新生大鼠海马神经元的改良培养

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应用改进的大鼠应激模型证实海马CA3区神经元Nestin、NPY表达变化

６６０；．州中医院大学０４００４广６级研究生，东广州广
３泸州医学院附属医院核医学科，ｔＩ州．１３泸￣１、【应恒定复合型应激大鼠模型，观察其血浆肾素活性（Ｒ）血管紧张素 Ⅱ ＰＡ、
中图分类号：７２Ｒ４文献标识码：Ａ文章编号：６２３５（０８０ — ５１０１７ — ５４２０）５０３ — ５
ＥｖｄｎｃｆＥｘｒｓｉｎＡｌｅａｉｎｆｒＮｅｔｎｎｄＮＰＹｎＣＡ３Ｒｅｉｎｏｉｅｅｏｐｅｓｏｔｒｔｏｏｓｉａｉｇｏｆ
ＮｓｎＮＹ表达变化。【ｅｔ、Ｐｉ结果】 ①急性应激组血浆ＰＡ和ＡｇＩ平比正常对照组显著降低（＜．）尤以ＲｎＩ水Ｐ０１，０
ＰＡ水平的变化更明显。②急、性应激组海马Ｃ３区的ＮｓｎＮＹ免疫阳性反应产物总面积（Ａ）Ｒ慢Ａｅｔ、ＰｉＳ和体视
学光密度（Ｄ值均较对照组低（＜．）急性组的组织损害比慢性组更严重。【Ｉ）ＯＰ０１，０结论】研究成功地构建了本
具有科学理论依据和实用价值的复合性应激大鼠模型，并利用此模型证实应激早期大鼠血浆ＰＡ和ＡｇＩＲｎＩ
水平有降低：观察急、慢性应激大鼠海马Ｃ３区ＮＹ和ＮｓｎＡＰｅｔ表达变化及其变化规律，ｉ结果提示ＮＹ及其水Ｐ解产物在应激所致海马神经元细胞骨架损害和谷氨酸释放过程中可能产生一定的影响。关键词：血浆低肾素活性应激模型；海马；巢蛋白；神经肽Ｙ；大鼠

表达大鼠脑源性神经营养因子腺相关病毒(rAAV-BDNF)对体外培养海马神经元保护作用的研究

脑源性神经营养因子（ＤＦ是神经生长因子ＢＮ）
家族的重要成员，具有促进神经细胞存活、调节中枢
清培养液，牛血清，２血清培养液添加剂，胎Ｂ７无胰
蛋白酶购自ＧｂｏＢＬ公司。ＢＮｉ —ＲｃＤＦ多克隆抗体、
神经系统突触发育和突触可塑性、调节神经递质的释放等作用，在神经元的修复及结构重建过程中起着重要作用＿ｊｌ。前期研究中我们建立了稳定的表。
达大鼠脑源性神经营养因子腺相关病毒载体（ＡＶｒＡ．
Ａｔ单克隆抗体购自Ｃｅｉｎｃｎｉｈｍｃ公司。Ａｔ多克隆ｏｃｎｉ抗体购自ＵｓｔＢｏｃｎｌｙ公司。辣根过氧化物ｐｔｅｉｅｈｏｇａｔｏ
Ｒ３２３２－３Ｒ９文献标识码Ａ文章编号１０－８Ｘ（０８１－１００００４４２０）２１０－３
中国图书分类号
［摘
要］目的：研究表达大鼠脑源性神经营养因子腺相关病毒（ＡＶＢＮ）ｒＡ－ＤＦ对体外培养海马神经元的保护机制。方
中国免疫学杂Leabharlann ２００８年第２４卷・
神经内分泌与免疫・
表达大鼠脑源性神经营养因子腺相关病毒（ＡＶＢＮ对体外培养海ｒＡ．ＤＦ）
马神经元保护作用的研究
张惊宇赵节绪（吉林大学第一医院神经内科，长春１０２）３０１
ｓｒｉｌａｆｈｒａｒ－ｄｃｅｒｓａｉｃａｅ５ＣｎｌｓｎＴｅｏｉｎａｅｏａｓｉｅｒｓｖｃｒａｒｅｔｕｖａｒｅｏｔｓｕｅｉｕｅｎｕｏｓｎｒｓｄｂ６％．ｏｃｉ：ｈ￣ｍｎｔｄｎ－ｏａｄｖｕｔｐｏｖｔｅｅｒｆｅｎｄｎｗｅｙｕｏｂａｓｃｔｉｅｏＣｎｔｃ

