动物免疫学实验技术-免疫电镜技术
《实验动物学》习题(含参考答案)
《实验动物学》习题（含参考答案）一、单选题（共30题，每题1分，共30分）1、根据我国国家技术监督局发布的实验动物环境设施监测标准,小鼠、大鼠动物实验实施(使用型)环境指标(静态)工作照度和动物照度是( )。
A、100~300 lx,150~200 lxB、150~300 lx,100~200 lxC、150~300 lx,15~20 lxD、100~200 lx,15~20 lx正确答案：C2、小型猪的妊娠期为( )天左右。
A、114B、124C、104D、134正确答案：A3、( )的视力很差且红、绿色盲。
A、犬B、小鼠C、大鼠D、地鼠正确答案：A4、KM 小鼠属于( )动物。
A、杂交群动物B、SPF 动物C、近交系动物D、封闭群动物正确答案：D5、除清洁动物应排除的病原外,不携带主要潜在感染或条件致病和对科学实验干扰大的病原的动物是( )。
A、普通级动物B、无菌动物C、清洁动物D、无特定病原体动物正确答案：D6、根据我国国家技术监督局发布的实验动物环境设施监测标准,犬、兔繁育、生产设施(生产型) 普通环境指标中,(静态)温湿度是( )。
A、温度20~26℃、相对湿度 40-70%B、温度20~26℃、相对湿度 50-60%C、温度16~28℃、相对湿度 50-60%D、温度16~28℃、相对湿度 40-70%正确答案：D7、病毒没有下面哪种抵抗力 ( )A、病毒对低温的抵抗力强B、酸碱的抵抗力差异不大C、大多数病毒能保存于 50%甘油中D、所有病毒对电磁辐射都敏感正确答案：B8、实验动物饲料中蛋白质由氨基酸组成,饲料中的蛋白质必须分解成氨基酸,才能被吸收。
动物体内不能合成或合成速度及数量不能满足正常生长需要,必须由饲料供给氨基酸,它是( )。
( )A、动物性氨基酸B、植物性氨基酸C、非必需氨基酸D、必需氨基酸正确答案：D9、流行病学观察表明,污染尘埃飞沫物形成( )吸入感染被认为是流行性出血热最主要的传播途径。
最新动物病原微生物常用的鉴定方法
最新动物病原微生物常用的鉴定方法介绍本文档旨在介绍最新动物病原微生物常用的鉴定方法，帮助读者了解和应用这些方法来准确检测和诊断动物病原微生物。
1. 培养基鉴定法培养基鉴定法是一种常见且可靠的鉴定方法。
通过在特定培养基上培养动物病原微生物，并观察其生长特征、形态和生理特性来进行鉴定。
常用的培养基鉴定方法包括革兰氏染色、生化试验和常见微生物培养基的使用。
2. 分子生物学方法分子生物学方法是一种快速和准确的鉴定方法，可用于检测和鉴定动物病原微生物的遗传特征和基因序列。
常用的分子生物学方法包括聚合酶链式反应（PCR）、序列分析和DNA芯片技术。
这些方法可以提供高度特异性和敏感性的鉴定结果。
3. 免疫学方法免疫学方法是利用动物病原微生物与宿主免疫系统之间的相互作用进行鉴定的方法。
常用的免疫学方法包括免疫荧光、酶联免疫吸附试验（ELISA）和免疫电镜技术。
这些方法可以检测和鉴定动物病原微生物的抗原和抗体。
4. 其他鉴定方法除了上述方法，还有一些其他的鉴定方法可用于动物病原微生物的检测和鉴定。
例如，质谱法、核酸杂交和电泳技术等。
这些方法可以根据需要选择和应用，以提高动物病原微生物的鉴定准确性和可靠性。
结论在动物病原微生物鉴定中，培养基鉴定法、分子生物学方法和免疫学方法是常用且可靠的方法。
根据不同的实验需求，可以选择合适的鉴定方法来准确检测和诊断动物病原微生物。
此外，不断研究和了解最新的鉴定方法也是提高鉴定准确性的关键。
以上是对最新动物病原微生物常用的鉴定方法的简要介绍，希望能帮助读者更好地了解和应用这些方法。
