透明质酸产生菌发酵条件优化
透明质酸的生产工艺
基础研究资料>生产工艺透明质酸的生产工艺凌沛学主编张天民主审.《透明质酸》.北京：中国轻工业出版社透明质酸（H A）的生产工艺主要分为二大类,以动物组织为原料的提取法和细菌发酵法。
透明质酸在动物组织中的分布较为广泛，几乎所有的动物组织中均含有透明质酸，只是含量不同。
已从下列组织中分离出了透明质酸：结缔组织、脐带、皮肤、人血清、鸡冠、关节滑液、脑、软骨、眼玻璃体、人尿、鸡胚、兔卵细胞、动脉和静脉等，但考虑到原料透明质酸含量的高低、数量的多少和易于取得的程度等成本因素，能够用于生产的原料主要为鸡冠、人脐带和动物眼球。
细菌发酵法是利用某些种属的链球菌，在生长繁殖过程中，向胞外分泌以透明质酸为主要成分的荚膜。
细菌发酵法与动物组织提法相比，具有生产规模不受动物原料限制，发酵液中透明质酸以游离状态存在,易于分离纯化，成本低，易于形成规模化工业生产，无动物来源的致病病毒污染的危险等优点。
透明质酸无种属差异，不同动物组织提取的及不同菌种发酵生产的透明质酸，在化学本质和分子结构上是一致的，只是相对分子质量（Ｍr）有差别。
一、以雄鸡冠(r o o s t e r c o m b)为原料的生产工艺[1~4]（一）工艺路线（二）工艺过程1．提取冻鸡冠解冻后，用绞肉机绞碎，加适量水用胶体磨磨成糊状，按每1k g鸡冠加水8L，加氯化钠80g，搅拌加热至90℃，保温10m i n，冷却至50℃，用1m o l/L氢氧化钠液调p H8.5~9.0,加入适量胰酶,45~50℃保温酶解5~7h，酶解过程中维持p H8.5~9.0。
2．过滤将酶解提取液用滤布加硅藻土加压过滤，得澄清滤液。
3.乙醇沉淀和粗品干燥取滤液,调p H6.0~6.5,将滤液加到3倍体积的95%乙醇中,反复倾倒3次,待纤维状沉淀充分上浮后,取出沉淀,用适量乙醇脱水3~5次,放入有五氧化二磷的真空干燥器内干燥,得透明质酸中间品。
4．氯仿处理将透明质酸中间品溶于0.1m o l/L氯化钠溶液中,溶解浓度为0.3%,溶解过程中加少量氯仿防腐。
多聚糖大分子聚合物透明质酸钠
多聚糖大分子聚合物透明质酸钠1. 引言多聚糖大分子聚合物透明质酸钠（Sodium Hyaluronate）是一种常见的生物高分子化合物，也被称为透明质酸钠盐。
它是一种天然存在于人体组织中的聚糖，广泛应用于医药、化妆品和食品等领域。
本文将介绍透明质酸钠的化学结构、生物学特性、制备方法以及应用领域。
2. 化学结构透明质酸钠是一种非硫酸化的聚糖，由葡萄糖醛酸和N-乙酰葡萄糖胺单元交替排列而成。
它的化学结构如下所示：透明质酸钠的分子量通常较大，可以达到数百万道尔顿。
它具有高度的保水性，能够吸收并保持皮肤和软组织中的水分，从而增加皮肤的弹性和滋润度。
3. 生物学特性透明质酸钠在人体组织中广泛存在，尤其集中在皮肤、关节和眼球等处。
它在细胞外基质中起到重要的生物学功能，包括细胞黏附、细胞迁移、细胞增殖和细胞分化等。
透明质酸钠具有良好的生物相容性和生物可降解性，不会引起明显的免疫反应。
它被认为是一种安全的生物材料，被广泛应用于医疗领域。
4. 制备方法透明质酸钠的制备方法通常包括微生物发酵法和酶法。
4.1 微生物发酵法微生物发酵法是透明质酸钠的主要制备方法之一。
一般采用乳酸菌、酵母菌或其他革兰氏阳性菌作为发酵菌种，通过发酵过程产生透明质酸钠。
制备过程包括以下步骤：1.菌种的培养和扩增。
2.发酵培养基的制备。
3.发酵过程的控制和调节。
4.透明质酸钠的提取和纯化。
4.2 酶法酶法是透明质酸钠制备的另一种方法。
通过将透明质酸酶或葡萄糖胺酰转移酶与底物反应，可以高效地合成透明质酸钠。
制备过程包括以下步骤：1.酶的筛选和培养。
2.底物的准备和反应条件的优化。
3.反应过程的控制和调节。