IGF-1和EPO对新生大鼠海马源性神经干细胞分化的实验研究

验分对照组、ＧＦ一１组、同浓度的ＥＩ不ＰＯ组及ＩＧＦ— ｌＥＰ联合组，传３代的ＮＳｓ的分别加入各、０将Ｃ
组中。诱导分化７天时，用免疫细胞化学染色、测ＮＥ、ＡＰ的表达，察ＮＳｓ分化状况，作采检ＳＧＦ观Ｃ并
组之间ＮＳＥ阳性率和ＧＦＡＰ阳性率无统计学意义（Ｐ＞００）结论胰岛素样生长因子一１和不同．５。浓度的ＥＯ都促进ＮＳｓ向神经元分化，在一定浓度范围内ＩＦ１和ＥＯ具有协同效应。ＰＣ且Ｇ一Ｐ【关键词】神经干细胞胰岛素样生长因子一１促红细胞生成素分化
将传３代的神经干细胞吹打为单细胞悬液，整细调胞密度为１０／， ×１。ｍｌ接种于预先置有涂布多聚赖氨酸盖玻片的６孔培养板中，贴壁培养２ｄ后。撤除
ＥＦ和ｂＧ。根据培养液中的成分不同分为：ＡＧＦＦ组基础培养液＋１胎牛血清。Ｂ组基础培养液＋Ｏ
ＤＭＥＦ２干粉培养基，２Ｍ／１Ｂ７添加剂，皮生长因表子，碱性成纤维细胞生长因子，岛素样生长因子一胰
１促红细胞生成素，，抗大鼠Ｂｄｒｕ兔抗大鼠巢蛋白单抗，抗兔ＩＧ，抗大鼠ＮＳ单抗，抗大鼠羊ｇ兔Ｅ兔
１４０：０。４℃孵育过夜，ＢＰＳ漂洗３次，滴加山羊抗兔

胍丁胺对皮质酮致原代培养大鼠海马神经元损伤的保护作用

Ｉｅｐｅｅｔｓｕｄｎｔｒｓｎｔｙ，ｔｅｎｕｏｒｔｃｉｅｅｆｃｆａｒａｉｅ，ａｌｓｉｓｒｌｔｄｓｇａｔｗａｓ，ｗａｘｏｅｈｈｅｒｐｏｅｔｖｆｅｔｏｇｎｔｎｓｗｅｌａｔｅａｅｉｎｌｐａｈｙｓｅｐｌｒｄ．
保护作用，此作用与ｃＭＰＰＡＣＥＡ —Ｋ —ＲＢ通路和ＭＥ — Ｒ — ＲＢ通路密切相关。ＫＥＫＣＥ
关键词：胍丁胺；抑郁；经元保护；神信号通路
ＮｅｏｒｔｃｉｎｆＡｇａｉａｎｔＣｏｔｃｓｅｏｅＩｄｕｃｄＬｅｉｎｎＣｕｔｅｕｒｐｏｅｔｏｏｍｔｎｅＡｇｉｓｒｉｏｔｒｎｎｅｓｏｉｌｕｒｄＨｉｐｏａｐａｕｒｎｓｐｃｍｌＮｅｏ ①
ａｔｉｆｕｆｔｄｐｌｓｃａｉｅｇｉｓｄｎｕｉｓｉｄｐｎｅｔｎｖ・ｃｖｙｏｌｅｏｙａｈｒｓａａｎｔｅｇｅｖｕｅｅｄｎｉｉｔｓａｃｄｒｓｏ
２０，１（）２６Ｏ６２０３：３
ｓｃｈｒｅｎａｃｅｆｎｔｎｏｍｍｕｏｏｉａｅｅｔｒｃｌｎｉａｃａｉｓｅｈｎｅｔｕｃｏｆｉｄｈｉｎｌｇｃｌｆｃｏｅｌｉｍｍｕｏｓｎ
ｌｙｍｔ［］Ｉｍｎ１ｔ＆，９，３（）１１ｆｗｅｔｅｙＪ．ｍｕｏｏｏｒ．Ｍｅｏ１１１９２：ｈ９７［２１］