如需更详细的信息，请参考相关文献和研究。
全国执业资格考试-基础科目知识整理-动物卫生检疫学
动物卫生检疫学1、某种传染病，潜伏期1-7天，能引起偶蹄动物的急性、热性、高度接触性传染。
主要特征是口腔黏膜、蹄部、乳房皮肤发生水泡和烂斑。
此种病疑似为：口蹄疫2、某种由杆菌引起的人畜共患的急性、热性、败血性传染病，临床特征为突然发生高热，可视粘膜发绀，天然孔出血，这种疾病可初步诊断为：炭疽病3、由病毒引起猪的一种急性、热性、高度传染性和致死性疾病，其特征为稽留热、皮肤局部广泛出血，解剖月回盲辨有纽扣状溃疡，此种病可能是：猪瘟4、由病毒引起的以母猪的繁殖障碍和仔猪的呼吸道症状为主要特征的一种急性传染病，会给养猪业带来巨大损失，其高致病性疫病能导致仔猪100%发病，50%以上死亡，母猪30%以上流产。
发病猪体温可达41℃以上。
此种病可能是：猪繁殖与呼吸综合症（蓝耳病）5、由疾病引起胆汁代谢障碍而造成的全身皮肤、脂肪、粘膜、巩膜、关节囊液均显黄色、肝胆多有病变，放置越久，颜色越深，称为黄疸肉。
6、猪的正常肛门体温是38-40℃。
7、猪的正常脉搏数是60-80次/分钟。
8、猪的正常呼吸数为10-30次/分钟。
9、牛的正常肛门体温为37.5-39.5℃。
10、牛的正常脉搏为40-80次/分钟。
11、牛的正常呼吸为10-25次/分钟。
12、疫区内易感动物的处理是：禁止运营13、禁止经营的动物是：疫区内所以动物14、畜禽在运输途中发病应采取：与当地检疫部门联系卸载处理15、随着我国动物防疫检疫法律、法规体系的不断完善和兽医行政管理、行政执法、技术支撑体系的形成发展，运输检疫和市场检疫-纳入了日常动物卫生监管的范畴。
16、动物检疫的管理相对人如认为检疫结果处理不公正、不合法，可依法：提起行政诉讼17、动物检疫人员在实施检疫行为时依法检查的若干事项，称为法定的检疫：项目18、法律、法规或规章规定的必须检疫的动物疫病（传染病和寄生虫病）称为法定的检疫：对象19、国务院畜牧兽医行政管理部门依照动物检疫法律、行政法规的规定制订的行业标准和国家标准化行政管理部门依法制定的国家标准称法定的检疫：标准。
兽医免疫学试题库
兽医免疫学模拟试题填空题一
.弱毒活疫苗注入动物机体后，既可以诱导17体液，细胞
又可以诱导____________________ 免疫应答，_
免疫应答。
单项选择题-
-、单项选择题答案
多项选择题
名词解释四
问答题五
9.举例说明间接ELISA方法的主1.基本原理：把抗原在不损坏其
要原理、试验步骤及结果判定方免疫活性的条件下预先结合到某
种固相载体表面；测定时，将受检样品
和酶标记物按一定程序反
应形成复合物，并加入酶作用的底物;
反应终止时，根据定性或定量分析有色
产物的量来确定待检样品中的抗体的
含量。
2.试验步骤：抗原包被一洗涤封闭f
加待检血清（同时设立阴阳性对照）一
反应一定时间一洗涤一加酶标二抗f
反应一定时间f洗涤f加底物溶液f
反应一定时间f 终止反应f判定结果
3.结果判定：肉眼观察或仪器测定，
可以阳性与阴性表示结果、以P/N比值
表示结果、以终点滴度表示结果或以标
准曲线进行定量测定。
兽医微生物学-病毒的检测
（1）间接ELISA
（2）夹心ELISA
五、分子生物学技术
3′
1、聚合酶链反应 5′
（PCR）
3′
5′
3′ 5′
5′
3′ 3′
3′ 5′ 3′ 5′
5′
模板DNA双链
3′
5′
变性
3′
5′
5′
退火
3′
5′
3′
形成新的双链 5′ DNA
3′
2、核酸杂交技术
核酸探针（probe）是指能与特定 核酸序列发生特异性互补的已知 核酸片段，可检测待检样品中特 定的基因顺序。
