实验13地衣酚法测定rna含量-华南师范大学生命科学学院新
实验三_酵母RNA的提取及含量测定
酵母RNA的提取及含量测定一、实验目的与要求1、了解并掌握稀碱法提取RNA的原理和方法；2、了解测量核酸浓度不同方法的原理；3、熟悉和掌握紫外吸收法测定核酸含量原理和操作方法；4、熟悉紫外分光光度计的基本原理和使用方法。
二、实验原理1、RNA提取原理：由于RNA的来源和种类很多，因而提取制备方法也很各异。
一般有苯酚法、去污剂法和盐酸胍法。
其中苯酚法又是实验是最常用的。
组织匀浆用苯酚处理并离心后，RNA即溶于上层被酚饱和的水相中，DNA和蛋白质则留在酚层中。
向水层加入乙醇后，RNA即以白色絮状沉淀析出，此法能较好的除去DNA和蛋白质。
上述方法提取的RNA具有生物活性。
工业上常用稀碱法和浓盐法提取RNA，用这两种方法所提取的核酸均为变性的RNA，主要用作制备核苷酸的原料，其工艺比较简单。
浓盐法使用10%左右氯化钠溶液，90℃提取3-4h，迅速冷却，提取液经离心后, 上清液用乙醇沉淀RNA。
稀碱法使用稀碱使酵母细胞裂解，然后用酸中和，除去蛋白质和菌体后的上清液用乙醇沉淀RNA或调pH2.5利用等电点沉淀。
酵母含RNA 达2.67-10.0%，而DNA含量仅为0.03-0.516%，为此，提取RNA多以酵母为原料。
2、测定RNA含量的方法：（1）紫外吸收法原理：核酸具有吸收紫外线的性质，在波长260纳米处有最大吸收，且在一定浓度范围内光吸收值与浓度成正比（0—50微克/毫升），符合朗伯-比尔定律。
优点样品用量少，不用显色，测完后样品可以继续使用。
（2）地衣酚显色法：核酸与浓盐酸共热，放生降解，生成糠醛，后者与地衣酚反应，在三价铁离子或二价铜离子作用下，生成鲜绿色的复合物，670纳米处有最大吸收，且光吸收值与浓度成正比，符合朗伯-比尔定律。
缺点反应特异性差，易受干扰。
（3）定磷法：在酸性环境中，定磷试剂中的钼酸铵以钼酸形式与样品中无机磷酸生成磷钼酸，当有还原剂存在时，磷钼酸立即被还原生成蓝色的还原产物--钼蓝，其最大吸收在660纳米处，当无机磷含量在每毫升1-25微克范围内，光吸收与含磷量成正比。
分析化学实验报告6. RNA提取-2013-10
实验七. 酵母RNA提取与地衣酚测定法[目的和要求]1.了解并掌握稀碱法制备酵母RNA的原理及方法。
2. 掌握地衣酚法测定RNA含量的原理及方法。
[实验原理]稀碱法原理: 酵母RNA可溶于碱性溶液。
经稀碱液处理的酵母，细胞壁变性，释放出RNA，当溶液中的碱被中和后，加入的乙醇可使RNA沉淀，由此得RNA的粗制品。
地衣酚法原理: 核糖核酸与浓盐酸共热时发生降解，形成的核糖转变成糖醛，后者与地衣酚(3，5—二羟基甲苯)缩合成为绿色化合物，反应以铜离子作为催化剂，产物在670nm处有最大吸光度。
RNA在20～250μg／mL范围内，光密度与RNA 的浓度成正比。
地衣酚反应的特异性较差，凡戊糖均有此反应。
[实验器材]稀碱法使用器材:研钵(X1)，锥形瓶(100 mLXl)，电炉，抽滤装置(X1)，滴管(X1)，玻璃棒(X1)，量筒(50 mLXl)，烧杯(100 mLXl，50 mLXl)，离心机，离心管。
地衣酚法使用器材:恒温水浴，吸量管(1 mL，2 mL，5 mL)，试管及试管架，S54/53型分光光度计。
[实验材料及试剂]稀碱法使用试剂:(1) 0.2% NaOH溶液100 mL，酵母片，95％乙醇。
(2) 酸性乙醇溶液地衣酚法使用试剂:(1)RNA标准液：为100μg／mL的标准溶液。
(2)地衣酚-铜离子试剂(3)样品溶液：RNA质量浓度为200μg／mL。
[实验步骤]稀碱法实验步骤:取20片酵母于研钵内，加入20 mL 0.2% NaOH，研磨成浆状。