世界上最完善最详细的神经元原代培养完全黄金版

世界上最完善最详细的神经元原代培养完全黄金版世界上最完善最详细的神经元原代培养完全黄金版[精华]序言：国内外关于原代培养有很多文献，不幸的是，没有一篇是详细的，没有一篇解答过why. 为了让大家少走弯路，根据我杀过3000只老鼠的经验，我把我这几年摸索的经验和大家分享，请求多投几票得几个叮当。

相信你follow我的这篇文章一定会做的很好。

我的标题说的很像吹牛，但是我是严肃认真的说的，I earn it.note:这篇文章全是我个人的经验，99。

9%原创，经过无数失败的到的最完美的原代神经元培养法，除了最后那一副图是来自下面第2行那篇文献，所以我才说是99.9%原创。

（注：附录的图是常用的消化酶对实验的存活率影响，来自下面链接里的文献）另外，成年鼠的原代培养我没有摸索过，推荐一篇文献在我以前的帖子（无需叮当）（/bbs/post/view?bid=156&id=17651341&sty=3）本篇专门讨论胎鼠和新生鼠神经元的原代培养。

1.材料选择。

一定要严格按照国际上，NCBI数据库，其他文献的材料一致。

胎鼠就要胎鼠，新生鼠就要新生鼠，不能混淆。

因为新生鼠有一些受体，在培养的工作中失去功能，会不能再生，比如NMDA受体。

和文献不同会导致错误结论，甚至困惑。

很多人写信问我新生鼠的培养问题，我回答用新生鼠的实验很少，八成是你自己搞错了实验对象，请确认国际上的相关研究文献所用老鼠，再来问我下面的问题。

2，培养基选择（neurbasal/neurobasal-a,invitrogen Co.ltd)。

我强烈不建议用血清培养。

原因是：首先，血清刺激胶质细胞和杂细胞分裂，最后非常影响神经元产量；其次，为了抑制胶质生长，往往要加入阿糖孢苷。

严重的毒性会影响许多灵敏实验；再次，最重要的，血清培养的细胞状态很不均一，从正常到凋亡都有，严重影响试验准确，而无血清专用培养基所有的正常细胞都处于一样的状态，要么都好，要么都差，高度一致。

2型糖尿病大鼠前额叶皮质及海马神经元形态的改变研究钟泽清

神经元形态的改变是导致糖尿病患者出现神经系统功能障碍的形态学基础。
［关键词］乙型糖尿病; 大鼠; 前额叶皮质; 海马; 神经元
［中图分类号］ R － 32
［文献标识码］ A
［文章编号］ 1008 － 8849
（ 2013） 06 － 0597 － 03
Study on changes of neurons in prefrontal lobe cortex and hippocampus of rats
［作者简介］钟泽清（ 1975—），女，主管护师，主要从事内科护理和老年病护理及干部保健工作。
［通信作者］谢丹丹，主管护师，E － mail： m15907281100 @ 163. com，Tel： 15909281110
的柠檬酸钠缓冲溶液； Golgi － cox 溶液的配制［3］：将重铬酸钾、铬酸钾、氯化汞用双蒸水配制成 5% 溶液，单独储存；浸泡标本前将配制的重铬酸钾、铬酸钾、氯化汞溶液，双蒸水按 5∶ 4∶ 5∶ 10 混合配制（使用深色玻璃瓶储存，现配现用）。 1. 3 造模方法参考文献［4 － 5］制作 2 型糖尿病模型，15 只大鼠给予高脂饲料喂养 3 周后，随机分成模型组 10 只和对照组 5 只。造模前 1 d 禁食 12 h，不禁水；将 STZ 用 pH 4． 2 的柠檬酸钠缓冲溶液配制成浓度为 2% 的溶液（即配即用），按 25 mg / kg 腹腔注射每天 1 次，连续 2 d。对照组给予相同容量的柠檬酸钠缓冲溶液注射。注射 2 周后，大鼠测空腹血糖（测试前禁食 12 h），以血糖＞ 16． 7 mmol / L 为模型成功标准，造模成功 7 只。2 组大鼠均高脂饲料喂养 2 周后取材。 1. 4 Golgi-Cox 染色方法［6］大鼠在过量 10% 水合氯醛腹腔麻醉后，4 ℃ 生理盐水 200 mL、200 mL 4% 多聚甲醛心内灌注后断头取脑，以前囟为基准做冠状切面，取前囟前后各 4 mm 2 个组织块，用 Golgi-cox 溶液冲洗后，放置在棕色玻璃瓶中，密封，置于 37． 1 ℃ 的温箱中 48 h。组织取出后用双蒸水冲洗，洗净 Golgi-cox 溶液，用 3% 琼脂糖包裹脑组织，放置在振动切片机上（太和医院病理教研室），做 200 μm 冠状切片。切片漂浮在双蒸水中。使用漂片法，按下述步骤操作： ①双蒸

