大鼠海马神经元原代培养
新生鼠海马、皮层神经元原代培养
新生鼠海马、皮层神经元原代培养实验材料1. 实验动物新生Wistar大鼠，当天出生（<12 h）的乳鼠，SPF级。
2. 试剂Hibernate ANeurobasal AB27 serum-free supplementsPapin （木瓜蛋白酶）DNAase IOptiPrep Density Gradient MediumPoly-L-lysine （多聚赖氨酸）L-glutamine （L-谷氨酰胺）Penicillin （青霉素）Streptomycin （链霉素）D-Hank’s solutiondd H2O3. 溶液配制1. 多聚赖氨酸：取多聚赖氨酸25 mg，用双蒸水溶解并稀释浓度为50μg/ml，用0.2 μm的微孔滤膜过滤，4 °C保存备用。
（可配成25×）2. 解剖液：HA：含0.5mM L-谷氨酰胺的Hibernate A，0.22μm微孔滤膜过滤，4°C保存备用。
3．Papin：用HA配制含Papin 2mg/mL的消化液，37°C孵育20~30min，0.22μm 微孔滤膜过滤，冰上保存至实验。
在使用前3h内配制。
4．DNAase I：取DNAase I粉末用D-Hank’s液配制成50μg/mL，0.22μm微孔滤膜过滤。
可一次配好，-20°C保存，每次取用。
4．终止消化液：HABG：含2% B27的HA。
现用现配，37°C保存备用。
5．Optiprep离心介质：Optiprep medium∶HABG为124∶876，每离心管1~1.5mL。
5．种植液和培养液：Neurobasal-A/B27：含2% B27，0.5mM L-谷氨酰胺的Neurobasal-A。
现用现配，37°C保存备用。
4．实验方法1. 包被培养皿使用前2 d，在无菌条件下取6孔培养板，加多聚赖氨酸1 mL/孔，放置2 h，吸去多余多聚赖氨酸，自然干燥，灭菌水洗板2次，干燥备用。
新生大鼠海马神经元原代培养方法的优化与鉴定
新生大鼠海马神经元原代培养方法的优化与鉴定郭明星;陈浩宇;梁璐;张常娥【摘要】目的建立一种简单、高效、稳定的海马神经元原代培养方法,以获得高纯度、高活力的海马神经元.方法 24h内新生鼠,用含B27的Neurobasal无血清培养基培养,显微镜下观察神经元的生长状态,MTS法测定不同时间神经元细胞的活力,并用Tau-1和MAP-2抗体鉴定海马神经元的纯度.结果(①接种24h后,细胞完全贴壁,可见双突起和多个突起的神经元;72h后,海马神经元胞体饱满,立体感较强,突起之间相互形成突触联系,神经元极性完全建立;5～6d的神经元,突起形成密集的神经纤维网络.②MTS法测定结果显示,在培养1～8d时间内,海马神经元随着培养时间的延长,活力增加,第8d细胞活性到达高峰,继续培养时,活力开始下降.③Tau-1和MAP-2免疫荧光检测神经元,海马神经元纯度达到(85.5±5.4)％.结论本实验方法简单易行,神经元纯度高、细胞活性好,且体外存活时间长,是神经疾病体外研究的良好细胞模型.【期刊名称】《湖北科技学院学报（医学版）》【年(卷),期】2016(030)004【总页数】6页(P284-287,290,封3)【关键词】海马神经元;无血清原代培养;方法;优化与鉴定【作者】郭明星;陈浩宇;梁璐;张常娥【作者单位】广州医科大学病理生理学教研室,广东广州511436;广州医科大学病理生理学教研室,广东广州511436;广州医科大学病理生理学教研室,广东广州511436;广州医科大学病理生理学教研室,广东广州511436【正文语种】中文【中图分类】R329在神经系统研究领域内，体外培养神经元细胞是研究神经元功能以及病理、生理变化的重要手段之一，在现代医学和神经科学中被广泛应用。