免疫电镜技术是将抗原抗体反应的特异 性与电子显微镜的高分辨力相结合，在 亚细胞和超微结构水平上对抗原物质进 行定位分析的一种高度精确、灵敏的方 法。
（1）免疫凝集电镜技术
抗原与抗体凝集反应后，可使标本 中病毒颗粒聚集成团，再经负染直 接在电镜下观察，提高了敏感性， 确定病毒的血清学性质。
（2）免疫电镜定位技术
（二）病毒鉴定
1、形态学鉴定
观察CPE。常见的细胞形态学变化为细 胞变圆、坏死、溶解、脱落或形成合胞 体。有些病毒能形成包涵体。
正常细胞
病变细胞
2、 血吸附和血凝作用 多见于以出芽方式释放的病毒。 • 感染细胞具有吸附红细胞的能力 • 感染细胞的培养液中有许多游离病
毒存在，具有凝集红细胞的作用
（1）血吸附作用
（一）病毒分离的一般程序
标本采集
杀灭杂菌
（青、链霉素）
三大方法
易感动物→出现病状 鸡胚→病变或死亡 细胞培养→细胞病变
接种
鉴定病毒种型 (血清学方法)
•无菌标本(脑脊液、血液)可直接接种 •器官或组织，取小块剪碎后研磨制成10～20%悬 液（内含抗生素）离心后，取上清接种； •粪便、尿、感染组织或昆虫等污染标本在接种前 先用抗生素处理，杀死杂菌。
现代生物技术在植物检疫中的作用
现代生物技术在植物检疫中的作用摘要：本文阐述了免疫学技术中的酶联免疫法、免疫荧光技术、斑点免疫法、免疫电镜技术、免疫染色标记技术及其他抗体介导的检测方法、核酸技术中的核酸探针、RFLP技术、PCR技术等的在植物检疫中的应用原理及优缺点。
关键词：免疫学技术；核酸技术；植物检疫随着我国动植物产品进出口贸易的日益增多，传统的检测手段已不能满足植物检疫需要，检疫手段的优化迫在眉睫，近年来在免疫学、分子生物学等领域取得了巨大的进步，为全面优化检疫手段，加快检测速度打下了坚实基础。
1 免疫学技术1.1 酶联免疫法自酶联免疫吸附技术问世以来，已日益广泛应用于植物病毒、真菌、MID等的检测之中，如病毒方面，对种子中的大豆花叶病毒(SMV)、苜蓿花叶病毒(AMV)、大麦条纹花叶病毒(BSMV)、烟草花叶病毒(TMV)、黄瓜花叶病毒(CMV)、烟草环斑病毒(TRSV)、等病毒的诊断和检测；真菌方面，疫霉、腐霉、黑盘菌、等真菌的ELISA试剂盒已被商业化生产，并已广泛应用。
利用上述ELISA试剂盒检测大豆根茎组织、土壤悬浮液中的大豆疫霉菌；土壤中大豆疫霉的游动孢子、卵孢子和菌丝；病组织中隐地疫霉；灌溉水中的疫霉游动孢子，效果都很好[1]。
1.2 免疫荧光技术免疫荧光技术是另一种以抗体为基础的在植物病害检疫中具有重要应用价值的检测手段，现已成功应用于植物组织、种子及土壤中细菌及真菌的检测。
利用免疫光技术成功的检测出菜豆萎蔫病菌，并且检测的灵敏度达到4.5×lO4cuf ／mL，有效地解决了假阳性反应问题。
此外，免疫荧光技术在检测土壤根组织的辣阑疫霉菌丝、土壤中樟疫霉游动孢子、瓜果疫霉游动孢子、叶组织中灰葡萄孢；病土、根组织中芸苔根肿菌休眠孢子；根组织中菌丝的厚垣孢子、组织切片中菌丝均取得了ELISA无法达到的效果。
免疫荧光技术具有间接和直接免疫荧光法，其中间接免疫荧光法在实践中用途较广，一抗与结合有荧光色素的二抗结合，所发出的荧光可由免疫荧光显微进行检测，如利用免疫光技术可在显微镜下检测出结合有荧光色素抗体的细菌阳性细胞，免疫荧光技术检测的灵敏度一般约为lO3～lO5 cfu／mL，不仅对每个荧光细胞可以记数，而且可以观察有关细胞的形态特征。
实验动物学考试题(附答案)
实验动物学考试题（附答案）一、单选题（共60题，每题1分，共60分）1、寄生虫的成虫和幼虫往往寄生于不同的宿主，我们把成虫寄生的宿主称作________。
( )A、终末宿主B、带虫宿主C、中间宿主D、第一宿主正确答案：A2、小鼠与大鼠尾静脉注射时，不恰当的方法是 ______。
