大鼠海马神经元原代培养
汇报人：何克宇
S
实验要点
S 取活体细胞
S 令海马神经元贴壁生长
S 神经元培养液
实验材料
S 动物：大鼠胎鼠（15~20天）
S 试剂：多聚赖氨酸
解剖液（DMEM+PBS） 0.125%胰蛋白酶
S 培养液：①DMEM+F12+10%胎牛血清
②Neurobasal+2%b27+1%双抗
1. 胰蛋白酶（预暖）消化15min，3~5min震荡一次。
2. 静置2min，去上清，PBS洗两遍终止消化 3. 加入DMEM，吹打，取上清。重复3次。 4. 种板，培养液（DMEM+F12+10%胎牛血清），细
胞密度3.5*105/cm2
抗）
Thank You
实验步骤
1.器械灭菌 2.多聚赖氨酸（PLL）铺板
0.1mg/ml，包被30min，吸去多余PLL，
过夜晾干
实验步骤
1.孕鼠颈椎脱臼处死，取胎鼠 2.胎鼠断头，置于PBS，取全脑，置于解剖液（冷） 3.体视显微镜下沿中线分离半球，取海马，仔细分离血 管和膜性组织。（快、干净）
实验步骤
实验步骤
新生鼠海马、皮层神经元原代培养
新生鼠海马、皮层神经元原代培养实验材料1. 实验动物新生Wistar大鼠，当天出生（<12 h）的乳鼠，SPF级。
2. 试剂Hibernate ANeurobasal AB27 serum-free supplementsPapin （木瓜蛋白酶）DNAase IOptiPrep Density Gradient MediumPoly-L-lysine （多聚赖氨酸）L-glutamine （L-谷氨酰胺）Penicillin （青霉素）Streptomycin （链霉素）D-Hank’s solutiondd H2O3. 溶液配制1. 多聚赖氨酸：取多聚赖氨酸25 mg，用双蒸水溶解并稀释浓度为50μg/ml，用0.2 μm的微孔滤膜过滤，4 °C保存备用。
（可配成25×）2. 解剖液：HA：含0.5mM L-谷氨酰胺的Hibernate A，0.22μm微孔滤膜过滤，4°C保存备用。
3．Papin：用HA配制含Papin 2mg/mL的消化液，37°C孵育20~30min，0.22μm 微孔滤膜过滤，冰上保存至实验。
在使用前3h内配制。
4．DNAase I：取DNAase I粉末用D-Hank’s液配制成50μg/mL，0.22μm微孔滤膜过滤。
可一次配好，-20°C保存，每次取用。
4．终止消化液：HABG：含2% B27的HA。
现用现配，37°C保存备用。
5．Optiprep离心介质：Optiprep medium∶HABG为124∶876，每离心管1~1.5mL。
5．种植液和培养液：Neurobasal-A/B27：含2% B27，0.5mM L-谷氨酰胺的Neurobasal-A。
现用现配，37°C保存备用。
4．实验方法1. 包被培养皿使用前2 d，在无菌条件下取6孔培养板，加多聚赖氨酸1 mL/孔，放置2 h，吸去多余多聚赖氨酸，自然干燥，灭菌水洗板2次，干燥备用。
新生大鼠海马神经元原代培养方法的优化与鉴定
新生大鼠海马神经元原代培养方法的优化与鉴定郭明星;陈浩宇;梁璐;张常娥【摘要】目的建立一种简单、高效、稳定的海马神经元原代培养方法,以获得高纯度、高活力的海马神经元.方法 24h内新生鼠,用含B27的Neurobasal无血清培养基培养,显微镜下观察神经元的生长状态,MTS法测定不同时间神经元细胞的活力,并用Tau-1和MAP-2抗体鉴定海马神经元的纯度.结果(①接种24h后,细胞完全贴壁,可见双突起和多个突起的神经元;72h后,海马神经元胞体饱满,立体感较强,突起之间相互形成突触联系,神经元极性完全建立;5～6d的神经元,突起形成密集的神经纤维网络.②MTS法测定结果显示,在培养1～8d时间内,海马神经元随着培养时间的延长,活力增加,第8d细胞活性到达高峰,继续培养时,活力开始下降.③Tau-1和MAP-2免疫荧光检测神经元,海马神经元纯度达到(85.5±5.4)％.结论本实验方法简单易行,神经元纯度高、细胞活性好,且体外存活时间长,是神经疾病体外研究的良好细胞模型.【期刊名称】《湖北科技学院学报（医学版）》【年(卷),期】2016(030)004【总页数】6页(P284-287,290,封3)【关键词】海马神经元;无血清原代培养;方法;优化与鉴定【作者】郭明星;陈浩宇;梁璐;张常娥【作者单位】广州医科大学病理生理学教研室,广东广州511436;广州医科大学病理生理学教研室,广东广州511436;广州医科大学病理生理学教研室,广东广州511436;广州医科大学病理生理学教研室,广东广州511436【正文语种】中文【中图分类】R329在神经系统研究领域内，体外培养神经元细胞是研究神经元功能以及病理、生理变化的重要手段之一，在现代医学和神经科学中被广泛应用。