原代神经元[1]直接来源于动物脑组织，在形态和生理功能上都能较好的模拟动物的体内细胞，得出的数据结果更加真实可信，与神经细胞系相比，它们能提供准确的生物学信息，并且它具有机体干扰少，影响因素单一，结果容易分析等优点。
原代培养海马神经元经验-(重医舟之行)
原代培养海马神经元经验一、常规的试剂配制：1、培养基：选用高糖型DMEM/F12 (1:1)培养基干粉（含15 mmol Hepes），每升培养液中加入碳酸氢钠1.8 g，调节pH值7.0，0.22 μm的微孔滤膜过滤除菌后，加入谷氨酰胺、无菌的青霉素和链霉素液，使其终浓度分别为0.5 mmol/L 、100 U/ml和100 μg /ml，分装后置于4℃保存，临用前加入2%的B27。
神经细胞代谢旺盛，选用高糖型培养基；谷胱甘肽可保持培养基还原状态，营养成分稳定；B27是公认的刺激神经元生长的营养因子，不过价格挺贵；PH值很关键，Hepes 是优秀的缓冲系统，pH值调好后能保持很长时间；2、多聚赖氨酸溶液的配制：称取1.5 mg L-多聚赖氨酸溶于100 ml PBS，0.22 μm的微孔滤膜过滤除菌，密封后置于4 ℃保存，可长期使用；3、磷酸盐缓冲液（PBS）的配制：称取8.0 g NaCl、0.2 g KCl、2.85 g Na2HPO4•12H2O和0.2 g KH2PO4充分溶于900 ml dd H2O，调节pH值为7.2，补dd H2O 至1000 ml并分装，高压灭菌（121～126 ℃），4 ℃备用；4、D-Hanks液的配制：称取KCl 0.4 g，KH2PO4 0.06 g，NaCl 8.0 g，NaHCO3 0.35 g，Na2HPO4•12H2O 0.08 g，溶于dd H2O中，调节PH值为7.2，定容至1000 ml，高压蒸汽灭菌（121～126 ℃），4℃备用；5、0.25%胰蛋白酶的配制：称取0.25 g胰蛋白酶粉末，少许D-Hanks溶液调成糊状，用D-Hanks定容至100 ml，混匀，冰箱内放置过夜，滤纸过滤后，0.22 m 微孔滤膜过滤，分装，-20 ℃保存。
二、试验操作过程：1、包被：培养前晚上将培养瓶（板）用多聚赖氨酸包被30 min，吸除，晾干,PBS洗三次,晾干，置于培养箱中备用；2、取脑：选取新生24 h的SD大鼠3只，雌雄不限，75%酒精全身消毒，断头处死，无菌条件下分层剪开头皮、颅骨，用弯镊拉开脑区视野，小心取出全脑，D-hanks液洗数次；（预先准备至少4把眼科剪刀，分别用于断头、剪头皮和剪颅骨及第3步的剪组织这4个操作）3、分离：以脑中线为起点，小心拨开大脑颞叶皮层，暴露出新月状海马回，小心夹出海马组织，置于冰浴的D-hanks液中，仔细剔除微血管，用充分剪碎组织；4、消化：加入同体积0.125%的胰蛋白酶，瓶口用锡箔纸盖上，37 ℃培养箱内消化24 min左右，期间轻摇数次；过滤：加入3mL胎牛血清(海马种植液)终止消化，静止1~2min,吸出上清液，用种植液洗三次，每次用尖头吸管轻轻吹打细胞数分钟，至液体成米糊状即停止吹打，动作要轻柔，用150目网筛过滤，收集细胞悬液；5、接种：以1000 rpm离心5 min，倾去上清，海马种植液重悬细胞，轻轻吹打，台盼蓝染色快速计数，根据计数结果，调整细胞终浓度为1 00000个/ml，加入含终浓度为10%胎牛血清的种植液后接种于培养瓶（板）中，置于37 ℃、含5% CO2培养箱中培养；6、换液：接种后4~6h将培养液全量换成无血清B27+neurobasal培养液，(第48 h时加入终浓度为10 μmol/L的阿糖胞苷，以抑制非神经元细胞的过度生长，)随后每3 d半量换液。
胎鼠、新生大鼠原代海马神经元培养及鉴定