( )A、尾部用70~80℃的热水浸润几分钟使血管扩张B、用75%酒精棉球反复擦拭，使血管充盈C、针头尽量采取与尾部平等的角度进针D、要从尾末端处刺入正确答案：A3、操作简便，麻醉过程较平稳，常用的麻醉方法是 ______。
( )A、肌肉注射B、腹腔和静脉给药法C、皮下注射法D、吸入法正确答案：B4、细菌的化学组成中，________占主要成分。
( )A、碳水化合物B、蛋白C、水D、脂肪正确答案：C5、环境中________浓度过高可促进支原体的生长，继而促进肺炎和中耳炎的发生。
( )A、二氧化硫B、二氧化碳C、氧D、氨正确答案：D6、适合观察药物对循环系统的作用机制分析的实验动物 ______。
( )A、小鼠B、豚鼠C、兔D、猫正确答案：D7、研究人类基因功能最理想的模式动物是 ______。
( )A、小鼠B、豚鼠C、大鼠D、犬正确答案：A8、豚鼠属于________。
( )A、扁形动物门B、环节动物门C、脊椎动物门D、节肢动物门正确答案：C9、哪个不是通常认为的模式动物 ______。
( )A、大鼠B、小鼠C、班马鱼D、果蝇正确答案：A10、一般小鼠的寿命为______年。
( )A、6B、4C、5D、1-2正确答案：D11、长期毒性试验大动物一般选 ______。
( )A、猴B、猪C、兔D、Beagle犬正确答案：D12、羊属于______。
( )A、爬行纲B、哺乳纲C、食肉目D、奇蹄目正确答案：B13、普通级实验猴需要排除的病毒是______。
( )A、淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒B、仙台病毒C、猴B病毒D、汉坦病毒正确答案：C14、专用于新药临床前安全性评价的法规是 ______。
免疫组化试题参考答案
免疫组化试题参考答案免疫组织化学试题参考答案一、名词解释：1.PAS反应：即过碘酸--雪夫反应显示糖原，简称PAS反应。
其原理是通过利用过碘酸的氧化作用，使糖分子中的二醇基氧化为二醛基，释放出醛基，与碱性品红反应，生成紫红色化合物沉淀。
2.Feulgen法：即福尔根反应显示DNA法。
其原理是组织用1NHCl 60℃水解，将DNA分子中脱氧核糖核酸与嘌呤间的连链打开，使之释放出醛基与碱性品红发生反应，生成紫红色化合物沉淀。
3.PAP法：即过氧化物酶一抗过氧化物酶法，该技术原理与其他免疫定位技术相同，即通过抗体使标记分子（抗辣根过氧化物酶）定位于抗原附件。
其不同点为三步法，且有放大作用，反应彻低依靠于免疫学结合，不需要标记任何抗体，反应敏捷度高，背景低。
注重一抗与复合物中的抗体必需来源于同一种动物，且二抗必需过剩。
4.核酸探针：指能与特定核酸序列发生特异性互补的已知标记的核酸片段，可检测待测样品中特定的基因序列。
无标记的探针称裸探针。
5.核酸分子杂交：指具有互补序列的两条核酸单链在一定条件下按碱基配对原则形成双链的过程。
杂交的双方分离为待测的核酸序列和已知核酸序列，后者通常用核素或非核素示踪标记，称为探针（probe），杂交后形成的异源双链分子称为杂交分子。
6.质量控制：指组织化学反应各环节中获得最佳效果的技术掌握，是组织化学的关键环节，是取得惬意效果的须要条件，是提高结果可信度的根本保证。
7.诱发荧光：组织细胞中的某些物质本身不发荧光，但在经过一定的化学反应后可以改变成荧光分子。
此技术目前主要应用在生物胺的显示中。
其中最重要的是甲醛和乙醛酸诱发多巴胺、去甲肾上腺素、肾上腺素和5—羟色胺荧光，以及邻苯二醛诱发组织胺荧光的反应。
8.定量分析：定量推断是结果推断中最重要也是具故意义的推断，其推断结果有助于统计学的分析处理。