大鼠鼠胚海马神经元缺氧复氧致细胞凋亡模型的建立

（ｆｌｔｏｐｔｆａｈｎＭｄｃｌｏｌｅＴｉ７０Ｃｉａ）ＡｆｉｅＨｓｉｌｌａｅｉｌｇ，ａａ２１０，ｈｎ．ｉａｄａｏＴｓａＣｅｎ
Ａｂｔｃ：ｂｅｔｅＴｓｂｉｉｐｃｍａｎｕｏｐｐｏｉｍｄｌｎｕｅｙｈｐｘａｒｏｙｅａｏ．ＭｔｏｓＯｓｒｔＯｊｃｖ：ｏｅｔｌｈｈｐｏａｐｌｅｒｎａｏｔｓｏｅｉｄｃｄｂｙｏｉｅｘｇｎｔｎｅｈ：ｎａｉａｓｓ・ｉｄ
ｏｔｓｓｗａｔｄｅｙｕｉｇｍｅｈｓｏｉｈ — ｍｓｔｉｉｇｐｏｉｓｓｕｉｄｂｓｎｔｏｆＷｒｔｄｇＧｉａｓｎｎ，ＴＮＥＬａＵ．Ｒｅｕｔ：Ｔｅｐｒｅｔｇｆａｏｔｔｅｒｎａｓｌｓｈｅｃｎａｅｏｐｐｏｉｎｕｏｓｗｓｃｆｕｄｔｅｉｃｅｓｄａｏｇｗｉｈｒｌｎａｉｎｏｙｏｉ—ｅｘｇｎｔｎｏｎｂｎｒａｅｌｎｔｔｅｐｏｏｇｔｆｐｘａｒｏｙｅａｉ．Ａｐｐｏｉｏｅｒｎｎｅｇｉｇ４ｏｒｅｘ — ｏｈｏｈｏｏｔｓｓｆｎｕｏｓｕｄｒｏｎ８ｈｕｓｒｏｙｇｎｔｎａｔｒ４ｈｕｓｏｙｏｉａｓｌ．ｉｎｆａｔｏｃｕｉｎ：Ｈｉｐｃｒｐｌｎｕｏｐｐｏｉｍａｅｉｄｃｄｂｙｅａｉｆｏｒｆｈｐｘａｗｓｍｏｔｓｇｉｃｎ．Ｃｎｌｓｏｏｅｙｉｐｏａｎａｅｒｎａｏｔｓｓｙｂｎｕｅｙｈ — ｐｘａｒｏｙｅａｉｎａｄｃｌｒｄｈｐｏａａｅｒｎｎｅｇｉｇ４ｏｒｅｘｇｎｔｎａｔｒ４ｈｕｆｈｐｘａｃｎｂｏｉ—ｅｘｇｎｔｎｕｔｅｉｐｃｍｐｌｎｕｓｕｄｒｏｎ８ｈｕｓｒｏｙｅａｉｅｏｒｏｙｏｉａｅｏｕｏｏｆｓｕｅｓａｖｉｌｅｌｄｌｆｈｐｏａａｅｒｎｌａｏｔｓｓｆｒｆｔｅｔｄｅ．ｓｄａｎａａｌｅｃｌｍｏｅｉｐｃｍｐｌｎｕａｐｐｏｉｏｕｈｒｓｕｉｓｂａｏｏＫｅｒｓａｏｔｓｓｉｐｃｍｐｌｎｕｏ；ｈｐｘａｒｏｙｅａｉｎａｙｗｏｄ：ｐｐｏｉ；ｈｐｏａａｅｒｎｙｏｉ－ｅｘｇｎｔ；ｒｔｏ

