免疫实验学技术
免疫学实验方法
免疫学实验方法免疫学实验方法是免疫学研究的重要部分，它通过一系列的技术手段来识别、分析免疫系统中的各种生物分子、细胞和组织，以及它们之间的相互作用。
这些方法在免疫学领域广泛应用于疾病诊断、药物研发、疫苗研究等方面，对促进免疫学的发展和应用发挥了重要作用。
下面将介绍一些常用的免疫学实验方法。
一、ELISA法ELISA（酶联免疫吸附试验）是一种用于检测抗体或抗原的免疫学实验方法。
该方法通过将待测抗体或抗原与固相物质结合，再加入酶标记的二抗来进行标记，最后通过酶底物的底物变色反应或荧光底物的发光反应来检测待测抗体或抗原的存在量。
二、流式细胞仪流式细胞仪是一种用于分析和计数悬浮细胞的仪器，它利用激光照射细胞，通过细胞膜上的特异性抗体标记来检测细胞的表面标记物和内部细胞器的性质和分布，对免疫细胞的表型和功能进行高效的分析。
三、免疫印迹法免疫印迹法是一种用于检测蛋白质的免疫学实验方法，通过电泳将待测蛋白分离，再将其转移到膜上，最后使用特异性抗体和标记的二抗来检测待测蛋白的存在量和大小。
四、免疫组化法免疫组化法是一种用于检测组织中特定蛋白的免疫学实验方法，通过将组织切片后进行脱水、脱脂和脱水处理，再使用特异性的抗体来标记待测蛋白，并观察标记物的颜色变化或发光情况来确定蛋白的位置和表达量。
五、免疫沉淀法免疫沉淀法是一种用于检测蛋白相互作用的免疫学实验方法，通过将待测抗体与蛋白结合，再使用蛋白A/G琼脂糖或磁珠等材料将蛋白抗原免疫沉淀下来，最后使用核酸酶或质谱技术来分析蛋白的互作关系。
以上介绍的是一些常用的免疫学实验方法，它们在免疫学研究中起着举足轻重的作用，不仅在科研领域有重要应用，同时在临床诊断和治疗中也有着广泛的运用。
希望以上内容能够对您有所帮助。
常用免疫学检验检测技术
要点一
总结词
要点二
详细描述
蛋白质分析的常用技术
免疫印迹技术是一种用于分离、检测和识别蛋白质的常用 技术。该技术通过将蛋白质混合物在凝胶上进行电泳分离 ，然后将其转移到膜上，再与特异性抗体结合，最后通过 显色反应检测目标蛋白质。免疫印迹技术具有高灵敏度、 高特异性和可同时检测多个蛋白质的特点，广泛应用于生 物学、医学和生物工程领域。
注意事项
由于放射性同位素具有放射性，操作过程中需要注意安全防护，避免对操作人员和环境造成污染。同 时，由于放射免疫分析需要使用放射性同位素标记的抗原，因此成本较高。
优缺点分析
优点
放射免疫分析具有较高的灵敏度和特异性， 可以用于痕量物质的定量检测；操作简便， 易于自动化；测量结果准确可靠。
缺点
由于使用放射性同位素，操作过程中存在安 全风险；成本较高，需要特殊仪器和实验室 条件；对于某些样品，可能存在交叉反应或 非特异性干扰。
化学发光免疫分析（CLIA）
总结词
快速、高灵敏度的定量检测技术
详细描述
化学发光免疫分析是一种基于化学发光反应 的免疫分析技术，通过测量化学发光反应过 程中释放的光子数量来检测抗原或抗体的浓 度。该技术具有快速、高灵敏度和低背景干 扰的优点，广泛应用于传染病、肿瘤标志物
和激素等生物分子检测领域。
免疫印迹技术（Western Blot）
05
其他常用免疫学检验检测技术
时间分辨荧光免疫分析（TRFIA）
总结词
高灵敏度、高特异性的定量检测技术
详细描述
时间分辨荧光免疫分析是一种基于荧光能量共振转移的免疫分析技术，通过测量荧光标 记物的发射光谱来检测抗原或抗体的浓度。该技术具有高灵敏度、高特异性和低背景干
细胞和分子免疫学实验技术
细胞和分子免疫学实验技术细胞和分子免疫学是研究免疫系统的重要领域，它涉及到细胞和分子水平上的免疫反应和免疫调节机制。