组织细胞化学结果的定量分析又称定量组织细胞化学，指在组织细胞化学阳性结果的基础上，对阳性结果（终于阳性产物）举行测量，以数值反应被检测物质的含量。
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第十四章免疫电镜技术(Immune electron microscopy technique)一、概述（一）原理免疫电镜技术是免疫化学技术与电镜技术结合的产物，是在超微结构水平研究和观察抗原、抗体结合定位的一种方法学。
它主要分为两大类：一类是免疫凝集电镜技术，即采用抗原抗体凝集反应后，再经负染色直接在电镜下观察；另一类则是免疫电镜定位技术。
该项技术是利用带有特殊标记的抗体与相应抗原相结合，在电子显微镜下观察，由于标准物形成一定的电子密度而指示出相应抗原所在的部位。
免疫电镜的应用，使得抗原和抗体定位的研究进入到亚细胞的水平。
（二）影响免疫电镜的一些因素1．标记物用于电镜观察的标记物有三类：一类是电子密度致密的标记物，如铁蛋白、辣根过氧化物酶等。
另一类则是放射性同位素，如135I、35S、32P、14C、3H等，第三类则是有独特形状的标记物，如血兰蛋白、噬菌体等。
对标记物的要求是：具有特定的形状、不影响抗原抗体复合物的特性与形状。
目前用于免疫电镜的标记物主要是铁蛋白和HRP。
两者各有其优点，铁蛋白电子密度致密。
观察时反差大，优于酶标记，但铁蛋白分子量大(460 000)，穿透能力差，所以适于细胞表面抗原的定位，另外铁蛋白的标记过程比较复杂。
HRP分子量小(40 000)，穿透力强，有利于标记抗体进入细胞内，适于细胞内的抗原定位。
2．固定剂固定是免疫电镜较关键的一步，免疫电镜中的固定与一般超薄切片中的固定的不同之点在于既考虑保存细胞的超微结构,又要考虑到抗原的失活性问题。
（1）固定剂的要求：①不损害细胞内抗原的活性；②固定速度快、效果好；③分子量小，易于渗透；④固定后,不引起交联，造成空间的阻碍，影响标记抗体进入抗原位。
• 1 •（2）影响固定的因素有：①采用固定剂的种类；②固定剂的浓度，浓度过大，对抗原的活性有影响，浓度过小，固定效果差；③固定剂的pH；④固定剂的温度,一般采用2℃～4℃冷固定；这样能降低细胞的自浴作用和水分的抽提；⑤固定时间与温度有关，温度高，固定快，也与缓冲系的离子强度有关，离子强度大，渗透压大，穿透力强，固定要快。
不同的固定剂，或同一固定剂的不同浓度所需的固定时间也不一致；⑥与被固定的细胞类型有关。
目前常用的固定系统有：4%聚甲醛，1.5%～2%戊二醛，1%多聚甲醛＋1%戊二醛，4%多聚甲醛＋0.5%苦味酸＋0.25%戊二醛，96%乙醇＋1%醋酸。
不论采用哪些系统，使用前必须用已知效价的抗原做一系列预实验。
如固定剂的种类浓度、温度、pH及固定时间等。
然后做出预处理的效价，作为失活参考以再选择最适条件。
3．非特异性吸附非特异性吸附与酶标抗体、抗血清的稀释度、染色时间，温度及介质等有关，其中最主要的是抗血清及标记抗体的稀释。
一般认为高效价抗血清或标记抗体稀释到低蛋白浓度，用于标记染色可获得最理想的结果。
因为低蛋白浓度有利于降低非特异性吸附。
实际应用的蛋白浓度大致在0.50mg/ml～2mg/ml。
工作效价一般在1︰20～1︰400,在实际工作中，将标记抗体或抗血清稀释到1︰100倍以上则可获得理想的阳性结果，而非特异性吸附必然降得很低。
工作浓度的选择是将标记抗体或抗血清作1︰2、1︰4、1︰8……1︰256的稀释，做已知阳性标本的标记染色观察，取其阳性沉积物明显，而非特异性吸附最低的一稀释度做为工作浓度。