胎鼠、新生大鼠原代海马神经元培养及鉴定熊丽娇;郭阗廷;曾治平;黄志华;曾靖【摘要】目的:建立胎鼠、新生鼠海马神经元体外培养方法.方法:分别取胎鼠、新生鼠海马,消化后种植,用含有2%B27的neurobasal培养液培养,第3天加入5 μmol·L-1的阿糖胞苷,换液后继续培养,以获得纯度较高的海马神经元.培养第3、7天观察细胞生长及突起情况,用neurofilament抗体以免疫荧光方法鉴定神经元细胞.结果:海马神经元种植24 h后贴壁,7天时神经元突起相互连接成网络.经neurofilament染色,培养细胞阳性率高,新生鼠原代培养海马神经元阳性率达(89±3.4)%,胎鼠海马神经元阳性率达(98±1.5)%.结论: 本方法培养出的胎鼠、新生大鼠海马神经元纯度较高,可作为海马神经元模型用于进一步研究.【期刊名称】《赣南医学院学报》【年(卷),期】2017(037)003【总页数】3页(P354-356)【关键词】海马神经元;细胞培养;胎鼠;新生鼠【作者】熊丽娇;郭阗廷;曾治平;黄志华;曾靖【作者单位】赣南医学院第一附属医院全科医学VIP科;赣南卫生健康职业教育学院外科教研室,江西赣州 341000;赣南医学院第一附属医院全科医学VIP科;赣南医学院;赣南医学院【正文语种】中文【中图分类】R285.5海马是大脑边缘系统重要部分，神经元分布高度集中，在认知、记忆、情绪、植物神经系统方面起着不可替代的作用[1-3]。
海马神经元体外培养模型已经成为研究神经元发育分化、神经疾病的发生机制的重要技术手段[4-6]。
海马神经元体外培养文献报道方法多样，动物来源主要有胎鼠和新生鼠，根据实验条件，我们摸索出了原代胎鼠、新生大鼠的海马神经元培养方法，并进行了细胞鉴定，获得了高纯度的胎鼠、新生大鼠海马神经元。
1.1 材料1.1.1 实验动物孕17天SD大鼠及出生24 h内的SD大鼠。
1.1.2 主要试剂 DMEM培养基、neurobasal培养基、胎牛血清(FBS)和B27培养基添加剂(Gibco公司)、青链霉素、胰酶、多聚L赖氨酸(sigma公司)。
大鼠海马神经细胞体外原代培养与鉴定_孙琪
1.1 动物 采用新生 24 h 内的 Wistar 乳鼠，SPF 级， 由南方医科大学实验动物中心提供。 1.2 主要试剂及其配制 DMEM/F12 培 养 基 、 Neu－ robasal 培养基、B27 均为 Gibco 公司产品；胎牛血清 为杭州四季青生物工程公司产品；0.25 %胰蛋白酶、 双抗、D-hank’s 液为 Genom 产品；多聚赖氨酸、L谷 氨 酰 胺 、 CY3 标 记 的 羊 抗 小 鼠 IgG、 DAPI 均 为 Sigma 公司生产；10 %山羊封闭血清、抗体稀释液、 小鼠抗 Map-2 均为武汉博士德生物工程有限公司生 产；其他试剂均为国产分析纯。
L-谷氨酰胺：Sigma 公司生产。精密称取 L-谷 氨酰胺 2.922 g，用 PBS 溶解，定容至 100 mL（200 mmol/L），充分搅匀后 0.22 μm 滤器除菌，按 1 mL 分装于无菌 EP 管中，封口后－20℃保存备用。使用
时每 100 mL 培养液加 1 mL 储备液，即终浓度为 2 mmol/L。
PBS：NaCl 8 g、KCl 0.2 g、Na2HPO4·12H2O 2.89 g、KH2PO4 0.2 g，混合溶解后定容至 1000 mL，高温 高压灭菌后，4 ℃保存备用。
多聚赖氨酸（Poly-L-Lysine，PLL）：用 PBS 将多 聚赖氨酸配制成 1 mg/mL 的储备液，0.22 μm 滤器过 滤除菌，按 1 mL 分装，－20 ℃保存备用。使用时用 PBS 稀释 10 倍，即 0.1 mg/mL 浓度。
[4] 张群豪. 血清药理学在中药及复方研究中应用的评价[J]. 中国中西 结合杂志，1996，16（3）：131.