在这个领域中，实验技术是非常重要的工具，通过这些技术可以深入了解免疫系统的功能和调控。
本文将介绍一些常用的细胞和分子免疫学实验技术。
1. 细胞培养技术细胞培养是研究细胞生物学和免疫学的基础。
通过细胞培养技术，可以获得大量特定类型的细胞，用于研究其生物学特性和免疫功能。
常用的细胞培养技术包括细胞传代、细胞培养基的配制和细胞培养条件的优化等。
2. 免疫细胞分离技术免疫细胞分离技术是将不同类型的免疫细胞从混合细胞群中分离出来，以便进行单个细胞的研究。
常用的免疫细胞分离技术包括磁珠分离法、流式细胞术和细胞排序术等。
3. 免疫组化技术免疫组化技术是通过使用特异性抗体标记目标蛋白质，以观察其在细胞或组织中的分布和表达水平。
该技术可以用于检测免疫细胞表面标记物、细胞内信号通路蛋白质和炎症标记物等。
常用的免疫组化技术包括免疫荧光染色和免疫组织化学染色等。
4. 免疫印迹技术免疫印迹技术是通过使用特异性抗体检测目标蛋白质在细胞或组织中的表达水平。
该技术可以用于检测特定蛋白质的表达变化，从而研究其在免疫反应中的功能。
常用的免疫印迹技术包括Western blot和ELISA等。
5. 免疫荧光技术免疫荧光技术是利用特异性抗体与目标蛋白质结合，并使用荧光标记的二抗进行检测。
该技术可以用于检测细胞表面标记物、蛋白质相互作用和免疫细胞的分布等。
常用的免疫荧光技术包括免疫荧光染色和流式细胞术等。
6. 免疫PCR技术免疫PCR技术是将PCR技术与免疫学相结合，用于检测特定基因的表达水平。
该技术可以用于研究免疫相关基因的表达变化和免疫调节机制。
常用的免疫PCR技术包括RT-PCR、实时荧光定量PCR等。
7. 细胞因子检测技术细胞因子是免疫反应和炎症过程中的重要调节因子。
通过检测细胞因子的表达水平，可以了解免疫反应的活性和炎症程度。
免疫检测原理
免疫检测原理免疫检测是一种常用的生物学实验技术，通过检测抗体与抗原之间的相互作用来确定特定物质的存在。
这种检测方法通常用于诊断疾病、监测生物分子的表达水平以及研究生物分子相互作用等领域。
免疫检测的原理主要基于免疫学中的抗体-抗原相互作用原理，下面将详细介绍免疫检测的原理及其应用。
1. 免疫检测的原理免疫检测的原理基于抗体与抗原之间的特异性相互作用。
抗体是免疫系统产生的一种蛋白质，可以识别并结合特定的抗原分子。
当抗体与抗原结合时，会发生特定的免疫反应，形成抗原-抗体复合物。
免疫检测利用这种抗原-抗体相互作用来检测特定的生物分子。
常见的免疫检测方法包括酶联免疫吸附试验（ELISA）、免疫印迹（Western blot）、免疫荧光等。
2. ELISA检测原理ELISA是一种常用的免疫检测方法，其原理基于酶与底物之间的特异性相互作用。
在ELISA实验中，首先将待检测的抗原或抗体吸附在微孔板上，然后加入特异性抗体或抗原，使其与待检测物相结合。
接着加入与特异性抗体结合的酶标记二抗，形成抗原-抗体-酶标记二抗复合物。
最后加入底物，酶与底物发生反应产生可测量的信号，通过测量信号强度来确定待检测物的存在量。
3. Western blot检测原理Western blot是一种用于检测蛋白质的免疫检测方法，其原理基于蛋白质的分子量和特异性抗体的结合。
在Western blot实验中，首先将待检测的蛋白质经电泳分离并转移到膜上，然后将膜与特异性抗体结合，形成蛋白质-抗体复合物。
接着加入与特异性抗体结合的辅助抗体，再加入底物产生可视化的信号，通过检测信号强度来确定待检测蛋白质的存在量。