谷氨酸受体拮抗剂对培养大鼠海马神经元活力的影响

［文章编号］1006-2440（2012）06-0548-04谷氨酸是一种兴奋性氨基酸，主要有N-甲基-D-天冬氨酸（NMDA ）和AMPA 两种亚型。

以往研究表明它对神经元具有兴奋性毒性作用[1]，人们常用其受体拮抗剂来阻断这种毒性作用[2]。

但近年研究发现，谷氨酸的受体拮抗剂虽阻断了谷氨酸的毒性，但自身似乎也对细胞有一定的毒性，这种作用还不为人们所熟知[3]。

本研究分别使用NMDA 和AMPA 的拮抗剂作用于培养海马神经元，旨在探讨不同受体拮抗剂对神经元的影响。

1材料与方法1.1材料（1）动物：孕18天SD 胎鼠30只由南通大学动物实验中心提供。

（2）主要试剂：DMEM/F12培养液、Neurobasal 无血清神经培养基、B27、0.5%胰蛋白酶（Gibco 公司），台盼蓝（trypan ）、四甲基偶氮唑盐（MTT ）、酸化异丙醇、卓西平马来酸盐（MK-801）、艾芬地尔（ifenprodil ）、CGP-37849、L-701.324、NBQX 和HA-966（上海宝曼生物公司）；TUNEL 试剂盒（德国罗氏公司）；多聚赖氨酸、阿糖胞苷（Sigma 公司）。

*[作者简介]李爱红，女，汉族，生于1970年7月，江苏如皋人，硕士，副主任医师。

研究方向：颅脑损伤及脑保护治疗。

通信作者：郭爱松，E-mail:guoaisong@谷氨酸受体拮抗剂对培养大鼠海马神经元活力的影响李爱红1*，郭爱松2，陈鑫1（南通大学附属医院1神经内科；2康复医学科，江苏226001）[摘要]目的：观察N-甲基-D-天冬氨酸受体拮抗剂卓西平马来酸盐、艾芬地尔、CGP-37849、L-701.324、HA-966和AMPA 受体拮抗剂NBQX 分别对培养大鼠海马神经元细胞活力的影响。

方法：取孕18天的SD 胎鼠海马神经元细胞原代培养，培养的细胞在加入上述药物后，在培养第2天和第7天行台盼蓝染色观察细胞存活情况，四甲基偶氮唑盐法检测细胞存活率，TUNEL 法检测细胞凋亡。

胎鼠海马神经元原代培养及转染条件的优化

统计学分析用ＳＰＳＳ１３．０软件进行统计学分析。
２结果
２．１胎鼠海马神经元原代培养经胰蛋白酶消化后接种的神经元细胞分布均匀
（图１Ａ），折光性好，于第４ｈ左右贴壁，圆而透明，折光性好，分布较均匀。培养１８￣２４ｈ后，多数神经元贴壁牢固，少数胞体较大的神经元有突起生成；培养第７２ｈ（图１Ｂ），神经元胞体增大，饱满突起较长相互交汇成网状神经网格基本形成（图１Ｃ）；培养第６ｄ，神经细胞胞体不再继续增大，突起长度稳定，光晕明显，形成完整神经网络（图１Ｄ）。２．２荧光染色结果
Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎｋｉｔ
Ｃｏｎｔｒｏｌ
９１．６８±３．２９
用乙醚麻醉孕１８ｄ大鼠，无菌条件取胚胎，断头、分离海马组织，胰蛋白酶３７ ℃消化１０～２０ｍｉｎ２００目不锈钢网过筛，种植液配制成３ ×１０５／Ｌ细胞悬液加入预先用１０ｍｇ／Ｌ多聚赖氨酸包被的６孔培养板中，培养后４ｈ换成无血清神经元培养基，置５％ＣＯ２，３７ ℃培养条件下培养，每周半量换液２次。不同时间段于倒置显微镜下观察细胞生长状况并照像分析。对于纯度的鉴定用ＭＡＰ２一抗（１：１００）标记神经元，以ＣＹ３标记红色荧光二抗（１：２００）于荧光显微镜镜下观察分析。１．３大鼠胎鼠海马神经元的转染及优化
转染方法分别按照ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅＴＭ２０００转染试剂盒，大鼠神经元电转试剂盒及ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅＴＭＬＴＸ转染试剂盒的方法进行转染。用三种不同试剂转染体外培养的海马神经元试剂及用量，见表１。细胞转染
Ｔａｂｌｅ１．Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎｒｅａｇｅｎｔａｎｄｐｌａｓｍｉｄ
Ｔａｂｌｅ２．ＴｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙａｎｄｓｕｒｖｉｖａｌｒａｔｅｏｆｈｉｐｐｏｃａｍｐａｌｎｅｕｒｏｎｓｂｙｄｉｆｆｅｒｅｎｔＴｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎｍｅｔｈｏｄｓ

腺苷对原代培养的大鼠海马神经元大电导钙激活钾通道的作用

ＡｂｔａｔＯｂｅｔｅＴｏｉｖｓｉａｅｔｅｅｆｃｓｏｄｎｓｎｎｌｒｅｃｎｕｔｎｅｃｌｉｍ－ｃｉａｅｏａｓｕｃａｎｌｓｒｃｊｃｉｖｎｅｔｔｈｆｅｔｆａｅｏｉｅｏａｇｏｄｃａｃａｃｕａｔｖｔｄｐｔｓｉｍｈｎｅｓｇ
ｓｄｒｅｖｄＴｈｅｒｎｒｒｐｒｄｂｒｐｉｉａｉｎａｄｂｏｎｓｎａｔｍｅｅ．ｍｍｕｏｌｏｅｃｎｅｏＡＰ Ⅱ ｉｅｗｅｅｒｍｏｅ．ｅｎｕｏｓｗｅｅｐｅａｅｙｔｙｓｎｚｔｎｌｗｉｇｕｉｇｐｓｏｔｒＩｏｎｆｕｒｓｅｃｆＭ
较大，以快速激活且几乎不失活的外向电流；苷（～１０ＦｌＬ可以增大Ｂ电流，度越高，长幅度越大；０可腺１０ｍｏ／）Ｋ浓增１０ＦｌＩ腺苷对Ｂｃ电流的影响具有电压依赖性，ｍｏ／Ｋ同时它还可以使Ｂｃ电流的激活曲线负向漂移。结论腺苷可以增Ｋ大海马神经元Ｂ电流幅值，可能是腺苷作为内源性抗癫痫物质发挥抗癫痫作用的机制之一。Ｋ这关键词：苷；海马神经元；膜片钳技术；大电导钙激活钾通道腺
（ＢＫ（ｉｕｔｅｉｐｏａｐａｕｏ．ｅｈｏＴｈｅｈｉｏｃｍｐｅｅｉｏａｅｒｍｏｔａｔｎｄｂｏｓｅｓｏｕｔ）ｎｃｌｕｒｄｈｐｃｍｌｎｅｒｎｓＭｔｄｓｐｐａｉｗｒｓｌｔｄｆｏ２４ｈｎｅｎａｅｒｓａｌｏｄｖｅｓｌ —

