分离大鼠海马流程图
膜片钳之问题汇总
膜片钳网上问题收集汇总膜片钳之实验操作篇1、消化分离海马锥体细胞时，应该通氧气？不用通氧，直接放入CO2 孵箱里就行了。
电极内液应该过滤完分装入EPPENDORF 管，用时再拿出来。
尽量避免污染。
另外，环境中的灰尘也要考虑。
细胞外液要及时清洗。
2、全细胞破膜以后串联电阻总是在不断上升，膜渐渐的又融合起来了。
有没有什么办法解决串联电阻上升是由于破膜不完全，或者电极内液有污染堵塞电极所至。
解决方法：适当增大电极的口径，以利于破膜；电极内液使用前一定用0.22目滤器过滤；灌注电极液的器具也要保持洁净；电极现用现拉；电极下降入细胞外液时给予一定的正压防止此过程中灰尘堵塞电极。
3、破膜以后封接电阻有所降低的话，会不会影响记录到的动作电位？通常情况下offset调0，是在zero程序下，holding在0，给一个5-10mv，持续2ms的电压刺激，然后用offset补偿电极尖端电位。
axon 破膜后电阻当然会下降，根据我的经验瞬时电阻应在100M以上，之后会上升，以稳定在500M以上的为佳，越高越好。
4、第一军医大学高天明教授组分离大鼠海马神经元的方法：脑片的制备与神经元的急性分离成年Wistar大鼠(200~250 g)麻醉后(水合氯醛40 mg/100 g)迅速断头取脑, 置于0~4℃的高浓度蔗糖溶液中冷冻约2 min, 再用振动切片机(World Precision Instruments MA752-045)切成400 μm厚的脑片。
高浓度蔗糖溶液的成分为(mmol/L): 蔗糖 234、 KCl 2.5、 Na2HPO4 1、 MgSO4 4、 CaCl2 0.1、 HEPES 15、葡萄糖 11、用1 mol/L的NaOH调pH值至7.3。
将切好的脑片置于通以95% O2+5% CO2混合气的EBSS液中孵育1~6 h (室温), 然后将脑片移入低Ca2+的羟乙基磺酸钠缓冲液中, 并在解剖显微镜下用细解剖针按Paxinos图谱所示, 将海马CA1区含锥体细胞层的一小块组织从脑片上分割下来, 将组织块放入用100% O2饱和的HBSS液中(33℃)用链白蛋白酶(protease XIV, 1.1~1.4 mg/ml)消化30~45 min后取出, 置于低Ca2+的羟乙基磺酸钠缓冲液中清洗3次, 用尖端经火抛光处理的吸管(口径依次为500、 300和150 μm)将之吹打成细胞悬液, 并移数滴至盖玻片上。
大脑海马分离图谱
大脑海马分离图谱（一）step 1:This is a dorsal view of a mouse’s skull, in order to access the brain you can cut along the coronal suture and sagittal suture then pull off both sides of parietal bone and interparietal bonestep 2: Now the skull is open and you can see the brain clearly, in order to get the hippocampus you’d better keep the brain in the cranial cavity so the brain will not move when you continue with the following stepsstep 3: In order to expose the hippocampus you need to remove the cerebral cortex covering it. The first incision is at the end of the hemisphere; the incision should be about 0.7mm deep for most adult mouse that you might not hurt the hippocampus while to expose it. The 2nd incision is about 1.5-2mm in front of the first one, this incision you need cut into the lateral ventricle, both of the incisions go to the ventral of the brain and meet there. Now this piece of cortex is free, pull it up, you will see the hippocampus just like in this picture, also you can see the CSF in the opened ventricle.step 4: Keep working on the other side of the brain pull up both sides of the cortex that covering the hippocampus along the ventricle. Now