4．标记染色法标记染色法分为直接染色法与间接染色法两种。
前者的特点是特异性较高,敏感性低，标记抗体只能用于检测一种抗原。
后者敏感性较强，一种标记抗体可用于多种抗原的检测。
缺点是特异性较差。
二、酶免疫电镜技术（一）原理酶免疫电镜技术是利用酶的高效率的催化作用对其底物的反应形成不同的电子密度，借助于电子显微镜观察，证明酶的存在，从而对抗原进行定位。
（二）材料与试剂1．PBS液取NaCl 8.5g，Na2HPO40.85g，KH2PO40.54g，加水至1 000ml即• 2 •可。
2．DAB溶液取5mgDAB(3、3二氨基联苯胺)加入10mlTris－HCl缓冲液(0.05mMol/L pH 7.6)，加1%H2O20.5ml～1ml。
配制时，避光进行，现用现配。
在显色完成冲洗过程中，要保持流水冲洗，防止非特异性物质积于标本上。
3．戊二醛固定液取50ml 0.2Mol/L PBS缓冲液与25%戊二醛按以下比例配制：0.2Mol/LPBS液50 50 50 50 5025%戊二醛（ml） 4 6 8 10 12重蒸馏水（ml）46 44 42 40 28固定液终浓度（%） 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0（三）操作方法1．酶标抗体的制备疫酶技术章。
2．取材将培养细胞或悬浮细胞用0.1Mol/L PBS液冲洗，离心沉淀后，立即转入固定液(2%甲醛液或2%戊二醛液均可)pH 7.2，4℃固定5min～30min(依抗原性质所定)。
如病料为组织块，则取适当大小，先固定1h然后取出，以新的双面刀片切成50～100µm的薄组织再行固定1h～2h。
3．漂洗以PBS液漂洗过夜，换液3～4次。
4．血清孵育，25℃1h或4℃过夜，孵育的标本放置于加盖的瓷盘内，底层垫数层纱布。
防止抗血清干燥凝固，不易洗脱，造成非特异性吸附。
5．PBS冲洗3～4次，每次10min。
6．2.5%戊二醛再固定15min～30min。
7．PBS液冲洗3～4次每次10min。
8．酶标记抗体孵育；用适当稀释的酶标抗体(即工作浓度)于25℃湿盆内孵育1h或4℃过夜。
9．PBS液冲洗3～4次每次10min或4℃漂洗过夜。
10．酶显色处理将漂洗后的标本浸入DAB－H2O2底物溶液中，20℃，10min～30min。
显色强弱与戊二醛的固定有关。
若显色弱则可减少甚至取消戊二醛的固定时间。
冲洗时必须注意防止非特异漂浮的沉积。
11．常规包埋、切片、电镜观察在经过脱水包埋确定抗原性不致引起失活的前提下可在包埋切片后做标记染色，切片一般在2µm～4µm，切片后染色不存在通透困难的问题。
无论在标记染色后切片还是在切片后标记染色，最好在光镜下定位选择后，再做电镜定位包埋，这样目的性强，可减少工作量。
（四）结果判定在已知阳性、阴性样品成立的前提下，凡出现棕色颗粒，即指示抗原抗体的存• 3 •在，同时可观察到病毒颗粒的存在，判为阳性(＋)，否则判为阴性(－)。
三、铁蛋白免疫电镜技术（一）原理免疫铁蛋白技术是以铁蛋白标记抗体，再以铁蛋白抗体与待检抗原作用。
通过电镜检查，观察到铁蛋白抗体所在的位置，即抗原所在。
（二）材料与试剂1．马脾铁蛋白2．硫酸铵3．硫酸镉4．双异氰酸镉二甲苯(Metaxylene dlisocyante XC)以0.30Mol/L pH 9.5硼酸盐缓冲液将XC配制成1%溶液。
注意配制的水及容器必须特别清洁，配制后放置4℃数天，以不出现沉淀为准。
如出现沉淀XC的多聚体形成，应重配。
5．0.30Mol/L pH 9.5硼盐酸缓冲液6．0.1Mol/L硫酸铵液7．0.05Mol/L pH 7.4 PBS液（三）操作方法1．铁蛋白的提取⑴配制2%硫酸铵液，并以1Mol/L的NaOH或HCl调pH值，正好为5.85。