再加入20 mL 0.2% NaOH将其转移至100 mL锥形瓶中，沸水浴上加热30 min，搅拌，冷却，3 000 rp／min, 离心15 min。
将上清液缓缓倾入40mL酸性95％乙醇溶液中(注意要一边搅拌一边缓缓倾入)。
待RNA沉淀完全后，4 000 r／min离心15 min，弃去上清液。
留沉淀，加95％乙醇5 —10 mL，充分搅拌，然后在布氏漏斗上用水泵进行抽滤，再用95％乙醇约20mL分3次淋洗(快速，稍干即收)。
酵母RNA的提取、组分鉴定和含量测定
整理课件
1
【实验目的】
1.学习稀碱法提取RNA的原理和操作方法。 2.了解核酸的组分，并掌握鉴定核酸组分的
方法。 3.掌握地衣酚显色法及紫外分光光度法测定
酵母RNA含量的原理和方法
【实验原理】
酵母核酸中RNA含量较多。RNA可溶于碱性溶液，
Hale Waihona Puke 在碱提取液中加入酸性乙醇溶液可以使解聚的核
1.实验材料：
酵母粉 (或酵母片)
2.实验仪器：
研钵、150mL锥形瓶、恒温水浴锅、布氏漏斗 及抽滤瓶、离心机、漏斗、分光光度计。
整理课件
5
【实验材料和主要仪器、试剂】
3.实验试剂： 0.04mol/LNaOH溶液、95%乙醇、酸性乙醇 溶液、1.5mol/L硫酸溶液 、浓氨水、 0.1mol/L硝酸银溶液 、氯化铁浓盐酸溶 液、苔黑酚乙醇溶液、钼酸铵试剂（将2g 钼酸铵溶解在100ml10%硫酸中）、标准 RNA母液、标准RNA溶液、样品溶液、地衣 酚-铜离子试剂
本法特异性较差,凡属戊糖均有反应.微量DNA 无影响,较多DNA存在时,亦有干扰作用。如在 试剂中加入适量CuCl2 .2H2O可减少DNA的干 扰。此外,利用RNA和DNA显色复合物的最大 光吸收不同,且在不同时间显示最大色度加以区 分。反应2min后,DNA在600nm呈现最大光 吸收,而RNA则在反应整理1课5件min后,在670nm下1呈3
脱氧核糖，为什么？ 3、用你所学过的化学知识,分析3种催化剂： FeC13·6H2O,CuC12·H2O和CuO,哪种催化
剂的催化效果更好？ 4、地衣酚反应中,干扰RNA测定的因素有哪
些 如何能减少它们的影响。
整理课件
核酸的实验
实验操作
(一) DNP与RNP的分离 DNP与RNP的分离 1、 取新鲜肝脏，用表面皿称取0.5g，用0.14mol/L氯化钠 取新鲜肝脏，用表面皿称取0.5g， 0.14mol/L氯化钠 -0.05mol/L柠檬酸钠缓冲液（含1mmol/L EDTA）冲洗除去血 0.05mol/L柠檬酸钠缓冲液 柠檬酸钠缓冲液（ EDTA） 水。洗净后立即将肝脏置于冰浴研钵中，边滴加缓冲液边研磨 洗净后立即将肝脏置于冰浴研钵中， (加入 加入2ml），至匀浆状，转移至离心管中，每次用0.5ml缓冲 ），至匀浆状 ），至匀浆状，转移至离心管中，每次用0.5ml缓冲 液冲洗研钵至离心管， 研磨时间不要超过30min） 液冲洗研钵至离心管，3次。（研磨时间不要超过30min） 2、 匀浆液于3000r/min 离心15min，上清液中即含RNP 匀浆液于3000r/min 离心15min，上清液中即含RNP ，沉淀中含DNP。 沉淀中含DNP。 3、将上清液倒入另一支离心管。再往上述沉淀中加入 将上清液倒入另一支离心管。 3.5ml缓冲溶液 同样离心15min， 3.5ml缓冲溶液，同样离心15min，取上清液倒入另一离心管 缓冲溶液， 。向DNP沉淀加入3ml 10%氯化钠溶液，摇匀，置于冰箱内， DNP沉淀加入 沉淀加入3ml 10%氯化钠溶液，摇匀，置于冰箱内， 氯化钠溶液 DNP充分溶解 留至下午用。 充分溶解， 使DNP充分溶解，留至下午用。
实验3 实验3
二苯胺法测量DNA 二苯胺法测量DNA含量 DNA含量