4.透明质酸钠的提取和纯化。
5. 应用领域透明质酸钠由于其独特的生物学特性和良好的生物相容性，被广泛应用于医药、化妆品和食品等领域。
5.1 医药领域透明质酸钠在医药领域有多种应用，包括：•关节润滑剂：透明质酸钠可以作为关节液的替代品，用于治疗关节炎等关节疾病。
透明质酸合成途径在乳酸乳球菌中的建立及微生物合成透明质酸分子量调控机制的初步研究
透明质酸合成途径在乳酸乳球菌中的建立及微生物合成透明质酸分子量调控机制的初步研究透明质酸(hyaluronic acid,HA)作为一种高分子量的黏多糖,广泛存在于脊椎动物细胞中,发挥着结构、信号传导和信号识别的功能。
HA由于其优异的黏弹性、保湿性和支撑作用,被广泛的应用于医药、化妆品、药物传递系统、疫苗和功能健康食品。
目前,工业上主要经由革兰氏阳性C型链球菌如兽疫链球菌(Streptococcus zooepidemicus)发酵生产。
但作为生产菌株,链球菌生长速度慢、培养基成本高等劣势日益显现出来,而寻找新的优秀野生生产菌株的希望渺茫。
所以,利用基因工程构建合成HA的工程菌株不但有利于克服链球菌作为发酵生产HA菌株的劣势,而且对提高HA的品质,扩大HA的应用范围具有理论意义和应用价值。
乳酸乳球菌(Lactoccus lactis)作为革兰氏阳性菌的模式生物,已被广泛应用于食品发酵生产中,且被认定为GRAS(generally regarded as safe)微生物。
乳酸乳球菌由于其自身的优良特性,正越来越多地被应用于代谢工程改造过的现代工业中。
在过去的25年中,乳酸乳球菌的基因操作方法日益成熟,其中一系列的诱导表达启动子得到了深入的研究,并已开始应用于工业生产。
通过改变小肽、单糖的浓度或诱导温度等调控因子,这些启动子能够实现乳酸乳球菌工程菌株中目的蛋白的可控表达。
NICE(the nisin controlled gene expression)系统是乳酸乳球菌中研究最深入和最有效的基因工程操作系统之一,已被广泛地应用于该菌株的代谢工程改造。
不但诱导剂乳酸链球菌素(nisin)是一种理想的高效安全无毒的食品级诱导分子,而且在NICE系统中可以将染色体上lacF基因缺失的乳酸球菌菌株以及含有lacF基因的质粒结合使用,用食品级筛选标记lacF替代抗生素抗性基因,构建食品级表达系统,而且该方式构建的工程菌株遗传稳定(deRuyter,Kuipers & de Vos,1996b;Mierau & Kleerebezem,2005a;Zhang,Chen,Jia,Chen & Huan,2002)。
透明质酸合成
透明质酸合成
透明质酸是一种常用的天然多糖类高分子化合物，具有保湿、润滑、抗衰老等功效。
广泛应用于医学、化妆品、食品、烟草、纸张及柔性薄膜等领域。
透明质酸的合成方法也多种多样，接下来将介绍几种透明质酸的合成方法。
1. 水解法
水解法是透明质酸主要的工业生产方法。
将纤维素用碱液处理后，经过明矾脱色、硫酸煮沸、酸处理等步骤制得纤维素醛，然后经过还原、水解等步骤制得透明质酸。
这种方法的缺点是工艺复杂，步骤繁多，需要较强的技术条件和设备，同时产品的纯度和分子量分布也比较难以控制。
2. 微生物法
微生物法是透明质酸的一种新型生产方法。
通过选择透明质酸产生菌株，将其发酵生产透明质酸。
该方法生产过程简单、环保，产品质量稳定，品质优良，是目前发展较快的一种透明质酸生产方法。
3. 化学法
化学法是一种利用化学方法合成透明质酸。
化学法合成透明质酸的步骤较多，但反应条件易于控制，产品结构可控，因此在研究领域较为常见。
透明质酸合成的关键是控制分子量分布。
对于医药和化妆品行业来说，透明质酸的高分子量和单一分子量的透明质酸更受欢迎。
总的来说，透明质酸的合成方法多种多样，各有优缺点。