[5] 王宁生，杨奎，雷燕. 关于血清药理学的若干思考[J]. 中国中西医 结合杂志，1999，19（5）：263.
大鼠海马神经元无血清原代培养技术的建立
１ １３ 主要仪器设备 细胞培 养皿 （ ｏ ｉｇ Ｕ Ａ ；Ｗ—Ｃ 一 ．． Ｃ ｍｎ ， Ｓ ） Ｓ Ｊ ２ Ｄ型超净 工作 台（ 州安泰空气技术有 限公 司） ｃ ２ Ｆ 苏 ： ０ 细胞 培 养箱 （ｈ１ ａ ， Ｓ ）倒 置相差显 微镜 （ Ｌ ＭＰ Ｓ Ｊｐｎ ： ｓｅ Ｌｂ Ｕ Ａ ； Ｏ Ｙ Ｕ ，ａａ ）高速 冷冻离心机 （Ｌ ６ 一Ⅱ型， 安亭科 学仪器厂 ）２０目 Ｇ 一１Ｇ 上海 ： ０ 不 锈钢筛网 ：Ｈ计（ 十梅特 勒 一托 利多 公司 ） Ａ ｉｒｎ 究 型 ｐ 瑞 ：ｘ ｔ 研 ｏｏ 显 微镜（ ＥＳ ， 国）弯头和直头眼科无齿镊 、 Ｚ￣ 德 Ｓ ； 弯头虹膜镊 、 直
胞数 的 比例为神 经元 纯度 。
２ 结 果
２ １ 原代 培养 大鼠海 马神经元 形 态观察 ．
在倒置相差显 微镜
下， 刚种植 的神 经元 呈 圆 形 ， 积 小 ， 亮 ， 体 透 单个 均 匀 分布 ； 培 养 ２ 后开 始贴壁 ； ｈ 培养 ６ ｈ后绝 大 部分 细胞 已贴 壁 ， 镜下 光 晕 明显 ；２ ４ 后 细胞全部贴 壁 ， 长 出短 小的突起 ： ２ １ ～２ ｈ 且 第 ｄ更换 无血清 培养基 ， 细胞胞 体呈梭形 或锥 形 ， 带有 突起 的细 胞数 明 显增 多 ， 背景 中可见少数 扁平状 多边 形 的神经 胶质 细胞铺 垫 ； ３ 后 神经元形状 已很典 型 ： 体饱满 ， ｄ 胞 多呈 梭形 、 形 ， 锥 少数 呈 多边形 ， 胞浆 丰富 ， 大 ， 仁 隐约 可 见 ， 起 明显 增 长 ， 景 核 核 突 背 中仍然 可见极 少数扁平 状多边 形的神经 胶质 细胞铺 垫 。４ ｄ后 神经元胞 体逐 渐增大 ， 突起延 伸并 逐渐 成 网 ， 背景 中几乎 不 见 扁平状 多边形 的神经 胶质 细胞 ；ｄ后 神 经元 突起 密 集联 结成 ５ 网 ， 经元胞体继续 增 大 ；ｄ后 细 胞 开始 互相 迁 移靠 近 ， 神 ６ 突起
大鼠脑海马神经元原代培养方法的建立及其纯度的鉴定