实验目的
学习和掌握二苯胺法测定DNA含量的原理和方法。 学习和掌握二苯胺法测定DNA含量的原理和方法。 含量的原理和方法
实验原理
DNA分子中的 DNA分子中的2—脱氧核糖在酸性条件中脱水生成ω分子中的2 脱氧核糖在酸性条件中脱水生成ω 羟基- 酮基戊醛， 羟基-γ-酮基戊醛，后者与二苯胺试剂一起加热反应生成 蓝色物质， 595nm处有最大吸收 DNA在40~400µg范 处有最大吸收。 蓝色物质，在595nm处有最大吸收。DNA在40~400µg范 围内，光密度与DNA的浓度成正比。在反应液中加入少 围内，光密度与DNA的浓度成正比。 的浓度成正比 量乙醛，可以提高反应灵敏度。 量乙醛，可以提高反应灵敏度。
生物化学 自测题 无答案。
自测题一一、填空（每空1分，共40分）：1．Pauling等人提出的蛋白质二级结构螺旋模型，每圈螺旋包含个氨基酸，每个螺旋的垂直高度为。
2．DEAE-纤维素是一种交换剂，CM-纤维素是一种交换剂。
3．电子传递链中与蛋白质结合不紧的传递体是，专门传递电子而不传递氢的传递体系是。
4．TCA循环中，三羧酸物质有和。
5．在鸟氨酸循环中，精氨酸是生成和的前体。
6．DNA变性后粘度，A260值；影响DNA Tm值的因素有、和。
7．氨基酸合成代谢中通过直接转氨生成的氨基酸有、、、和。
8．乳糖操纵子的阻遏蛋白是由基因编码，与基因结合阻止转录。
9．可转变为丙酮酸的氨基酸有种，脯氨酸是由产生的。
10．带负电荷的蛋白质与阴离子交换树脂结合很紧，必须用pH或用离子强度洗脱液才能把该蛋白质洗下来。
11．单糖在酸作用下脱水生成，用地衣酚法测定RNA含量是根据反应，二苯胺法测定DNA含量是根据反应。
12．二十种氨基酸中无不对称碳原子，与茚三酮反应生成黄色物质，可以参与形成二硫键。
13．在乳酸发酵过程中，若用14C标记葡萄糖的第三位和第四位碳原子，生成的乳酸分子中碳原子带有标记。
14．一个乙酰CoA通过TCA循环生成ATP。
一个C16脂肪酸彻底氧化分解净生成ATP。
15．脂肪酸合成的限速反应是，催化这个反应的酶是。
16．在糖酵解途径中，葡萄糖经化和化，生成F-1,6-P，然后裂解为。
二、选择题（10分）：1．测定酶活性时测定酶促反应的初速度，其目的是：A．为了提高测定的灵敏度B．为了防止出现底物抑制C．为了节约使用底物D．使酶促反应速度与酶浓度成正比2．关于别构调节酶正确的叙述是：A．所有别构酶都有一个调节亚基，一个催化亚基B．别构酶的动力学特点，是酶促反应与底物浓度的关系呈S形而不是双曲线形C．效应物对别构酶的作用和离子、激活剂对酶激活的机制相同D．别构抑制与竞争性抑制相同3．溶菌酶活性部位是由下列哪两种氨基酸组成：A．谷氨酸和天冬氨酸B．谷氨酸和赖氨酸C．天冬氨酸和精氨酸D．天冬氨酸和赖氨酸4．假尿嘧啶核苷的糖苷键是：A．C-C连接B．C-N连接C．N-N连接D．C-H连接5．脂肪酸合成A．不需乙酰CoA B．丙二酰CoA参加脂肪酸合成的起始和延伸C．有线粒体内进行D．最终产物为十碳以下脂酸6．能转变为乙酰乙酰CoA的氨基酸为：A．精氨酸B．苏氨酸C．亮氨酸D．甲硫氨酸7．下列试剂最适于测定短肽氨基酸顺序的是：A．茚三酮B．溴化氢C．胰蛋白酶D．异硫氰酸苯酯8．血红蛋白和肌红蛋白都是氧的载体蛋白，两者在体内具有不同的功能，前者运输氧和二氧化碳；后者只能贮存氧，供肌肉线粒体利用，这是因为：A．两者的蛋白质结构不相同B．血红蛋白可以与DPG结合，肌红蛋白则不能C．血红蛋白与氧的亲和力与环境中的氧分压有关D．肌红蛋白与氧的亲和力太低9．下列关于细菌蛋白质生物合成的叙述，错误的是：A．起始复合物形成的过程中，需要GTP参加B．移位反应需要GTPC．移位反应不需要GTPD．肽链延长的过程中，需要EF-Ts10．生物体内能直接催化将游离NH3与氨基酸分子结合的酶是：A．丙氨酸转氨酶B．谷氨酰胺合成酶C．谷氨酸脱氢酶D．天冬氨酸转氨酶三、判断题（10分）：1．米氏常数是酶与底物形成复合物的结合常数。