但无论哪种方法，关键在于保证产品品质的稳定性和分子量的分布均匀性。
这一点非常重要，因为分子量会直接影响透明质酸的生理功能。
未来，随着科学技术的不断发展以及消费者对于高品质化妆品的需求逐渐加强，透明质酸逐渐将走向高品质化合物的方向。
透明质酸生产菌种和工艺技术
透明质酸生产菌种和工艺技术透明质酸(hyaluronic acid，HA)，又名玻璃酸，是一种酸性黏多糖，1934年美国Meyer等首先从牛眼玻璃体中分离出该物质。
此后，人们对HA的分布、生理作用、化学结构、理化性质、制备工艺及其在医疗和化妆品方面的应用进行了广泛深入地研究。
我国从80年代开始研究HA的分离纯化制备工艺和临床应用，90年代初已有HA制剂作为新药上市，生产方法由提取法发展到微生物发酵法。
透明质酸应用：医学方面：由HA制备的眼科制剂有手术用黏弹性辅助剂、滴眼剂、骨科制剂有关节腔注射液（用于补充关节滑液，治疗关节疼痛）等；另外，HA可促进创伤愈合，治疗烧伤；HA与化疗药结合，具有靶向引导作用，能引导药物进入肿瘤部位，杀灭癌细胞，减轻化疗副作用。
HA作为人体的基本物质，对其生理和药理作用的研究才开始，随着研究的深入，HA在医学方面的应用还会更加广泛。
化妆品：HA 是国际公认的理想的天然保湿因子（NMF），是目前高档护肤品、发用制品用量最大品种。
美容保健食品：在日本，HA从20世纪90年代开始用作具有美容作用的保健食品，服用后可增加人体内HA的合成，提高皮肤中HA的含量，使皮肤保水量增加，光滑细嫩而富有弹性。
我们的技术水平：生产菌:兽医链球菌，好氧细菌(突变株)生产水平:6-8g(成品)/L发酵时间:20小时分子量:百万以上产品规格:食品、医药、化妆品级生产成本（原料+人工+能源）：1200-1500元/KG市场价格：4000元/KG（食品级，化妆品级）；9000元以上（医药级）技术成熟度：商业化生产，且国内外多个厂家使用此技术。
工艺路线：斜面----摇瓶----种子罐----生产罐----过滤----乙醇提取---盐络合解离----乙醇提取----真空干燥----成品经济分析：年产2吨透明质酸，投资400万左右，产值800万，投资回报率超过50%，当年投资，当年回收成本。
透明质酸制备工艺进展(1)(2) (1)
透明质酸制备工艺进展摘要透明质酸，又名玻璃酸，是一种独特的。
它是由线性大分子酸性粘多糖葡萄糖醛酸和N—乙酞氨基葡萄糖的双糖单位重复连接形成的。
透明质酸广泛分布于高等动物的细胞外基质、结缔组织和器官中。
透明质酸以其独特的分子结构和理化性质在机体内显示多重要的生理功能，如润滑关节，促进创伤愈合等，在临床上得到广泛的应用。
HA及其衍生物具有优良的生物相容性和可降解性，能作为药物载体和组织工程材料，因而广泛应用于生物医药学领域。
透明质酸还具有特殊的保水作用，是目前发现的自然界中保湿性最好的物质，被誉为最为理想的天然保湿因子，已作为化妆品及使用保健品中的保湿添加剂使用。
文章讨论了透明质酸的制备方法，并对其在医药、化妆品、保健食品等领域中的应用进行综述。
关键词：线性大分子酸性多糖;天然保湿因子;保湿添加剂;相溶性;可降解性Hyaluronic acid preparation processAbstractHyaluronic acid, also known as hyaluronic acid, is a unique. It is composed of linear macromolecular acid mucopolysaccharide glucuronic acid and N - acetyl glucosamine disaccharide repeating units are connected to form