4. 免疫检测的应用免疫检测在医学诊断、生物学研究和生物工程等领域有着广泛的应用。
在医学诊断中，免疫检测可以用于检测病毒、细菌和肿瘤标志物等，帮助医生诊断疾病。
在生物学研究中，免疫检测可以用于检测蛋白质表达水平、研究蛋白质相互作用等。
在生物工程中，免疫检测可以用于检测重组蛋白质的纯度和活性等。
免疫学实验整理
免疫学实验整理一、凝集试验、吞噬试验（一）凝集试验1、直接凝集反应（ABO血型鉴定）2、间接凝集反应（类风湿因子测定）3、金黄色葡萄球菌协同凝集试验（二）吞噬试验（示教）1、中性粒细胞的吞噬作用（小吞噬）2、巨噬细胞的吞噬作用（大吞噬）名解：1.免疫学检测技术：利用免疫学原理来检测抗原、免疫分子（抗体、补体、细胞因子和粘附分子等）及免疫细胞等免疫学研究对象的实验过程。
如凝集反应可用于检测抗原抗体，吞噬十堰可用于检测免疫细胞等。
2.凝集反应（agglutination reaction）:在一定浓度的电解质溶液中，颗粒性抗原与相应抗体结合后，出现肉眼可见的凝集块，称为凝集反应。
3.直接凝集反应（direct agglutination reaction）:细菌、细胞等颗粒性抗原，在适当电解质参与下可直接与相应抗体结合出现凝集，称为直接凝集反应。
4.间接凝集反应（indirect agglutination reaction）：将可溶性抗原或抗体先吸附于适当大小的颗粒性载体表面（这种载体与免疫无关），然后与相应抗体或抗原结合，在适量的电解质存在下，出现特异性凝集现象，称为间接凝集反应。
5.协同凝集实验（coagglutination）：利用金黄色葡萄球菌A蛋白（SPA）能与人和多种哺乳动物IgG的Fc段结合而不影响其Fab段功能的特性，将已知的特异性抗体吸附于金黄色葡萄球菌上，与相应的抗原发生的凝集反应即为协同凝集试验。
6.滴度（titer）、效价：The maximum dilution that gives obviously visible agglutination (++) is called the titer.实验及注意点：1、检测抗原抗体的基本原则：根据抗原抗体结合反应的高度特异性，用已知抗体（抗原）检测未知抗原（抗体），有现象则说明有相应抗原，无现象则无相应抗原。
2、直接凝集反应（ABO血型鉴定）：若加A抗体出现凝集说明血清中有A抗原，为A型血。
免疫学检验方法有哪些 (3)
免疫学检验方法有哪些
免疫学检验方法主要包括以下几种：
1. 酶联免疫吸附试验（ELISA）：通过将待检样品加入特异性抗体或抗原包被的微孔板中，利用酶标记技术和底物发色反应来检测目标物的浓度或活性。
2. 免疫印迹（Western blot）：将蛋白质样品分离并转移到膜上，然后用特定抗体标记的酶或荧光染料检测目标蛋白质的存在。
通常用于检测抗体的特异性和蛋白质的表达量。
3. 免疫荧光染色（Immunofluorescence stning）：通过将待检样品与特定抗体结合，并用荧光标记的二抗或直接标记的抗体检测目标物的存在。
4. 免疫组织化学（Immunohistochemistry）：将组织切片或细胞片贴培养后，使用特异性抗体和酶、荧光染料或金粒等标记物来检测目标蛋白质在组织或细胞中的表达。
5. 流式细胞术（Flow cytometry）：将待检样品中的细胞与特异性抗体结合，并用荧光标记的二抗或直接标记的抗体检测目标细胞的存在和数量。
6. 中和试验（Neutralization assay）：通过将待检抗体与病毒或细菌感染的细胞或动物结合，观察抗体是否能够中和病毒或细菌的活性。
