农杆菌介导水稻遗传转化的相关讨论
农杆菌介导植物转化的机制及影响转化效率的因素
二、农杆菌介导植物转化的机制及影响转化效率的因素转化机制：与植物基因转化有关的农杆菌有两种类型:根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）和发根农杆菌（Agrobacterium rhizogenes）。
根癌农杆菌含有Ti 质粒。
发根农杆菌含有Ri 质粒.根癌农杆菌的Ti 质粒和发根农杆菌Ri 质粒都具有一段转移DNA （transfer DNA，又称T-DNA)，在农杆菌侵染植物时，T-DNA 可以插入到植物基因组中，使其携带的基因在植物中得以表达。
由于T-DNA 能够进行高频率的转移，而且Ti 质粒和Ri 质粒上可插入大到甚至150kb 的外源基因，因此，Ti 质粒和Ri 质粒成为植物基因转化中的理想载体系统。
1 与农杆菌转化相关的基因与转化相关的基因主要包括农杆菌染色体上的基因和Ti 质粒上T—DNA 以外Vir 区的基因。
染色体基因包括chvA、chvB、att、pscA、chvD 以及chvB。
它们大多编码一些膜相关蛋白，负责细菌向植物受伤细胞趋化移动和帮助细菌附着于植物受伤细胞上。
ChvD 蛋白可能在低pH 和磷酸饥饿情况下提高VirG 蛋白的合成水平。
ChvE 与VirA 蛋白共同对virG 起激活作用。
原始的Ti质粒根据其功能的不同，可分为4个区：（1）T—DNA区:是在农杆菌侵染细胞时,从Ti质粒上切割下来转移到植物基因组中的一段DNA,其携带的基因与肿瘤的形成有关,但与T-DNA本身的转移与整合无关.T—DNA上最重要的是两端的2个边界(LB和RB)，它们是T-DNA转移所必需的。
只要其存在，T—DNA 可以将携带的任何基因转移并整合到植物基因组中， T—DNA的右边界在T—DNA的整合中对于靶DNA位点的识别具有重要作用，因此,尤以右边界更为重要．（2）毒性区：位于T—DNA以外的1个30～40 kb的区域内，该区段编码的基因但对T-DNA 的转移和整合非常重要．这些基因也称为Ti质粒编码毒性基因(vir)。
农杆菌介导黎平杂边禾优化遗传转化体系的研究
农杆菌介导黎平杂边禾优化遗传转化体系的研究黄仁权;刘怒安;曾晓芳;赵德刚【摘要】为了提高农杆菌介导的水稻茎尖遗传转化效率,建立黎平杂边禾遗传转化体系.本研究以贵州地方水稻品种黎平杂边禾茎尖为材料,遗传转化苦瓜几丁质酶基因McCHIT1,以β-葡萄糖苷酶基因(GUS)作为报告基因,通过正交试验设计方法,研究菌液OD600值、真空处理时间和真空渗透压强对黎平杂边禾茎尖遗传转化体系的影响.结果表明:影响植株GUS基因表达率和植株死亡率的主要因素分别为真空处理时间和菌液浓度;农杆菌介导黎平杂边禾茎尖遗传转化的最优条件是真空处理时间为11 min、农杆菌菌液OD600为0.8和真空渗透压强为8 kPa.通过优化影响遗传转化体系的条件,初步建立了建立黎平杂边禾遗传转化体系.