原代神经元[1]直接来源于动物脑组织，在形态和生理功能上都能较好的模拟动物的体内细胞，得出的数据结果更加真实可信，与神经细胞系相比，它们能提供准确的生物学信息，并且它具有机体干扰少，影响因素单一，结果容易分析等优点。
原代培养海马神经元经验-(重医舟之行)
原代培养海马神经元经验一、常规的试剂配制：1、培养基：选用高糖型DMEM/F12 (1:1)培养基干粉（含15 mmol Hepes），每升培养液中加入碳酸氢钠1.8 g，调节pH值7.0，0.22 μm的微孔滤膜过滤除菌后，加入谷氨酰胺、无菌的青霉素和链霉素液，使其终浓度分别为0.5 mmol/L 、100 U/ml和100 μg /ml，分装后置于4℃保存，临用前加入2%的B27。
神经细胞代谢旺盛，选用高糖型培养基；谷胱甘肽可保持培养基还原状态，营养成分稳定；B27是公认的刺激神经元生长的营养因子，不过价格挺贵；PH值很关键，Hepes 是优秀的缓冲系统，pH值调好后能保持很长时间；2、多聚赖氨酸溶液的配制：称取1.5 mg L-多聚赖氨酸溶于100 ml PBS，0.22 μm的微孔滤膜过滤除菌，密封后置于4 ℃保存，可长期使用；3、磷酸盐缓冲液（PBS）的配制：称取8.0 g NaCl、0.2 g KCl、2.85 g Na2HPO4•12H2O和0.2 g KH2PO4充分溶于900 ml dd H2O，调节pH值为7.2，补dd H2O 至1000 ml并分装，高压灭菌（121～126 ℃），4 ℃备用；4、D-Hanks液的配制：称取KCl 0.4 g，KH2PO4 0.06 g，NaCl 8.0 g，NaHCO3 0.35 g，Na2HPO4•12H2O 0.08 g，溶于dd H2O中，调节PH值为7.2，定容至1000 ml，高压蒸汽灭菌（121～126 ℃），4℃备用；5、0.25%胰蛋白酶的配制：称取0.25 g胰蛋白酶粉末，少许D-Hanks溶液调成糊状，用D-Hanks定容至100 ml，混匀，冰箱内放置过夜，滤纸过滤后，0.22 m 微孔滤膜过滤，分装，-20 ℃保存。
二、试验操作过程：1、包被：培养前晚上将培养瓶（板）用多聚赖氨酸包被30 min，吸除，晾干,PBS洗三次,晾干，置于培养箱中备用；2、取脑：选取新生24 h的SD大鼠3只，雌雄不限，75%酒精全身消毒，断头处死，无菌条件下分层剪开头皮、颅骨，用弯镊拉开脑区视野，小心取出全脑，D-hanks液洗数次；（预先准备至少4把眼科剪刀，分别用于断头、剪头皮和剪颅骨及第3步的剪组织这4个操作）3、分离：以脑中线为起点，小心拨开大脑颞叶皮层，暴露出新月状海马回，小心夹出海马组织，置于冰浴的D-hanks液中，仔细剔除微血管，用充分剪碎组织；4、消化：加入同体积0.125%的胰蛋白酶，瓶口用锡箔纸盖上，37 ℃培养箱内消化24 min左右，期间轻摇数次；过滤：加入3mL胎牛血清(海马种植液)终止消化，静止1~2min,吸出上清液，用种植液洗三次，每次用尖头吸管轻轻吹打细胞数分钟，至液体成米糊状即停止吹打，动作要轻柔，用150目网筛过滤，收集细胞悬液；5、接种：以1000 rpm离心5 min，倾去上清，海马种植液重悬细胞，轻轻吹打，台盼蓝染色快速计数，根据计数结果，调整细胞终浓度为1 00000个/ml，加入含终浓度为10%胎牛血清的种植液后接种于培养瓶（板）中，置于37 ℃、含5% CO2培养箱中培养；6、换液：接种后4~6h将培养液全量换成无血清B27+neurobasal培养液，(第48 h时加入终浓度为10 μmol/L的阿糖胞苷，以抑制非神经元细胞的过度生长，)随后每3 d半量换液。
胎鼠、新生大鼠原代海马神经元培养及鉴定