7. 结合力测定试验（Binding assay）：通过将待检抗体与其靶标物结合，并用荧光标记的二抗或直接标记的抗体检测结合的情况。
以上仅为免疫学检验方法的一部分，根据具体实验目的和样品特点，还可以使用其他更特殊的技术，如免疫电镜
（Immunoelectron microscopy）、免疫贴片（Immunospot assay）等。
免疫学实验实验六肥达试验
目录
• 实验简介 • 实验材料 • 实验步骤 • 实验结果分析 • 实验结论
01
实验简介
实验目的
掌握肥达试验的原理 及操作方法。
了解肥达试验在临床 诊断中的应用。
学习通过肥达试验检 测伤寒沙门氏菌的方 法。
实验原理
肥达试验是一种利用已知伤寒沙门氏菌的菌体抗原和鞭毛抗原，以及副伤寒沙门氏 菌的鞭毛抗原，通过凝集反应检测血清中相应抗体的方法。
01
02
03
实验器材
准备试管、吸管、显微镜 等实验器材，确保其清洁、 干燥、无菌。
试剂
配制好所需的抗原和抗体 溶液，确保其质量和浓度 符合实验要求。
样本
采集待检测的血清样本， 确保其无菌、无污染，并 妥善保存。
实验操作流程
摇匀
轻轻摇动试管，使血清、抗原 和抗体充分混合。
离心
将反应后的液体进行离心，分 离出沉淀物。
用于观察细菌形态和计数。
移液器
用于精确移取一定量的菌液和 血清。
试管和吸管
用于配制菌液和稀释血清。
培养皿和培养基
用于细菌培养和计数。
实验动物
小鼠
兔子
用于感染细菌后观察症状和收集血清 样本。
用于感染细菌后观察症状和收集血清 样本。
大鼠
用于感染细菌后观察症状和收集血清 样本。
03
实验步骤
实验前准备
当待测血清中含有相应抗体时，抗体与抗原发生特异性结合，形成可见的凝集反应。
通过凝集反应的结果，可以判断待测血清中是否含有相应的抗体，进而推断出患者 是否感染了伤寒沙门氏菌或副伤寒沙门氏菌。
实验意义
肥达试验对于伤寒的诊断具有重 要意义，尤其在伤寒的早期诊断 中具有较高的灵敏度和特异性。
免疫学实验报告
免疫学实验报告免疫学实验报告实验目的：通过实验探究免疫应答的原理和免疫系统的功能。
实验原理：免疫系统是人体防御外界病原体入侵的重要系统，包括体液免疫和细胞免疫两个部分。
本实验主要研究体液免疫，即通过体液中的抗体与抗原结合来进行抗原识别和消灭异常细胞的免疫反应。
实验材料：实验所需材料有抗原A、抗体A、抗原A标记物、酶标记二抗、底物、酶标设备等。
实验步骤：1. 将实验用的酶标板孔板进行预处理，将抗体A溶液加入到孔板中，并在室温下孵育一段时间，使其与孔板表面结合。
2. 加入已知浓度的抗原A溶液到孔板中，使抗原与已固定的抗体结合，孵育一段时间。
3. 弃去孔板中的液体，将含有抗原A标记物的溶液加入到孔板中，使其与已结合的抗原结合，孵育一段时间。
4. 弃去孔板中的液体，用酶标设备检测标记物与孔板的结合情况。
5. 加入底物使酶标记物能够产生颜色反应。
6. 使用酶标设备测量底物的颜色反应强度，从而获得抗原与抗体结合的程度。
实验结果：根据实验结果，我们可以得到抗原与抗体结合的程度以及抗原的浓度。
实验结论：通过实验我们可以得到样本中抗原的浓度信息。
实验结果显示，抗原与抗体之间的结合程度与抗原浓度呈正相关关系，即抗原浓度越高，抗原与抗体的结合程度越强。
这表明体液免疫能够通过抗体与抗原的结合来识别并清除异常细胞。
实验总结：本次实验通过酶标技术原理探究了免疫应答的基本原理和体液免疫的功能。
通过该实验可以更好地理解免疫系统的机制，为进一步研究和应用免疫学提供基础。
同时，实验中采用的酶标技术也展示了其在免疫学研究中的重要应用价值。