you can see the dorsal part of the hippocampus. Separate the rest of the hippocampus from the cortex coveringit along the surface of the hippocampus towards the ventral part of the hippocampus.step 5: Keep working on the other side of the brain pull up both sides of the cortex that covering the hippocampus along the ventricle. Now you can see the dorsal part of the hippocampus. Separate the rest of the hippocampus from the cortex covering it along the surface of the hippocampus towards the ventral part of the hippocampus.step 6: Now you need to free the hippocampus from the surrounding tissuestep 7: Here is the hippocampus picked out from the brain.（二）大鼠的海马的分离是很容易的,具体做法是:首先对大鼠进行麻醉后断头取脑,手持头部将大鼠的颈部用剪刀剪断,用手指将其头皮拉到前端,用小剪刀沿中线位置将颅骨剪开,轻轻用剪刀将颅骨向两边翻开,这是就将这个大脑暴露出来,用神经剥离子轻轻剥出大脑,放入通入氧气的0-4度的ACSF 中降温一分钟左右取出,用剃须刀片在两个大脑半球一下切出脑干部分,并将大脑从中间切开,用剥离分针轻轻将大脑和小脑分开中间的部分就是海马,用剥离分针的钝端轻轻的挤出海马就可以了。
新生期母婴分离致大鼠海马细胞凋亡的信号机制
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泸 州 医 学 院学 报
２ ２ ８
２ ０ １ ３年
第３ ６卷
第 ３期
Ｊ ｏ ｕ ｒ ｎ ａ ｌ ｏ ｆ Ｌ ｕ ｚ ｈ ｏ ｕ Ｍｅ ｄ ｉ ｃ ａ ｌ Ｃ ｏ ｌ ｌ ｅ ｇ ｅ Ｖｏ １ ． ３ ６ Ｎｏ ． ３ ２ ０ １ ３
新 生期母 婴分离致大 鼠海 马细胞凋亡 的信 号机 制术
张建彬 ， 孙鸿 燕 ， 董 文斌， 乔力 媛 ， 李 清平 ， 雷小 平 ， 康 兰
（ 泸卅 １ 医学院 ： 附 属医 院 新 生 儿 科 ； 护理学院 ， 四川 Ｉ 泸州 ６ ４ ６ ０ ０ ０ ）
成年大鼠海马CA1区锥体细胞K_(ATP)通道的特性
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当细胞膜内外两侧的S T 浓度均为)N(II6;U J 时，通道的电导为CA -<，翻转电位为)@B)IV ，通道呈弱内向整流性。
在负钳制电位时，通道开放时常被短时程的关闭所打断，而在正钳制电位时，这种短时程的关闭状态明显少于负钳制电位时。
大鼠海马神经干细胞的分离培养与免疫荧光鉴定
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果
从 新生大 鼠海马齿状 回分离的细胞群可不断增殖形成细胞克隆球 ， 并且呈 ｎｓ ｎ阳性 表达 ， ｅｔ ｉ 具有多 向分化能力 。 结论
分 离培 养 的细 胞 是 中 于细胞 ； 分离培养 ； 免疫荧光鉴定
中图 分 类 号 ： ３ ３ Ｑ ４ 文 献 标 志 码 ： Ａ 文章 编 号 ：６ ４ ４ ０ ２ １ 一２ ０ ０ — ４ １７ — ９Ｘ（０ ０）０ — ０ １ ０
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胎鼠海马神经元体外原代培养与鉴定文档资料
胎鼠海马神经元体外原代培养与鉴定在神经生物学及相关学科领域中，原代培养的神经元因其排除机体生理病理状态干扰的影响而成为较为理想的实验模型，是研究神经元形态、物质代谢、分子机制及电活动的主要前提。
海马是大脑边缘系统重要的组成部分，在学习、记忆、情绪反应及中枢神经系统疾病的病理生理变化方面发挥着重要作用。
对于原代海马神经元的培养，主要供体主要有胎鼠与新生鼠两种，培养方法有含血清培养和不含血清培养两种。
我们通过实验摸索，取得一种较稳定且简便实用的方法，能获得较高存活率的海马神经元。
1 材料与方法1.1 实验动物来源清洁级孕17-19天SD大鼠上海斯莱克实验动物有限责任公司提供，生产许可证号：SCXK（沪）2012-0002。
1.2 主要仪器与试剂 CO2培养箱（Thermo公司），倒置相差显微镜为（Olympus公司），激光共聚焦显微镜型号为ZEISS LSM710，小鼠抗大鼠classⅢβ-Tubulin单抗（Beyotime公司），NSE免疫组化染色试剂盒、DAB显色试剂盒（武汉博士德生物工程XX公司），B27添加剂、Neuralbasal、Hoechst 33342Sigma 公司），DMEM（高糖型）培养基、胎牛血清（Gibco公司）。