a. Hyaluronic acid is widely distributed in higher animal cells, extracellular matrix of connective tissues and organs. Hyaluronic acid with its unique molecular structure and physicochemical properties in vivo shows many important physiological functions, such as lubrication of joints, promote wound healing, has been widely applied in clinical medicine. HA and its derivatives have biocompatibility and biodegradability has excellent biocompatibility, can be used as drug delivery and tissue engineering material, which is widely used in biomedical field. Hyaluronic acid also has a special role in water retention, is the moisture of nature found in the best material, known as the most natural moisturizing factor ideal, as cosmetics and health care products in the use of moisturizing additives. This paper discusses the method of the preparation of hyaluronic acid, and reviews its application in medicine, cosmetics, health food and other fields.Keywords:Linear macromolecules of acidic polysaccharides; natural moisturizing factor; hydrating additives; miscibility; biodegradability目录引言 (1)第一章透明质酸的简介 (1)第二章透明质酸的制备及原理 (2)2.1组织提取法 (2)2.2微生物发酵法 (2)2.3人工合成法 (2)第三章透明质酸在实际中的应用 (3)3.1药物缓释体系中及临床医学中的应用 (3)3.2使用保健品中的应用 (3)3.3化妆品中的应用 (3)第四章透明质酸的研究进展及发展前景 (4)结论 (4)参考文献 (6)谢辞 (7)引言透明质酸（hyaluronic acid、HA）又名玻尿酸，是一种酸性黏多糖，广泛存在于生物体的结缔组织中。
发酵法生产透明质酸的工艺研究
文章编号 :1004 - 5260 (2002) 01 - 0033 - 04
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宁
夏
农
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院
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报
咔唑法试剂 : (1) 0. 025M 的四硼酸钠浓硫酸 :4. 77g Na2B4O7 ・ 10H2O + 500mlH2 SO4 ( CR)