免疫学作为生命科学的一个重要分支，对于人体健康和疾病防治具有重要意义，今后还需要进一步深入研究。
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酶联免疫斑点检测技术的应用摘要：酶联免疫斑点检测（Enzyme-linked Immunospot Assay ELISPOT）是一种在细胞悬液中定量检测细胞因子生成细胞的分析方法。
本文主要从ELISPOT 的技术原理及技术特点，标准的操作程序进行阐述，并对实验方法进行了介绍,展望了ELISPOT的应用。
关键词:酶联免疫斑点检测；淋巴细胞；细胞培养酶联免疫斑点检测（Enzyme-linked Immunospot Assay ELISPOT），它结合了细胞培养技术与酶联免疫吸附技术（即ELISA技术），能够在单细胞水平检测细胞因子的分泌情况，分析经特异抗原活化后分泌细胞因子，如干扰素γ(interferongamma,IFN) 、肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor-alpha,TNF-α) 等的单个效应细胞的频数, 具有敏感、特异、易于重复的优点[ 1] , 是检测抗原反应性效应细胞的最可靠实验方法之一[ 2] , 目前已成为抗原特异性T 细胞免疫学研究的主流技术。
本文就ELISPOT 技术作如下综述。
1 关于ELISPOT酶联免疫斑点（ enzyme-linked immunosorbent spot， ELISPOT）检测技术是通过两种高亲和力的特异性抗细胞因子抗体来检测淋巴细胞分泌细胞因子情况的一种方法。
淋巴细胞在体内被抗原激活后，或者在体外培养中被培养液中含有的特异性抗原或刺激剂激活后，将这些细胞转入ELISPOT培养板中。
这些活化的淋巴细胞所分泌的细胞因子，在孵育的过程中可在分泌细胞原位被ELISPOT培养板上包被的特异性细胞因子抗体所捕获。
将细胞和过量的细胞因子洗除后，加入生物素标记的检测抗体，孵育后洗去多余检测抗体。
然后加入酶标记的链亲和素（二抗），孵育后洗去多余酶标链亲和素（二抗）。
最后加入酶的底物，作用后可形成不溶的颜色产物即斑点（SPOT）。
每个斑点是激活的淋巴细胞分泌的细胞因子区域，代表一个活性淋巴细胞。
实验结果可在显微镜下观察或使用酶联免疫斑点自动图象分析仪（BioReader 4000 Pro-X）来进行计数分析。
该方法可在单细胞水平检测淋巴细胞对特异性抗原的反应能力及记数特异性抗原刺激下分泌性淋巴细胞产生的情况。
2 ELISPOT技术原理和技术特点ELISPOT结合了细胞培养技术与酶联免疫吸附技术，能够在单细胞水平检测细胞因子的分泌情况。
其技术原理用抗体捕获培养细胞分泌的细胞因子，并以酶联斑点显色的方式将其表现出来。
ELISPOT的培养板以聚偏二氟乙烯(PVDF)膜等为基质,包被上特异性单克隆抗体,在培养板孔内加入细胞培养基、待检测的细胞及抗原刺激物进行培养。
在特异性抗原或非特异性有丝分裂原的刺激下,T细胞分泌各种细胞因子,细胞因子被膜上的单克隆抗体捕获。
被捕获的细胞因子可以与生物素标记的第二抗体结合,然后用酶标亲和素与生物素进行化学酶联显色,在膜的局部形成一个个圆形斑点[3]该技术检测细胞因子具有三大优点：其一，灵敏度高。
在一百万个阴性细胞中只要有一个分泌细胞因子的阳性细胞即可被检测出来。
这是目前为止，最为灵敏的检测技术，灵敏度比传统的的ELISA方法高2-3个数量级。
其二，单细胞水平，活细胞功能检测。
ELISPOT检测的是单个细胞分泌，而非细胞群体的平均分泌。