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培养，４用％多聚甲醛固定，ＮＣ特异性标记物行Ｓｓ
原代细胞换成神经干细胞培养液后２，成小ｄ形细胞团，５至ｄ形成较大细胞球。将细胞球吹打成单
细胞和小细胞团后５。ｄ细胞又增殖形成细胞球（图
ｐｅｉｎ，ｃｎｒｉｓｌｔｒｉｖｓｉａｉｎｒｍｅｔｗｈｉｈｕｄｅｌｅｕｈｅｎｅｔｇｔｏ．ＫｅｙｗｏｒＣｕｔａｉｎ；Ｎｅｒｌｓｅｃｌｓｄｓｌｉｔｏｖｕａｔｍｅｌ；Ｎｅｏ；Ｒａｕｒｎｔ
某些中枢神经系统疾病，如脑卒中等常引起病灶区神经元变性、坏死，塞区形成，致患者运动梗导障碍、失语、至痴呆。甚目前，神经干细胞移植治疗为脑卒中等脑损伤疾病提供了可能ｌｌ经干细胞１。神、２
的神经元，对体外研究神经元对不同刺激的反应、新
药检测及完成类似的细胞生物学任务有重要意义。同时也可为神经细胞移植治疗提供种子细胞。
泸州医学院学报
２３０
２１０１年
第３４卷
（ｅｒｌｔｍｃｌ，ＳｓｎｕａｓｅｓＮＣ）是一类具有自我复制及多ｅｌ
可靠、简便的培养方法。
１材料与方法
１１动物与试剂．
新生１ｄ大鼠２只，由泸州医学院实验动物中心
提供；皮细胞生长因子（Ｇ）自ＧＢＣ；ＭＥ表ＥＦ购ＩＩＤＭ／Ｆ２培养基、２培养基添加剂购自Ｓｇａ公司；蛋１Ｎｉｍ巢白（ｅｔ）克隆抗体、管相关蛋白（Ｐ）克ｎｓｎ多ｉ微ＭＡ２单
培养基重悬细胞，种植在２ｍｌ养瓶内，５培种植密度为１ｌ５ｌ于３ｏ５Ｃ２箱中培养２ｈ此时ｘ０／，７Ｃ，％Ｏ孵ｍ４，
瓶内漂浮大量细胞团块．部分细胞贴壁．少收集漂浮
作者简介：小青（９４）女，师高１７一，讲
起交织成网（３。继续培养，胞生长良好，培图）细在养２ｄ后。０细胞逐渐死亡。在分化后７ｄ将分化细胞
行ＭＡ２细胞免疫化学检测。胞呈棕色，阳性细Ｐ细为
胞（４）图。
２１神经干细胞培养及鉴定．
Ｒ３３８文献标识码Ａ文章编号１０ — ６９（０１３０２ — ３００２６２１）－２８０
中图分类号
ＩＰＲｏＶＥＤＭＣＵＬＴＵＲＥＰＰｏＦＨＩｏＣＡＭＡＬＮＥＵＲｏＮＳｏＦＮＥｏＮＡＴＡＬＲＡＴ
ｉｅｕ－ｒｅｍｅｉｍｏｔｉｉｇＮ２ｓｐｌｍｅｔｎｓｒｍｆｅｄｕｃｎａｎｎｕｐｅｎ．Ｒｅｕｔｓｌｓ：ＴｅＮＳｒｍｉｐｃｍｐｓｏｅｎｔｌｒｔｅ — ｈＣｓｆｏｈｐｏａｕｆｎｏａａａｘ
泸卅医学院学报Ｉ
２２８
２１０１年
第３４卷
第３期
ＪｕｎｌｆｕｈｕＭｅｉａＣｌｇＶｏ．４ｏｒａｚｏｄｃｌｏｌｅｏＬｅ１Ｎｏ３２３．０１１
毫
害
新生大鼠海马神经元的改良培养木
神经元是中枢神经系统中高度分化细胞，在出
生后不能有丝分裂，能传代，受损后不能再生，不在其体外培养条件下也难以增殖，故神经元的培养主
要用于原代培养。而神经胶质细胞有较强的存活能力，在体外培养能分裂增殖，可进行传代培养。神经
壁生长，除ＥＦ继续培养２ｈ在细胞球边缘伸出撤Ｇ４，
ｎｓｎ细胞免疫化学检测，一部分细胞球继续培养，ｅｔｉ其培养液撤除ＥＦＧ，加入１２培养基添加剂，％Ｎ每３ｄ换培养液１次，培养７ｄ后用４％多聚甲醛固定，
通讯作者：朝鲜（９９，，授杨１６一）男教
第３期高小青等：生大鼠海马神经元的改良培养新