ｋｎ ｓｏ ｎ ｙ ｓ ｔ ｎ ｅ ｔ ａ ｈ ｕ ｎ ｉ ｎ ｕ ｉ ｆｔ ｅ ｃ ｌ ｒ ｄ ｎ ｕ ｏ ｓ Ｒｅ ｕ ｔ ： Ｔ ｅ ｎ ｕ ｏ ｓ ｃ ｌ ｒ ｄ ｂ ｈ ｗ ｉ ｄ ｎ ｉ ｄ ｆｅ ｚ ｍｅ ｏ ｉｖ ｓｉ ｔｔｅ ｑ ａ ｔｔ ａ ｄ ｐ ｒ ｙ ｏ ｕ ｔ ｅ ｅ ｒｎ ． ｇ ｙ ｔ ｈ ｕ ｓ ｌｓ ｈ ｅ ｒ ｎ ｕｔ ｅ ｙ ｔ ｅ ｔ ｏ ｋ ｎ ｓ ｅ — ｕ
ｇ ｓｅ ｔ ａ ａ ｎ ｅ ｚ ｍｅ ａ ｄ ｃ ｌｕ ｅ ｔ ｅ ｒ ｂ ｓ ｌａ ｅ ｓａ ｉｉａ ｉｎ ａ ｄ ｓ ｆ ｔ Ｏ ｉ ｒａ ｅ ｔｅ ｑｕ ｎ ｉ ｎｄ ｐｕ ｉｙ ｏ ｅ ｏ ． ｅ ｔ ｄ ｗｉ ｐ ｐ ｉ ｎ ｙ ｎ ｕｔ ｒ ｄ ｗｉｈ ｎ ｕ ｏ ａ ａ ｒ ｔ ｂｌｚ ｔｏ ｎ ａｅｙ Ｓ ｎｃ ｅ ｓ ｈ ａ ｔｔ ａ ｒｔ ｆｎ ｕｒｎｓ ｈ ｙ
ｔ ｅＮ Ｙ ｅ ，Ｓ ｉ—ｉ ｇ ，Ｚ Ｎ ｏｇ ，ＺＨＡＮＧ ｎ —ｈｅ Ｅ ｕ Ｕ Ｑｕｘａ ＨＡ Ｇ Ｙ ｎ ｎ
（ ． Ａ ａｅ ｃＡｆ ｒ Ｄ ｓ ｎ ｈｎ ａｇＭｅ ｉ ｌ ｏｌ ｅ Ｓ ｅ ｙ ｎ １ ０ ４ ｈｎ ；２ ｅ ａｔ ｅ ｔ ｆＨ ｓ ｌ ｙａ ｄＥ ｒ ｌ ｙ １ ｃｄｍｉ ｆｉ Ｍ ｉ ，Ｓ ｅｙｎ ｄｃ ｌｇ ， ｈ ｎ ａ ｇ１ ０ ３ ，Ｃ ｉａ ．Ｄ ｐ ｒ ｎ ｉ ｏｏ ｎ ｍｂｙ ｏ ） ａｓ ｏ ａＣ ｅ ｍ ｏ ｔ ｇ ｏｇ
（ ．沈 阳医 学 院 教 务 处 ，辽 宁 沈 阳 １０ ３ １ １０ ４；２ 基 础 医学 院组 织 与 胚 胎 学 教 研 室 ） ．
［ 摘要 ］目的 ：为建立一种稳定的大鼠胎鼠海马神经元培养方法并能够有 效的鉴定其 纯度 。方法 ：分 离 Ｗｉａ大鼠胚胎 并 ｓ ｔ 取海马组织 ，比较 两种 常用酶 ，胰 酶和木瓜 酶消化效果对海马神经元产量的影响及 两种不 同培养方法对海马神 经元纯度 的
原代神经元培养
神经细胞原代培养从动物（大鼠或小鼠等）的胚胎或新生动物的脑组织取下某一局部区域，分离细胞，培养在培养容器后不再移植，常称为原代神经细胞培养。
一、培养前准备1. 器械和器皿器械：外科剪、镊子、虹膜剪等、小剪刀、细镊子和虹膜小刀等各种金属器械如解剖器械，使用后及时刷洗干净，用酒精棉球擦拭后晾干，或经60℃烘干，以防生锈。
由于湿热消毒对手术器械容易可用70－80％酒精浸泡1小时以上消毒。
器皿：1)玻璃瓶及相应的胶塞或胶木螺旋盖，2)用于分装血清、多聚赖氨酸、解剖液、各种盐溶液和培养液等。
3)培养瓶、盖玻片4)培养用的盖玻片必须不含铅、不发霉，可用0.2N盐酸浸泡10分钟，用蒸馏水洗2次，每次10分钟，然后移入丙酮或乙醇浸泡10分钟，再用双蒸水洗2次，每次10分钟，烘干待消毒。