在检测的过程中，有活细胞培养与抗原刺激阶段，检测的是活细胞的功能，而非死细胞的遗留物。
其三，操作简便经济，可以进行高筒量筛选。
ELISPOT没有复杂的细胞体外扩增过程，不使用同位素，不需要大型的、专门的实验仪器设备。
按照标准化的实验操作，一个实验者可以同时处理数百个样品，效率远远高于其它检测方法。
实验设计在96孔培养板上进行，直接以培养板的塑料板底或者PVDF膜以及硝酸纤维素膜为基质，包被上特异性的单克隆抗体，用以捕获细胞分泌的细胞因子。
（由于涉及到细胞培养的过程，对单克隆抗体的要求要远高于ELISA中的捕获抗体，该抗体需要无毒，不含内毒素，亲和力高等特点。
）之后，在培养板的孔内加入细胞培养基（现在无血清ELISPOT技术已经成熟，培养基中可以不再含有血清）、待检测的细胞以及抗原刺激物进行培养。
在特异性的抗原或者非特异性的有丝分裂原的刺激下，数小时之内，T细胞就会开始分泌各种细胞因子。
细胞因子当即就被位于细胞下方的膜上的单克隆抗体所捕获。
在洗去细胞之后，被捕获的细胞因子可以与生物素标记的第二抗体结合，然后用酶标亲和素再与生物素结合，进行化学酶联显色，就可以在膜的局部形成一个个圆形的斑点。
每一个斑点就对应了当初一个分泌细胞因子的细胞，这些细胞被称为斑点形成细胞（Spots forming cells SFCs）。
统计膜上的斑点的数目，再除以当初加入孔内的细胞总数，就可以计算出阳性细胞的频率。
3 ELISPOT的方法由于有商品化的试剂盒，ELISPOT操作本身已经大大简化。
目前的ELISPOT 试剂盒按抗体的包被情况分为已包被板的和未包被板的两类。
前者实验操作简单，但是背景较高，且价格较贵，所以应用不如后者广泛。
按照ELISPOT底板材料分，可以分为PVDF膜板和非PVDF膜板。
PVDF板由于疏水性的问题，需要用乙醇预先润湿，在洗涤过程中也更复杂一些。
各个公司的试剂盒使用起来大同小异，我们以荷兰U-Cytech公司的PVDF板IFN-γ试剂盒，列出其操作方法。
3.1 实验的准备工作（1）设备与耗材：超净工作台；5% CO2 37°C 细胞培养箱；Biosys ELISPOT ReaderP10，P200，P1000 微量移液器；P10，P200，P1000 枪头；0.5mL，1.5mL EP管。
P300 8通道微量移液器，P300 12通道微量移液器；多道移液器吸槽；（2）溶液配制PBS：用分析纯试剂，Millipore级别的纯水配制，高压灭菌。
PBST：PBS加入0.05% Tween-20，注意无菌操作。
储存于20-25°C，可存放一个月。
70%乙醇：分析纯乙醇70mL，加入Millipore级别的纯水至100mL。
30%乙醇：分析纯乙醇30mL，加入Millipore级别的纯水至100mL。
包被抗体（coating antibody，Primary antibody）：加入双蒸水溶解。
使用时，用PBS稀释50倍，每孔50μL。
封闭液：用PBS将试剂盒中的封闭存储液（Blocking stock solution R）稀释10倍，每孔200μL。
抗体稀释液：用PBS将试剂盒中的稀释存储液（Dilution buffer R）稀释10倍检测抗体（Biotinylated detector antibody，Secondary antibody）：照U-Cytech 说明书，加入双蒸水溶解。
使用时，用抗体稀释液稀释100倍，每孔100μL。
酶联亲和素（Streptavidin-HRP conjugate）：照U-Cytech说明书，加入双蒸水溶解。