【期刊名称】《山地农业生物学报》【年(卷),期】2018(037)003【总页数】7页(P7-13)【关键词】黎平杂边禾;茎尖;遗传转化;GUS基因【作者】黄仁权;刘怒安;曾晓芳;赵德刚【作者单位】贵州大学生命科学学院/农业生物工程研究院/贵州省农业生物工程重点实验室/山地植物资源保护与种质创新省部共建教育部重点实验室/贵州省山地生态与农业生物工程2011协同创新中心,贵州贵阳 550025;贵州大学生命科学学院/农业生物工程研究院/贵州省农业生物工程重点实验室/山地植物资源保护与种质创新省部共建教育部重点实验室/贵州省山地生态与农业生物工程2011协同创新中心,贵州贵阳 550025;贵州大学生命科学学院/农业生物工程研究院/贵州省农业生物工程重点实验室/山地植物资源保护与种质创新省部共建教育部重点实验室/贵州省山地生态与农业生物工程2011协同创新中心,贵州贵阳 550025;贵州大学生命科学学院/农业生物工程研究院/贵州省农业生物工程重点实验室/山地植物资源保护与种质创新省部共建教育部重点实验室/贵州省山地生态与农业生物工程2011协同创新中心,贵州贵阳 550025;贵州省农业科学院,贵州贵阳 550006【正文语种】中文【中图分类】Q785水稻(Oryza sativa L.)不仅是重要的模式研究作物，也是世界上重要的粮食经济作物，其产量和品质对全球粮食稳定供给具有重要影响。
转基因水稻培育实验报告
一、实验目的本实验旨在通过基因工程技术，将具有特定功能的基因导入水稻中，培育出具有抗病、抗虫、抗逆等优良性状的转基因水稻，为我国水稻育种提供新的途径。
二、实验原理转基因技术是指将外源基因导入目标生物体基因组中，使目标生物体获得新的性状或功能。
本实验采用农杆菌介导法将目的基因导入水稻中，通过基因重组，使水稻获得抗病、抗虫、抗逆等优良性状。
三、实验材料1. 水稻品种：Oryza sativa L.（籼稻）2. 抗病基因：Xa213. 抗虫基因：Bt蛋白基因4. 抗逆基因：海藻糖合成酶基因5. 农杆菌：Agrobacterium tumefaciens EHA1056. 实验试剂：限制酶、DNA连接酶、质粒、抗生素等四、实验方法1. 目的基因的克隆与构建（1）从基因库中获取抗病基因Xa21、抗虫基因Bt蛋白基因和抗逆基因海藻糖合成酶基因的DNA序列。
（2）利用PCR技术扩增目的基因。
（3）将扩增的目的基因与载体质粒连接，构建重组质粒。
2. 农杆菌转化（1）将重组质粒转化农杆菌EHA105。
（2）将转化后的农杆菌接种于含有抗生素的培养基中，筛选阳性克隆。
3. 转化水稻（1）将阳性农杆菌接种于含有抗生素的培养基中，培养至对数生长期。
（2）将农杆菌与水稻叶片接触，进行转化。
4. 筛选转基因植株（1）将转化后的水稻苗移栽至田间，进行抗性鉴定。
（2）根据抗性表现，筛选出转基因植株。
5. 分子鉴定（1）提取转基因植株的DNA。
（2）利用PCR技术检测目的基因是否整合到水稻基因组中。
五、实验结果1. 成功构建了含有抗病基因Xa21、抗虫基因Bt蛋白基因和抗逆基因海藻糖合成酶基因的重组质粒。
2. 转化后的农杆菌能够将目的基因导入水稻中。
3. 通过抗性鉴定，筛选出具有抗病、抗虫、抗逆等优良性状的转基因水稻。