实验十六、RNA的定量测定
三、试剂和器材
1. 试剂 0.1mg/mL标准RNA溶液、地衣酚试剂、 2. 器材 可见分光光度计、恒温水浴锅
四、操作步骤
1. 标准曲线的绘制 取12只试管分成6组，按下表操作。取2管的平均值， 以DNA浓度为横坐标，光密度为纵坐标，绘制标准曲线。
试管
标准RNA/mL 标准 蒸馏水/mL 蒸馏水 地衣酚试剂/mL 地衣酚试剂
待测样品中测得的RNA的µg数 的 数 待测样品中测得的
X 100
RNA%＝ RNA% 样品蛋白质含量高时，应先用5％TCA沉淀蛋 白质；有较多DNA样品时也会发生干扰，可在试 剂中加适量的CuCl2. H2O， 可减少DNA的干扰。 六、思考题
实验十六 RNA的定量测定 的定量测定
一、实验目的
掌握用地衣酚法测定RNA含量的原理和方法。
二、原理
当RNA与地衣酚试剂在沸水中加热时，RNA 被酸降解，所产生的核糖进一步转变为糠醛，它 与地衣酚(3，5-二羟基甲苯)在高铁离子的催化下 可反应生成绿色物，后者在670nm处有最大吸收 峰，在10～100µg/mL范围内其光密度值与RNA 浓度有线形关系。
0 0 2 2
1 0.4 1.6 2
2 0.8 1.2 2
3 1.2 0.8 2
4 1.6 0.4 2
5 2.0 0 2
混合均匀后，置沸水浴中加热45min，冷却， 670nm波长处比色 混合均匀后，置沸水浴中加热45min，冷却，在670nm波长处比色 浴中加热45min 光密度值
2. 样品的测定 取待测样品1mL，加蒸馏水1mL及二苯胺溶 液2mL，沸水浴保温45min，冷却，然后在670nm 波长出测定光密度值。根据测得的光密度值，从 标准曲线上查得相应的RNA的µg数，按下式计算待 测样品的RNA的含量。
RNA的分离提取和测定
指导教师：赵建军
实验目的
学习从兔肝中提取RNA的方法。
通过地衣酚显色法测定R置于醋酸钠缓冲液，SDS，80%酚溶液中的细胞经高速 匀浆后再离心，上层含有水溶性RNA，多糖和小分子 极性物质以及残留的变性蛋白质。下层含有变性蛋白 质和DNA。两相之间有一层凝集的变性蛋白质。水相用 乙醇沉淀，离心后可得RNA 制品。 RNA与浓盐酸共热时，即发生降解，形成的核糖继而 转变成糠醛，后者与3， 5-二羟甲苯反应呈鲜绿色，反 应产物在680nm处有最大吸收，光吸收与RNA浓度 成 正比。
实验试剂
1、RNA标准溶液： 取标准RNA配成100μ g/ml溶液。 2、样品待测液： 准 确 稀 释 成 每 毫 升 溶 液 含 RNA 干 燥 制 品 50100μ g。 3、地衣酚试剂： 先配制0.1%三氯化铁的浓盐酸溶液，实验前以 此溶液为溶剂配成0.1%地衣酚溶液。
提取过程
NaAc（0.05mol/L） 10min 兔肝（0.9g） 浸泡 pH5.0 SDS（250g/L） 80%酚 匀浆 1.5ml 等体积 量取水相 NaAc（2mol/L） 混匀 1/10体积 3000r/min 10min 沉淀 65℃ 匀浆 5-8min NaAc（0.05mol/L） 吸干水分 pH5.0，9.0ml 3000r/min 10-15min
冷却
离心
预冷95%乙醇 混匀 冰浴 沉淀生成 2.5倍 蒸馏水 5ml 溶解备用
离心
测定过程
管号 试剂 ml RNA 标准液 蒸馏水 地衣酚试剂
0 0 2.0 2.0
1 0.4 1.6 2.0
2 0.8 1.2 2.0
3 1.2 0.8 2.0
4 1.6 0.4 2.0
生化实验 地衣酚法测定肝组织中RNA含量