凡组织学用过的旧盖玻片一般不用。
5)移液管、吸管、烧杯、离心管和培养皿。
6)塑料培养皿（35mm）、塑料培养板（6、24、96孔）。
辅助工具：放置试管、吸管和玻璃瓶等的架子。
2. 培养基和培养用液的配制1) 培养基质：有多聚赖氨酸、牛皮胶原和鼠尾胶原。
本室目前常用分子量为7-140000多聚赖氨酸（Poly-L-lysine，浓度为0.1mg/ml。
2) 平衡盐溶液：主要以无机盐和葡萄糖配制而成。
各种平衡盐溶液主要的不同点在于NaCl的浓度、离子浓度及缓冲系统的不同，可根据实际需要选用适当的平衡盐溶液。
3) 培养液：目前已有现成的干粉出售，按说明书进行配制即可。
神经细胞培养需高糖，培养液应含有或加葡萄糖至6g/L。
目前培养海马神经元可选用B27无血清培养液。
4) 血清：有胎牛血清、小牛血清和马血清等。
分装成小瓶，4℃保存备用（分装前需56℃灭活30分钟）。
5) 胰蛋白酶溶液：用于分离细胞。
先用少量灭菌三蒸水将胰蛋白酶粉末溶成糊状，然后补水至2.5%浓度，振荡摇匀，4℃过夜，待完全溶解后用滤器过滤灭菌，并分装成1-2ml冻存。
用前以D-Hanks平衡盐水或其他无钙镁离子溶液溶解稀释至0.25%或0.125%。
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汇报人：何克宇
S
实验要点
S 取活体细胞
S 令海马神经元贴壁生长
S 神经元培养液
实验材料
S 动物：大鼠胎鼠（15~20天）
S 试剂：多聚赖氨酸
解剖液（DMEM+PBS） 0.125%胰蛋白酶
S 培养液：①DMEM+F12+10%胎牛血清
②Neurobasal+2%b27+1%双抗
1. 胰蛋白酶（预暖）消化15min，3~5min震荡一次。
2. 静置2min，去上清，PBS洗两遍终止消化 3. 加入DMEM，吹打，取上清。重复3次。 4. 种板，培养液（DMEM+F12+10%胎牛血清），细
胞密度3.5*105/cm2
抗）
Thank You
实验步骤
1.器械灭菌 2.多聚赖氨酸（PLL）铺板
0.1mg/ml，包被30min，吸去多余PLL，
过夜晾干
实验步骤
1.孕鼠颈椎脱臼处死，取胎鼠 2.胎鼠断头，置于PBS，取全脑，置于解剖液（冷） 3.体视显微镜下沿中线分离半球，取海马，仔细分离血 管和膜性组织。（快、干净）
实验步骤
实验步骤