4. 分子鉴定结果显示，目的基因已整合到水稻基因组中。
六、实验结论本实验成功培育出具有抗病、抗虫、抗逆等优良性状的转基因水稻，为我国水稻育种提供了新的途径。
农杆菌介导法
农杆菌介导的高效水稻遗传转化体系的研究A Highly Efficient Agrobacterium - mediated Rice Transformation Method水稻是基因组研究的模式植物 ,近年来水稻基因组研究取得了很大进展 ,构建了遗传图谱和物理图谱 ,完成了籼稻和粳稻的全基因组草图测2 - 3序 ,以及第 1 号和第 4 号染色体的精细测4 - 5序 ,并对第 10 号染色体的结构进行了详细分析。
在此基础上 ,各实验室大规模地 ,系统地进行水稻功能基因研究 ,普遍采用的研究手段是基因标签技术。
基因标签技术包括 T - DNA 和转座子标签 ,创建大量的基因标签体是功能基因研究的材料平台。
而根癌农杆菌介导的水稻遗传转化是水稻基因标签技术中的重要步骤之一。
本研究完善了根癌农杆菌介导的水稻转化方法 ,以期为水稻功能基因研究提供丰富材料 , 为水稻重要农艺性状的改良开辟途径。
1材料以水稻品种日本晴(Oryza sativa L. ssp.japonica)为试验材料。
菌株类型为 EHA105 超毒力菌株 ,载体为增强子捕获载体 pFX- E24. 2 - 15R(见图 1) ,载体上带有 GUS报告基因、35 S的 CaMV 启动子序列和潮霉素选择标记基因(HYG) 。
农杆菌菌株为EHA105。
2方法2.1水稻愈伤组织的诱导诱导方法参照 HIEI7等。
将日本晴水稻种子去壳 ,用 75 %乙醇灭菌 5min ,再用2. 5 %的次氯酸钠灭菌处理不同时间(40min ,37 min ,30 min 和 25 min) ,以确定最佳灭菌时间 ,灭菌后用无菌水冲洗 6～8 次 ,于 MS 固体培养基上28 ℃避光培养 ,30 d 后 ,将愈伤组织进行继代培养 ,得到胚性愈伤组织。
2.2农杆菌转化愈伤组织用 AB 固体培养基+氯霉素 25 mg/L + 利福平 20 mg/L + AS 20 mg/L培养农杆菌 ,在20 ℃下培养5～6 d。
农杆菌介导水稻遗传转化的相关讨论
农杆菌介导水稻遗传转化的相关讨论农杆菌介导水稻遗传转化相关的讨论羧苄青霉素的作用羧苄青霉素在农杆菌介导法对水稻进行遗传转化的过程中起到抑制农杆菌生长的作用。
根据前人的研究经验，浓度为250mg/L时候抑制效果最好且不会影响愈伤组织的再生。
本实验过程中我们发现，经过经验用量的羧苄青霉素抑制处理，转移至筛选培养基后一周左右即可见到少量愈伤农杆菌复发，有的甚至在第二次筛选时仍然生长出农杆菌，并未达到很好的抑制农杆菌生长的目的。
这有可能是在长期的实验过程和进化过程中，农杆菌对苏氨苄青霉素产生了耐受性。
因此，在遵循不影响愈伤组织生长的原则下，可以适当增加羧苄青霉素的用量，或者与头孢霉素配合使用，可以达到很好的抑制效果。
潮霉素作为筛选剂的最适宜浓度本实验采用潮霉素基因作为筛选标记，经过长期经验积累，发现潮霉素浓度梯度25mg/L,35mg/L和45mg/L进行多轮筛选，假阳性最低，筛选效果最好，为最适筛选浓度。