1. 1. 2. 2 种子培养基
MgSO40. 5g 水 1000ml pH7. 0～7. 5 琼脂 20g
葡萄糖 20g 胰蛋白胨 8g 酵母膏 2g 牛肉膏 4g
1. 1. 2. 3 发酵液成分
Na2 HPO40. 5g MgSO40. 5g 水 1000ml
葡萄糖 ; 蔗糖 ; 酵母膏 ; 蛋白胨 ; 碳酸钙 ; 磷酸二 氢钾 ; 硫酸镁 。 1. 1. 3 仪器与设备 显微镜 可控硅控温水浴锅 恒温振荡仪 超净工作台 数显电热培养箱 电热手提压力蒸汽消毒器 721 分光光度计 , 电热鼓风干燥箱 1. 1. 4 药品与试剂 可调移液器 生物显微镜 高速冷冻离心机 MP200B 电子天平 IPT - 5 架盘天平
最后 ,在每个摇瓶 ( 50ml ) 中加入 0. 05 克硫酸镁 调节 pH 在 7. 0 - 7. 5 的范围内 ,每个实验重复 1 次 , 接种量为 2 % ,置于 37. 0 ℃,170rpm 的摇床上培养 24 小时 ,测试其结果 。 1. 2. 3 测试方法 1. 2. 3. 1 HA 含量的检测方法 ( 咔唑法) 咔唑法检测透明质酸含量的原理是因为透明质 酸水解后 ,产生 1/ 2mol 的糖醛酸 ,其与浓硫酸反应 , 生成络合物 ,此络合物与咔唑形成玫瑰红颜色 ,根据 其颜色的深度可以判断透明质酸含量的多少 。 咔唑步骤 : (1) 取 5ml 浓硫酸溶液 ( 4 ℃ 预冷) ,然后加入 1ml 试样 ( 在冰浴中) ,摇匀 。 (2) 加热试管 ( 在沸水浴中 ) 10min , 然后冷却至 室温 。 (3 ) 加入 0. 2ml 咔唑溶液 , 摇匀 , 在沸水浴中加 热 15min ,再冷至室温 。 ( 4) 在 530nm 处测定其 OD 值 。 如果出现玫瑰红 , 则证明含有 HA , 再把测得的 值对照标准曲线 ,就得到透明质酸含量的多少 1. 2. 3. 2 还原糖的测定方法 - DNS 法 步骤 : 取待 测 样 品 和 蒸 馏 水 ( 对 照 ) 各 1ml , 分 别 加 DNS 试剂 3ml ,沸水浴煮沸 15 分钟显色 ,冷却后用蒸 馏水稀释至 25ml , 用 721 分光光度计在 550nm 测其
透明质酸实验方法
透明质酸HA ( Hyaluronic Acid ) 是由(1 - β- 4) D - 葡糖醛酸和(1 - β- 3) N - 乙酰基- D -氨基葡糖组成的双糖单位重复连接构成的大分子糖胺聚糖[1 ] 。
由于其具有特殊的生理作用、独特的流变学特性和极强的持水保湿能力,在化妆品工业、医学研究、临床治疗等领域得到了广泛的应用[2 ,3 ] 。
微生物发酵法是利用某些种属的链球菌在生长繁殖过程中向胞外分泌以HA 为主要成分的荚膜来生产HA。
与组织提取法相比,具有成本低、生产规模不受动物原料限制、发酵液HA以游离态存在、易于分离纯化和形成规模化生产、无动物来源的致病病毒污染的危险等优点[ 4 ] 。
利用链球菌发酵法生产HA 的研究主要集中在日第2 期邓开野,等:透明质酸产生菌的筛选及诱变本,英美等国也有少量报道,大多见于专利。
作者对牛鼻黏膜进行了透明质酸产生菌野生型的分离,同时利用复合诱变育种方法处理HA产生菌,以期得到既不产生乙型溶血素、HA 产量又有提高的发酵HA 所适用的菌种。
1 实验材料采集的样品为长春皓月肉牛公司和海南省三亚市防疫站的牛鼻黏膜140 份。
培养基有以下几种: ①斜面培养基。
牛脑沁液800 mL ,牛心沁液200 mL ,牛肉膏的质量分数为0. 3 % ,蛋白胨为1 % ,NaCl 为0. 5 % ,琼脂为1. 8 % ,灭菌前p H = 7. 0 ,121 ℃灭菌20 min 。