使用时，用抗体稀释液稀释100倍，每孔100μL。
AEC显色液：照U-Cytech说明书，用100mL 30%乙醇溶解底物缓冲液胶囊（Substrate buffer capsule），然后加入3.3mL AEC储存液（AEC stock solution），混合均匀后10mL每支分装，-20oC保存。
使用时，解冻，每孔加入100μL。
PHA刺激物：将储存液（2mg/ml， Murex）分装成20μL/EP管，-20°C长期冻存。
使用时，加入980μL U-Cytech无血清培养基（或者1640基本培养基），成为工作液（40μg/mL，10倍终浓度），每孔加入10μL，终浓度4μg/mL。
U-Cytech无血清培养基：我们推荐无血清ELISPOT技术，它能排除血清的干扰，结果更加稳定可靠，背景也更好。
如果没有，可以用含10%血清的1640培养基代替。
3.2 ELISPOT标准操作程序3.2.1 ELISPOT包被程序设计好试验，把每个孔要加入的内容做成卡片，到时候就会从容很多。
每孔加入15μL 70%的乙醇预湿30秒。
未润湿的PVDF膜是洁白的、不透明的，经过乙醇润湿之后，颜色变暗，变成半透明状，很容易观察二者的区别。
加乙醇的时候，枪头应该靠在孔壁接近孔底的地方，注意枪头不到刺到PVDF膜。
乙醇一旦接触到PVDF膜，就会在表面张力和毛细作用之下迅速浸润整块膜，使得膜的颜色和透明度发生变化。
15μL是经过优化的体积，它能保证刚好完全浸润整块膜，而不会有剩余。
如果加大使用量，乙醇溶液就会透过膜而积存在膜的背面，加深实验的背景。
加入100μL去离子水洗涤三次，尽量减少乙醇的残留。
按照试剂盒的使用说明，将包被抗体储存液稀释在PBS缓冲液中，每孔加入50μL，4°C包被过夜。
（次日）倾倒包被液，用PBS洗涤5次，最后一次，在灭菌的吸水纸上扣干。
加入200μL试剂盒自带的稀释好的封闭液，37°C封闭1小时。
倾倒封闭液，无须洗涤，直接可以进行细胞培养。
（也可以用PBS缓冲液或者纯水洗涤一次，拍干，封口，4°C保存，可以在4°C保存数周。
）3.2.2 铺细胞，加入刺激物，培养整个实验设置一组正对照（PHA刺激），每一个细胞样品（同一个捐献者或者实验动物）要设一个负对照（不加刺激物），整块板还要加一个背景负对照（不含细胞，只加培养基和所有的检测试剂）。
填好实验卡片，用以指导实验的安排和细胞及试剂的添加。
每一个细胞/刺激物的组合设置2-4个孔的重复（想要有统计学的意义，每个细胞/刺激物设4个孔的重复）。
取出封闭好的板，准备加入细胞。
如果是以前做的封闭，可以加入200μL的U-Cytech无血清培养基，室温静置10分钟，倾倒，然后再重复一次。
按照实验卡片的安排，加入不同浓度的细胞，100μL/well，细胞在孔中的分布要尽量均匀（要诀是加入细胞之后，不要再震动或者拍击ELISPOT板。
有人认为拍击板子会让细胞更分散，实际情况刚好相反）。
正对照的细胞浓度为1x105/well，实验组的样品细胞浓度请自行调整。
加入100μL的U-Cytech无血清培养基到背景负对照孔。
正对照孔加入10μL PHA，终浓度4ug/mL，该浓度能有效刺激IFN-γ的分泌。
加入实验者自己的刺激物（配制成10X终浓度，10μL/well）到实验孔。
加完刺激物之后不要再拍击ELISPOT 板。
有人认为拍击板子会让刺激物在孔中混合均匀，实际上，通过扩散，刺激物也会很快混合均匀。
拍击板子会让细胞成圈的分布在孔的外周。
当加完所有的样品之后，盖上板盖，放入二氧化碳培养箱，37°C培养18-24小时。