各个阶段不同添加物的作用水稻遗传转化过程中的碳源有多种选择，主要有葡糖糖，麦芽糖和蔗糖，糖类除作能源外,还可以作为渗透调节剂对愈伤组织的的质量起重要作用。
根据转化受体的不同，碳源的种类和浓度也有区别。
本实验室研究中发现，粳稻作为转化受体时，蔗糖为最佳的碳源，而在籼稻的遗传转化中，麦芽糖和蔗糖配合使用，效果最好。
植物激素是愈伤组织诱导和绿苗分化的关键性因素。
2 ,4-D 的质量浓度至关重要,对于愈伤组织诱导来说,低浓度及高浓度的2 ,4-D 都不适宜水稻成熟胚愈伤组织的诱导。
在籼稻的遗传转化中，2 ,4 -D与6 -BA 配合使用更有利于愈伤组织的诱导及分化。
潮霉素和除草剂均可以作为筛选剂。
适宜的筛选浓度有利有抗性愈伤组织的生长，潮霉素浓度过高，阳性愈伤组织也有可能被筛死，浓度过低，又会有较高的假阳性出现。
实验证明，只用潮霉素筛选所得的抗性愈伤和先用潮霉素筛选后用除草剂筛选所得的抗性愈伤，在分化再生过程中有显著差异。
根癌农杆菌介导的水稻遗传转化
ａ ｖ ｌ经 伤 害处 理 的萌 发 种 子 的离 体 根作 起 始 材 ｉ 小可替代 的 优势 ， 如转 入 的外源 Ｄ Ａ结构 完 整 、 Ｎ 转 ｎ ｔ ｅ 以 ４ ８作筛 选 剂 ， 经农 杆 菌转 化 后 只得 到抗性 化机理 清楚 、 整合 位 点较 稳定 、 贝数 低 、 源 基 因 料 ， Ｇ １ 拷 外 表达 比较稳 定 等 ， 因此人 们 一直 在 探 索单 子 叶植 物 的农 杆 菌介 导 的 遗 传 转 化 技 术 。进 入 ２ ０世 纪 ９ ０ 年代 以后 ， 着人 们 对农 杆 菌侵 染 机 制 的进 步 了 随 愈伤 组 织 。 Ｌ 等 分 析 了 经 农 杆 菌 感 染 后 影 响 ｉ Ｇ Ｓ基 因 瞬 时 表 达 的 因 素 ， 次 使 用 Ｐ ５ — Ｕ — Ｕ 首 ３ Ｓ Ｇ Ｓ Ｉ Ｔ结 构 ，ｄＡ基 因 中插 入 一 个 植 物 内含 子 ， 免 Ｎ ｕｉ 避
ｏ ｂｒ ） 其 目的 是 造 泛 的应 用 。但 单 子 叶植物 ， 其 是 禾本 科 作 物 一 直 ｐ ｎ ａｅ 的成 熟 胚 （ 盾 片 经 切 割 处 理 ， 尤 利 详 ． ， 被认 为不 在农 杆 菌宿 主范 围 以 内 ， 难 以转 化 的物 成伤 害 反 应 ， 于农 杆 菌侵 染 ， 见 ２ ２节 ） 结 果 是 ９ ０年 ， 宝健 李 种 （ｅ ａ ｉａ ｔ ｐｃｅ ） 因 此 最 初 人们 一 直 采 用 非 只得 到 抗 卡 那 霉 素 的 愈 伤 组 织 。１ ９ ｒ ｌ ｔ ｎ ｓｅｉｓ ， ｃ ｃｒ 等 首 次报 道用 酚 类化 合 物 ， 处理 农 杆 菌及 在 共 预 农杆 菌介 导 的方 法对 单 子 叶植 物 进行 遗 传 转 化 ， 其
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植 物 生 理 学 通讯
农杆菌介导的共转化法培育无选择标记转基因水稻的研究进展