地衣酚法测定肝组织中RNA含量
【实验目的】
掌握用地衣酚法测定RNA含量的原理和方法。
【实验原理】
核酸在碱性条件下水解为碱基、五碳糖和磷酸，这三个组分在核酸分子中等比例存在，故测定其中任一组分均可计算出核酸的量。
酸性条件下RNA中的核糖脱水环化成糠醛，地衣酚(3，5二羟基甲苯)可与其作用呈绿色，在670nm处有最大吸收。
当待测样品中RNA含量在5~50μg/ml范围内时，O.D值与RNA浓度成正比。
用分光光度计测得反应液O.D值，即光密度（特定波长下的吸光度）从而可知样品中RNA的含量。
反应式如下：
【仪器与试剂】
仪器：
721分光光度计、恒温水浴箱
试剂：
）溶液、6mol/L HCl、地衣酚试剂、RNA标准液（0.1mg/ml）5%高氯酸（HClO
4
【实验步骤】
1.待测样品的稀释
取实验一分离所得RNA的上清液1ml，加入5%HClO
5ml,摇匀（此液稀释了5倍）。
4
混匀各管，沸水浴10min（注意严格控制时间）。
3.待上述各管冷却后，以空白管调零点，670nm比色，读取光密度（O.D）。
重复测量3-5组数据，取平均值。
4.计算每克肝组织中RNA含量，单位为毫克每克组织。
【思考题】
1.为何要将分离后的RNA上清液稀释5倍？
2.如何根据数据计算出DNA的含量，请写出公式，解释意义并将其含量计算出来。
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一、目的
学习和掌握测定RNA含量的定糖法（地衣酚法）的原理和操作技术。
二、原理
核糖核酸与浓盐酸共热时，即发生降解，形成的核糖继而转变成糖醛，后者与3，5—二羟基甲苯（地衣酚）反应呈鲜绿色，该反应需用三氯化铁或氯化铜作催化剂，反应产物在670nm处有最大吸收，RNA浓度在20~200微克/毫升范围内，光密度与RNA的浓度成正比关系，在反应液中如混有DNA或其他杂质。
也能给出类似的颜色。
因此测定RNA时可先测定DNA的含量，再计算RNA的含量。
地衣酚法只能测定RNA中与嘌呤连接的核糖，不同来源的RNA所含嘌呤与嘧啶的比例各不相同，因此，用所测得的核糖量来换算各种RNA的含量存在误差。
最好用被测样品相同来源的纯化RNA作RNA-核糖标准曲线，然后从曲线求得被测样品的RNA含量。
三、材料、试剂和器具
（一）试剂
1、RNA标准溶液：取酵母RNA配成200微克/毫升的标准溶液（如不溶，可滴加氢氧化铵溶液，调至pH=）
2、样品溶液：RNA浓度在20~100微克/毫升范围内。
（自己提取）
3、地衣酚试剂，先配制%三氯化铁浓盐酸溶液（A、R）。
使用前再用上述溶液为溶剂配成%的地衣酚溶液。
（临用时配制）
（二）器具
1、试管及管架
2、水浴锅
3、移液管（1，2，5ml）
4、可见光分光光度计
四、操作步骤
（一）RNA标准曲线的制作
取8支试管，编号，按下表加入试剂
加毕，摇匀，置沸水浴中加热15分钟，冷却，测值。
以值为纵坐标，RNA含量（微克/毫升）为横坐标作图绘制标准曲线。
（二）样品的测定
取~毫升样品液于试管中，加蒸馏水稀释至2毫升，后加2毫升地衣酚试剂摇匀，于沸水中煮15分钟，冷却，测。
根据测得的光密度值，从标准曲线上查出相当该光密度的RNA 的含量，按下式计算样品中RNA的百分含量。
RNA含量/毫升待测液=标准曲线查得值×稀释倍数
RNA产率（%）=含量/毫升×总体积
×100新鲜肝重（g）×106
五、注意事项
样品中蛋白质含量较高时，应先用5%三氯乙酸溶液沉淀蛋白质后再测定。
六、实验报告
附上绘制标准曲线图，并计算RNA的含量及产率。
七、思考题
1、采用该法测定RNA的含量有何优点及缺点？
2、地衣酚反应中，干扰RNA测定的因素有哪些？如何能减少它们的影响？。