２９２
的细胞，心，上清，入神经干细胞培养液（离弃加含
ＥＦ２ｔ／ｌ２培养基添加剂）悬细胞，用Ｇ０ｚＬ，％Ｎｇ重再吸管反复吹打，至形成单细胞悬液，置３ ℃，％直放７５Ｃ：箱中，Ｏ孵２或３ｄ更换１培养液。培养５次ｄ左右，细胞成球．细胞球吹打成单细胞和小细胞团，将换培养液继续培养。取第２代细胞球接种到经多聚赖氨酸处理的玻片上，部分细胞球贴壁６一ｈ后终止
１２新生大鼠神经干细胞的培养、．分化及鉴定取新生大鼠大脑组织，０ＯｍｏＬ磷酸缓冲液用．ｌｉ／
（Ｂ）ＰＳ冲洗，去脑膜和血管，剥在解剖显微镜下剪取
元体外培养模型和标准体系对于中枢神经系统疾病
高小青，杰邓莉，侃，朝鲜，杜，郭杨王特为
（州医学院：学基础研究中心；教务处，泸医四川泸州６６０）４００
摘要
目的：讨体外培养高纯度神经元的方法。方法：外培养新生大鼠海马神经干细胞，使神经干细胞在无血清Ｎ２探体再
隆抗体购自武汉博士德公司。
向分化潜能的细胞，在一定条件下向神经元和胶质细胞方向分化。单纯神经干细胞移植入脑内后，但多数干细胞向胶质细胞分化，而向神经元方向分化较少［因此，果能在体外建立一种高效、定的神经３ｊ。如稳
细胞移植治疗有重要意义。本实验通过在体外培养新生大鼠海马神经干细胞。在无血清条件下使其向
海马组织，成约１ｍ。小，移入离心管，吸剪ｍ大转用
神经元方向分化，为获得高纯度神经元提供了一个
ｐｒｓｅｅｔｎ，ａｄｍｏｔｄｆｅｅｔａｅｅｌｆＮＳＣｓｅｐｅｓｄＭＡＰ２ｓｏａｉａｌｅｅａｆｅｅｔａｅｅｌｘｅｓｄｎｓｉｎｓｉｆｒｎｉｔｄｃｉｓｏｘｒｓｅ，ｐｒｄｃｌｙｓｖｒｌｄｉｒｎｉｔｄｃｌｓｅ — ｆ
ｐｅｓｄＧＡＰＣｏｃｕｉｎＨｉｈｙｐｒｅｅｒｎｃｎｂｂａｎｄｂｅｍｅｈｄａｏｔｄｂｕｈｒｎｔｅｅ — ｒｓｅＦ．ｎｌｓｏ：ｇｌｕｉｄｎｕｏａｅｏｔｉｅｙｔｔｏｄｐｅｙａｔｏｓｉｈｘｉｆｈ
基金项目：川省教育厅项目（０６１５；川省科技厅项四２０Ａ５）四
目（０６１— ０ — ）２０Ｊ３０５１
管均匀机械吹打，使其成细胞悬液，Ｏ０ｍｉ心ｌ０ｄｎ离１ｍｎ弃上清，入１％胎牛血清ＤＭＦ２１１０ｉ，加０ＭＥ／１（：）
图１培养的细胞球（１０ × ０）
图２细胞球抗ｎｓｎ染色阳性（１０ｅｉｔｘ０）
图３神经球分化７ｄ细胞（ｌｏｘｏ）
图４分化细胞抗ＭＡＰ２染色陛（０ｘ１０）
３讨论
胶质细胞可以提供神经元营养因子，有维持神经元存活和促进神经元突起生长的功能，但是过度生长不仅影响对神经元的观察，而且抑制神经元的生长和分化，而造成神经元提早退化。反因此获得高纯度
Ｇａａｑｎ，ｔａｏＸｉｏｉｇｅｌ
ＤｐｒｅｔｆＡａｍｎｅｒｂｏｏｙＬｚｏｄｃｌｏｌｅｅａｔｎｏｔｙａｄＮｕｏｉｌ，ｕｈｕＭｅｉａＣｌｇｍｎｏｇｅＡｓａｔｂｔｃＯｂｅｔｅＴｖｓｇｔｔｅｍｔｏｆｂａｎｎｉｏｔｎｏｎｕｏｉｏｔｏｓＨｐｒｊｃｉ：ｏｉｅｔａｅｈｅｈｄｏｔｉｉｇｈｇｃｎｅｔｆｅｒｎｉｖｔ．ｈｄ：ｉ— ｖｎｉｏｈｎｒＭｅｐｃｍｌｅｒｌｔｍｃｌ（Ｓｓｆｅｎｔｔｅｅｃｌｒｄｉｖｔ，ｎｅｉｅｅｔｔｅｒｎｄｅｔｎｏａａｎｕａｓｅｓＣ）ｏｏａａｒｒｕｔｅｉｏａｄｔｎｄｆｒｎｉｅｔｎｕｏｉｃｉｅｌＮｎｌａｗｕｎｒｈｆａｄｏｒｏ