ａ ｄＢｏｅ ｎｌ ｙ Ｓ ａ ｄｎ ｒ ｉ ｅ Ｊｎ ｎ ５ １０， ｈｎ ； ． ｅ ａｏａｏ Ｃｏ ｅｅ ｃ ｍ ｒｖｍ ｎ ａ ｄ ｎ ｉ ｃ ｏｏ ， ｈｎ ｏｇＰｏ ｎ ， ｉａ ０ ０ Ｃ ｉ ２ ＫｙＬｂｒｔｒ ｏ ｒ Ｇｎｔ ｐｏｅ ｔ ｎ ｔｈ ｇ ｖｃ ２ ａ ｙｆ ｐ ｉＩ ｅ Ｂｏ ｃｎｌ ｙ Ｈ ａｇ ｕｉａ， ｎ ｔ ｏ Ａ ｒ ｕｔｒ， ｉ ｎ２ ００ Ｃ ｉ ； ． ｏｌ ｅ ｉｅｈｏｏ ， ｕ ｎｈａｈ ｉ Ｍｉ￣ｒ ｆ ｇｉ ｌ ｅ Ｊｎ ５ １０， ｈｎ ３ Ｃｌｇ ｏ ｔ ｇ ｙ ｃ ｕ ａ ａ ｅ ｆ ｃｅ ， Ｓｉ ｅ ｃ ｎ
中图分类号 ：５ １０ ５ ３ ｓ １ ．３ ． 文献标 识号 ： Ａ 文章编 号 ：０ １ ４ ４ （ ０ １ ０ － Ｏ ９ ０ １０ － ９ ２ ２ １ ） ７ ＯＯ － ６
Ａｄｖ ｎ ｅ ｎ Ａｇ ｏ ａ ｔｒｕ —Ｍ ｅ ｉ ｔｄ Ｃｏ — Ｔｒ ｎ ｆ ｒ ａ ｉ ｎ Ｓ ｓｅ ａ ｃ ｓ ｉ ｒ ｂ ｃｅ ｉｍ — ｄａ ｅ — ａ ｓｏ ｍ ｔｏ ｙ ｔ ｍｓ ｆ ｒ Ｍ ａ ｋ ｒ—Ｆｒ ｅ Ｔｒ ｎ ｇ ｎ ｃ Ｒｉｅ ０ ｒｅ ｅ ａ ｓ ｅ ｉ ｃ
行该方面 的研究意义重大 。在遗传转化过程 中， 抗性标 记基 因是筛 选转化体 的有效手段 ， 但也带来 了生态环 境及食品安全方面 的潜在隐患。为培育无选择标记转基 因水 稻 ， 用共转 化无 选择标记 系统 ， 法简单 可采 此方 易行 ， 可操作 性强 ， 尤其是农 杆菌介导的共 转化法 ， 应用较为 广泛 。同时 ， 对获得 的转基因水稻 ， 其生物安全性
Ｓ ａ ｄｎ ｏ ａ ｎ ｅ ｉ ， ｉａ ５０ ４ ｈｎ ； ． ｈ ｉｔ ｄ ｌ Ｓｈｏ ｉ Ｌ ｉｕ Ｌ ｉｕ２ １０ ， ｈｎ ） ｈ ｎｏｇＮ ｒ ｌ ｉ ｒｔ Ｊｎ ｎ２０ １ ，Ｃ ｉ ４ Ｔ ｅＦｒ ｄ ｏｌｎ ａｗ ， ａｗ ７ １０ Ｃ ｉ ｍ Ｕ ｖ ｓｙ ａ ｓ Ｍｉ ｅｃ ａ
水稻遗传转化实验报告
一、实验目的本实验旨在探究农杆菌介导法在水稻遗传转化中的应用效果，通过构建基因表达载体，将目的基因导入水稻细胞中，从而实现基因功能的验证和水稻性状的改良。
二、实验材料1. 实验材料：水稻品种为南桂占，农杆菌菌株为Agrobacterium tumefaciens EHA105，目的基因（GFP基因）载体为pBI121。
2. 试剂：农杆菌转化培养基、抗生素、潮霉素、DNA提取试剂盒、PCR试剂盒等。
3. 仪器：PCR仪、电泳仪、凝胶成像系统、显微镜等。
三、实验方法1. 目的基因的克隆：将GFP基因从质粒载体pBI121中切出，插入到农杆菌载体pBin19中，构建重组载体pBin19-GFP。
2. 农杆菌的活化：将农杆菌菌株EHA105接种于YEB培养基中，在28℃条件下培养过夜。
3. 农杆菌转化：将活化后的农杆菌与重组载体pBin19-GFP混合，用涂布法将混合液涂布于农杆菌转化培养基上，28℃条件下培养2-3天。
4. 水稻叶片的消毒：将水稻叶片用70%酒精浸泡30秒，再用无菌水冲洗3次，然后用无菌滤纸吸干水分。
