，避光保存。
(4)100μmol/LEDTA -Na 2溶液：称取0.03721g EDTA-Na 2，用磷酸缓冲液定溶1000mL 。
(5)20μmol/L 核黄素溶液：称取0.0753g 核黄素用蒸馏水定溶到1000mL ，避光保存。
三、试验步骤
(一)酶液的提取
(1)称取植物材料(去叶脉)0.2g ，加1ml 预冷的磷酸缓冲液在冰浴上研磨成浆，加缓冲
液使体积为5mL。
取2mL于1000r/min下离心20min，上清液即为SOD粗提液。
(二)显色反应
取5mL的试管(要求透明度好)若干，有对照、处理。
按下表加样：
试剂(酶) 用量/mL 终浓度/比色时
0.05mol/L磷酸缓冲液 1.5
130mmol/Lmet溶液0.3 13mmol/L
750μmol/LNBT溶液0.3 75μmol/L
100μmol/L EDTA-Na2液0.3 10μmol/L 20μmol/L核黄素0.3 2.0μmol/L 酶液0.05 对照液用缓冲液
蒸馏水0.25
总体积 3.0
混合后将一支对照管置暗处，其他各管于4000Lx日光下反应20min。
(三)SOD活性测定与计算
至反应结束后，以不照光的对照管做空白，分别测定其他管的吸光度。
四、计算酶活力
已知SOD活力单位以抑制氮蓝四唑光还原的50%为一个酶活力单位表示，按下式计算SOD活性。
SOD总活力=[(A CK-A E)×V]/(0.5×A CK×W×V t)
SOD比活力= SOD总活力/蛋白质含量
公式中：SOD总活力以鲜重酶单位每克表示；比活力单位以酶单位每毫克蛋白表示；
A CK为照光对照管的吸光值；A E为样品管的吸光度；V为样品液总体积，mL；V t为测定时样品用量，mL；W为样品鲜重，g；蛋白质含量单位为mg/g。