1.3 培养方法与鉴定取孕17-19天大鼠，水合氯醛麻醉后70%酒精浸泡20min，颈椎脱臼法处死孕鼠，将子宫立即放入冰浴含DMEM的大平皿中，在解剖显微镜下取下海马组织，剪成约1mm×1mm×1mm大小，用0.125%胰蛋白酶于37℃、5%CO2培养箱中消化15min，中间每隔5min振荡一次，加入含10%FBS的DMEM 液终止消化，巴氏管轻柔吹打，200目筛网过滤。
1000r/min离心5min，弃上清，并加入适量的含2%B27无血清Neuralbasal培养基，用巴氏管吹打成细胞混悬液。
吹打后以0.4%台盼蓝染色计数活细胞并调整细胞悬液的细胞密度，以5×105个/ml的细胞密度接种于预先经0.05%多聚赖氨酸包被的6孔板（1.5ml/孔），置于37℃、5%CO2培养箱培养，24h后换培养基继续培养，以后每周更换维持培养基2次，每次半量换液。
海马细胞培养流程
海马细胞培养流程1．Coat板子：12孔板每孔加poly-sine缓冲液至少覆盖皿底，37℃coat至少4小时（可以过夜coat），吸去poly-sine缓冲液，PBS洗2-3遍（可以用PBS泡一段时间）。
使用前，在超净台里将PBS吸干，开盖晾干。
2．老鼠处死：19天SD孕鼠安乐处死。
3．胚胎分离：解剖老鼠腹部，取出胚胎，放到含有HBSS buffer的10cm培养皿中（冰块预冷）。
4．取头：用镊子弄断老鼠的头，将头放到含有HBSS buffer的6cm培养皿中（冰块预冷）。
5．取大脑：镊子捏住眼睛，剪刀剪开柔软的脑壳，另外一把镊子（有弯角）取出大脑，放入新的含有HBSS buffer的6cm培养皿中（冰块预冷）。
6．分离海马组织，将大脑半球翻过来，去除血网，用细镊子分离海马（带状深色，靠近大脑下半球边缘），剖离海马放入新的含有HBSS buffer的6cm培养皿中（冰块预冷）。
7．洗海马：用枪头吸取海马，放入灭菌的1.5ml EP管内（超净台内操作）吸去多余的HBSS，加入1ml PBS，待所有海马组织沉入管底后吸走PBS，再加入新的PBS，重复10次（注意不要吸走海马）。
8．消化：加0.5ml 0.25%trypsin，37℃消化30-50min。
9．吹散成单细胞：加2ml DMEM全培养基（500ml DMEM,5ml双抗，50ml FBS，5ml丙酮酸钠），吹吸悬浮细胞（不超过4次）。
10.细胞计数：从1ml中取20ul，加入20ul DMEM中，血球计数板上计数，计数后，稀释细胞，使得1ml DMEM全培养基中含有2x104个细胞，轻轻混匀。
11.Seed 12 孔板：每个孔加入1ml DMED全培养基细胞悬液（过夜培养，37℃，5%CO2）。
12.换选择培养基：培养12h后吸去DMEM，加入Neurobasal选择培养基。
Neurobasal配方：Neurobasal 50mlB-27 10mlGlutamaX 5ml双抗3ml。
胎鼠、新生大鼠原代海马神经元培养及鉴定
胎鼠、新生大鼠原代海马神经元培养及鉴定熊丽娇;郭阗廷;曾治平;黄志华;曾靖【摘要】目的:建立胎鼠、新生鼠海马神经元体外培养方法.方法:分别取胎鼠、新生鼠海马,消化后种植,用含有2%B27的neurobasal培养液培养,第3天加入5 μmol·L-1的阿糖胞苷,换液后继续培养,以获得纯度较高的海马神经元.培养第3、7天观察细胞生长及突起情况,用neurofilament抗体以免疫荧光方法鉴定神经元细胞.结果:海马神经元种植24 h后贴壁,7天时神经元突起相互连接成网络.经neurofilament染色,培养细胞阳性率高,新生鼠原代培养海马神经元阳性率达(89±3.4)%,胎鼠海马神经元阳性率达(98±1.5)%.结论: 本方法培养出的胎鼠、新生大鼠海马神经元纯度较高,可作为海马神经元模型用于进一步研究.【期刊名称】《赣南医学院学报》【年(卷),期】2017(037)003【总页数】3页(P354-356)【关键词】海马神经元;细胞培养;胎鼠;新生鼠【作者】熊丽娇;郭阗廷;曾治平;黄志华;曾靖【作者单位】赣南医学院第一附属医院全科医学VIP科;赣南卫生健康职业教育学院外科教研室,江西赣州 341000;赣南医学院第一附属医院全科医学VIP科;赣南医学院;赣南医学院【正文语种】中文【中图分类】R285.5海马是大脑边缘系统重要部分，神经元分布高度集中，在认知、记忆、情绪、植物神经系统方面起着不可替代的作用[1-3]。
海马神经元体外培养模型已经成为研究神经元发育分化、神经疾病的发生机制的重要技术手段[4-6]。
海马神经元体外培养文献报道方法多样，动物来源主要有胎鼠和新生鼠，根据实验条件，我们摸索出了原代胎鼠、新生大鼠的海马神经元培养方法，并进行了细胞鉴定，获得了高纯度的胎鼠、新生大鼠海马神经元。
1.1 材料1.1.1 实验动物孕17天SD大鼠及出生24 h内的SD大鼠。
1.1.2 主要试剂 DMEM培养基、neurobasal培养基、胎牛血清(FBS)和B27培养基添加剂(Gibco公司)、青链霉素、胰酶、多聚L赖氨酸(sigma公司)。