取1g铁蛋白溶于100ml的2%硫酸铵液中。
⑵加入20%硫酸镉，使最终浓度为5%，混匀，4℃过夜。
⑶ 1 500g离心(4℃)2h，去上清。
仍加2%硫酸铵至100ml，混匀，离心，去除不纯沉渣。
⑷于上清液中重新加入20%硫酸镉，重复步骤⑵，离心，去上清。
⑸检查沉渣，置显微镜下检查，应具有典型的黄褐色结晶，结晶为六角形，双一四点结构，如结晶不典型，应继续重复以上步骤。
⑹以少量的蒸馏水溶解，再加50%饱和硫酸铵溶液，使之沉淀，离心，去上清。
⑺重复步骤⑹一次。
⑻以少量蒸馏水溶解,常水透析24h后,以0.05Mol/L pH 7.5PBS透析24h。
• 4 •⑼100 000r/min离心2h，去除上部无色上清液(约3/4总量)，置4℃过夜。
⑽用微孔滤膜(孔径0.45μ)过滤，使铁蛋白含量为65mg/ml～75mg/ml，分装，4℃保存不要冻干保存,以免铁蛋白结构遭破坏。
2．铁蛋白－抗体交联法⑴以0.3Mol/L pH 9.5硼酸盐缓冲液将铁蛋白稀释成20mg/ml～25mg/ml。
⑵以1︰1000(W/W)的比例加入XC液室温搅拌45min，离心去沉淀。
⑶以0.3Mol/L pH 9.5硼酸盐缓冲液将提纯lgG配成5mg/ml，以1︰4的比例(V/V)加入IgG与铁蛋白－XC液，4℃搅拌48h。
⑷以0.1Mol/L碳酸铵溶液透析过夜，以除去多余的异氰酸盐，再以0.05Mol/l pH 7.5 PBS透析，使pH值恢复到生理水平。
⑸超速离心以1.00×105g离心5h，去上清，沉淀以0.05Mol/L PBS悬浮，再次离心，以除去未结合的IgG。
⑹以血清学及免疫学方法测定结合抗体的特异性、免疫活性以及标记效应，如果操作步骤严格，结果是满意的。
3．铁蛋白－抗体结合物处理标本（1）将标本以5%福尔马林pH 7.2(4℃)PBS液固定40min～60min。
（2）用冷的PBS液洗涤，离心。
（3）如是组织块，则在解剖显微镜下切成更小块，放入试管中，加入铁蛋白－抗体结合物置室温20min，不时振荡,（4）以冷PBS液洗涤三次，离心。
（5）沉淀以2.5%戊二醛固定20min，以PBS洗涤。
（6）再以锇酸固定，脱水包埋。
也可以先超薄切片，再进行铁蛋白－抗体结合物染色。
操作如下：⑴将培养细胞以1%福尔马林PBS液固定(4℃)。
⑵PBS液洗涤离心。
⑶以0.5ml,30%牛血清蛋白PBS液悬浮置入胶透析膜袋中，再将袋置于吸水剂粉末上，待牛血清白蛋白成胶状物时，将透析袋移至2%戊二醛PBS液（pH7.5）中固定3h。
⑷取出，切成小块，以PBS液洗涤。
⑸置干燥器中以硅胶干燥。
⑹包埋、切片、在水上收集切片置于经4%牛血清白蛋白PBS液处理的披有胶膜的载网上(牛血清白蛋白的处理在于减少铁蛋白结合物非特异性吸附于载网上)。
⑺滴一滴铁蛋白－抗体结合物于载网上。
• 5 •⑻5min后，浮网于PBS液面,标本面向下，以除去多余的结合物。
⑼凉干后，滴一滴乙酸双氧铀或氢氧化铅以复染。
⑽水洗、晾干、电镜观察。
（四）结果判定在已知对照样品成立的前提下，凡是出现黑色的铁分子颗粒即表示抗原的存在，判定阳性(＋)，否则判为阴性(－)。
四、非标记抗体免疫电镜技术（一）原理标记抗体法虽然具有许多优点，但也存在一些难以克服的问题，如标记抗体的分子增大，对细胞膜和组织的穿透力减弱；化学交联反应对抗体和酶的活性有所影响；结合物中未标记的抗体可与抗原竞争结合，影响检测方法的敏感性等。
不标记抗体法可以避免上述的不利影响因素，通过一系统的非标记抗体的免疫学反应，对组织中的抗原进行定位检测。