5. 农杆菌侵染：将农杆菌转化菌液滴加到水稻叶片上，用无菌滤纸轻轻擦拭叶片，使农杆菌均匀分布在叶片表面。
6. 愈伤组织诱导：将侵染后的水稻叶片放入农杆菌转化培养基中，28℃条件下培养5-7天，诱导愈伤组织形成。
7. 抗性筛选：将愈伤组织转入含有潮霉素的筛选培养基中，28℃条件下培养3-4周，筛选出转化成功的愈伤组织。
8. 转化植株再生：将筛选出的转化愈伤组织转入再生培养基中，28℃条件下培养2-3周，诱导再生植株。
9. 抗性鉴定：将再生植株种植于田间，对植株进行潮霉素筛选，筛选出抗潮霉素植株。
10. PCR检测：对筛选出的抗潮霉素植株进行PCR检测，验证GFP基因是否成功导入水稻基因组。
四、实验结果1. 目的基因的克隆：成功构建了重组载体pBin19-GFP。
2. 农杆菌转化：农杆菌转化效率较高，大部分叶片出现愈伤组织。
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农杆菌介导水稻遗传转化相关的讨论
羧苄青霉素的作用
羧苄青霉素在农杆菌介导法对水稻进行遗传转化的过程中起到抑制农杆菌生长的作用。
根据前人的研究经验，浓度为250mg/L时候抑制效果最好且不会影响愈伤组织的再生。
本实验过程中我们发现，经过经验用量的羧苄青霉素抑制处理，转移至筛选培养基后一周左右即可见到少量愈伤农杆菌复发，有的甚至在第二次筛选时仍然生长出农杆菌，并未达到很好的抑制农杆菌生长的目的。
这有可能是在长期的实验过程和进化过程中，农杆菌对苏氨苄青霉素产生了耐受性。
因此，在遵循不影响愈伤组织生长的原则下，可以适当增加羧苄青霉素的用量，或者与头孢霉素配合使用，可以达到很好的抑制效果。
潮霉素作为筛选剂的最适宜浓度
本实验采用潮霉素基因作为筛选标记，经过长期经验积累，发现潮霉素浓度梯度25mg/L,35mg/L和45mg/L进行多轮筛选，假阳性最低，筛选效果最好，为最适筛选浓度。
各个阶段不同添加物的作用
水稻遗传转化过程中的碳源有多种选择，主要有葡糖糖，麦芽糖和蔗糖，糖类除作能源外,还可以作为渗透调节剂对愈伤组织的的质量起重要作用。
根据转化受体的不同，碳源的种类和浓度也有区别。
本实验室研究中发现，粳稻作为转化受体时，蔗糖为最佳的碳源，而在籼稻的遗传转化中，麦芽糖和蔗糖配合使用，效果最好。
植物激素是愈伤组织诱导和绿苗分化的关键性因素。
2 ,4-D 的质量浓度至关重要,对于愈伤组织诱导来说,低浓度及高浓度的 2 ,4-D 都不适宜水稻成熟胚愈伤组织的诱导。
在籼稻的遗传转化中，2 ,4 -D与6 -BA 配合使用更有利于愈伤组织的诱导及分化。
潮霉素和除草剂均可以作为筛选剂。
适宜的筛选浓度有利有抗性愈伤组织的生长，潮霉素浓度过高，阳性愈伤组织也有可能被筛死，浓度过低，又会有较高的假阳性出现。
实验证明，只用潮霉素筛选所得的抗性愈伤和先用潮霉素筛选后用除草剂筛选所得的抗性愈伤，在分化再生过程中有显著差异。
前者分化出芽所
需时间较短，后者分化出的苗较健壮。
一定范围内，在共培养时添加较高浓度的乙酰丁香酮可提高转化频率, 当乙酰丁香酮浓度提高到300～400 u mo l/L 时, 转化频率明显高于较低浓度乙酰丁香酮的转化率。