②血琼脂平板培养基。
葡萄糖的质量分数为2 %,蛋白胨为1 %,牛肉膏为1 % ,MgSO4 ·7H2O 为0. 1 % , KH2 PO4 为0. 2 % ,琼脂为1. 6 %,灭菌前p H = 7. 0 ,121 ℃灭菌20 min. ,冷却至50 ℃以下,无菌条件下加入无菌脱纤维兔血。
③摇瓶培养基。
葡萄糖的质量分数为4 % ,蛋白胨为1 % ,牛肉膏为1 %,MgSO4 ·7H2O 为0. 1 % , KH2 PO4为0. 2 % ,灭菌前p H = 7.0 ,121 ℃灭菌20 min ,冷却至50 ℃以下,无菌条件下加入体积分数为10 %的小牛血清。
一种微生物发酵法生产透明质酸的方法
一种微生物发酵法生产透明质酸的方法
本发明涉及一种微生物发酵法生产透明质酸的方法，属于生物技术领域。
所述方法包括以下步骤：
1. 选取透明质酸发酵菌株，优选选择抗污染、高产透明质酸的菌株；
2. 制备适宜的培养基，包括碳源、氮源、矿物盐和生长因子等；
3. 通过发酵罐等设备进行微生物的发酵，控制好温度、pH值、氧气含量等因素；
4. 收取发酵液，进行透明质酸的提取、分离和纯化等工艺。
其中，所述透明质酸发酵菌株可选取链球菌、葡萄球菌、双歧杆菌、乳酸菌等。
本发明具有生产工艺简单、成本低、产量高、产品质量好等优点，可广泛应用于医药、食品、化妆品等行业。
- 1 -。
兽疫链球菌(Streptococcus zooepidemicus)发酵生产透明质酸工艺条件研究
３、 试验在５Ｌ发酵罐中，通过不同通气量、不同搅拌转速以及不同发酵温度进 行透明质酸发酵单因素试验，结果表明：小型发酵罐透明质酸发酵最佳通气量为 ３Ｌ／ｍｉｎ，搅拌转速为２００ｒ／ｍｉｎ，最适宜温度采用分段控制，发酵前１８ｈ控制在３６。Ｃ， １８ｈ后升温至３７。Ｃ发酵至２８ｈ，透明质酸产量较优化前有显著提高。
关键词：透明质酸；发酵条件；培养基；响应面法；优化
ＡＢＳＴＲＡＣＴ
ＳＴＵＤＹ ｏＮ ＨＹＡＬＵＲｏＮＩＣ ＡＣＩＤ ＦＥＲＭＥＮＴＡＴＩｏＮ
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ＡＢＳＴＲＡＣＴＳ
Ｉｎ ｔｈｉｓ ｐａｐｅｒ，ｔｈｅ ｓｔｒａｉｎ ｏｆ Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｚｏｏｅｐｉｄｅｍｉｃｕｓ ｗａｓ ｕｓｅｄ ｔｏ ｓｔｕｄｙ ｏｎ ｔｈｅ ｈｙａｌｕｒｏｎｉｃ ａｃｉｄ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ．Ｆｉｒｓｔｌｙ，ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ ｗｅｒｅ ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ ｉｎ
ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ ｏｆ ｐＨ ７．０，２４ ｈ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｔｉｍｅ ａｎｄ ４０％ｌｉｑｕｉｄ ｖｏｌｕｍｅ Ｗａｓ ｔｈｅ ｍａｘｉｍｕｍ ｖａｌｕｅ，ａｎｄ ｉｎ ｔｈｅ ３６℃ｈａｖｅ ｍｏｓｔ ｂａｃｔｅｒｉａ ａｍｏｕｎｔ，ｉｎ ３７℃ｈａｖｅｔｔ—Ｂｕｒｍａｎ设计及响应面分析法（ＲＳＭ）对透明质酸产生菌摇瓶发 酵培养基进行优化，确定了影响透明质酸产量的关键因子为葡萄糖和酵母膏，经过分 析得到葡萄糖最佳浓度为５５．７８９／Ｌ，酵母膏最佳浓度为２３．４３ ｇ／Ｌ。通过对培养基 的优化，透明质酸产量得到提高，实验值与预测值基本一致。