胎鼠、新生大鼠原代海马神经元培养及鉴定熊丽娇;郭阗廷;曾治平;黄志华;曾靖【摘要】目的:建立胎鼠、新生鼠海马神经元体外培养方法.方法:分别取胎鼠、新生鼠海马,消化后种植,用含有2%B27的neurobasal培养液培养,第3天加入5 μmol·L-1的阿糖胞苷,换液后继续培养,以获得纯度较高的海马神经元.培养第3、7天观察细胞生长及突起情况,用neurofilament抗体以免疫荧光方法鉴定神经元细胞.结果:海马神经元种植24 h后贴壁,7天时神经元突起相互连接成网络.经neurofilament染色,培养细胞阳性率高,新生鼠原代培养海马神经元阳性率达(89±3.4)%,胎鼠海马神经元阳性率达(98±1.5)%.结论: 本方法培养出的胎鼠、新生大鼠海马神经元纯度较高,可作为海马神经元模型用于进一步研究.【期刊名称】《赣南医学院学报》【年(卷),期】2017(037)003【总页数】3页(P354-356)【关键词】海马神经元;细胞培养;胎鼠;新生鼠【作者】熊丽娇;郭阗廷;曾治平;黄志华;曾靖【作者单位】赣南医学院第一附属医院全科医学VIP科;赣南卫生健康职业教育学院外科教研室,江西赣州 341000;赣南医学院第一附属医院全科医学VIP科;赣南医学院;赣南医学院【正文语种】中文【中图分类】R285.5海马是大脑边缘系统重要部分，神经元分布高度集中，在认知、记忆、情绪、植物神经系统方面起着不可替代的作用[1-3]。
海马神经元体外培养模型已经成为研究神经元发育分化、神经疾病的发生机制的重要技术手段[4-6]。
海马神经元体外培养文献报道方法多样，动物来源主要有胎鼠和新生鼠，根据实验条件，我们摸索出了原代胎鼠、新生大鼠的海马神经元培养方法，并进行了细胞鉴定，获得了高纯度的胎鼠、新生大鼠海马神经元。
1.1 材料1.1.1 实验动物孕17天SD大鼠及出生24 h内的SD大鼠。
1.1.2 主要试剂 DMEM培养基、neurobasal培养基、胎牛血清(FBS)和B27培养基添加剂(Gibco公司)、青链霉素、胰酶、多聚L赖氨酸(sigma公司)。
大鼠海马神经细胞体外原代培养与鉴定_孙琪
1.1 动物 采用新生 24 h 内的 Wistar 乳鼠，SPF 级， 由南方医科大学实验动物中心提供。 1.2 主要试剂及其配制 DMEM/F12 培 养 基 、 Neu－ robasal 培养基、B27 均为 Gibco 公司产品；胎牛血清 为杭州四季青生物工程公司产品；0.25 %胰蛋白酶、 双抗、D-hank’s 液为 Genom 产品；多聚赖氨酸、L谷 氨 酰 胺 、 CY3 标 记 的 羊 抗 小 鼠 IgG、 DAPI 均 为 Sigma 公司生产；10 %山羊封闭血清、抗体稀释液、 小鼠抗 Map-2 均为武汉博士德生物工程有限公司生 产；其他试剂均为国产分析纯。
L-谷氨酰胺：Sigma 公司生产。精密称取 L-谷 氨酰胺 2.922 g，用 PBS 溶解，定容至 100 mL（200 mmol/L），充分搅匀后 0.22 μm 滤器除菌，按 1 mL 分装于无菌 EP 管中，封口后－20℃保存备用。使用
时每 100 mL 培养液加 1 mL 储备液，即终浓度为 2 mmol/L。
PBS：NaCl 8 g、KCl 0.2 g、Na2HPO4·12H2O 2.89 g、KH2PO4 0.2 g，混合溶解后定容至 1000 mL，高温 高压灭菌后，4 ℃保存备用。
多聚赖氨酸（Poly-L-Lysine，PLL）：用 PBS 将多 聚赖氨酸配制成 1 mg/mL 的储备液，0.22 μm 滤器过 滤除菌，按 1 mL 分装，－20 ℃保存备用。使用时用 PBS 稀释 10 倍，即 0.1 mg/mL 浓度。
[4] 张群豪. 血清药理学在中药及复方研究中应用的评价[J]. 中国中西 结合杂志，1996，16（3）：131.
[5] 王宁生，杨奎，雷燕. 关于血清药理学的若干思考[J]. 中国中西医 结合杂志，1999，19（5）：263.
大鼠海马神经元无血清原代培养技术的建立
１ １３ 主要仪器设备 细胞培 养皿 （ ｏ ｉｇ Ｕ Ａ ；Ｗ—Ｃ 一 ．． Ｃ ｍｎ ， Ｓ ） Ｓ Ｊ ２ Ｄ型超净 工作 台（ 州安泰空气技术有 限公 司） ｃ ２ Ｆ 苏 ： ０ 细胞 培 养箱 （ｈ１ ａ ， Ｓ ）倒 置相差显 微镜 （ Ｌ ＭＰ Ｓ Ｊｐｎ ： ｓｅ Ｌｂ Ｕ Ａ ； Ｏ Ｙ Ｕ ，ａａ ）高速 冷冻离心机 （Ｌ ６ 一Ⅱ型， 安亭科 学仪器厂 ）２０目 Ｇ 一１Ｇ 上海 ： ０ 不 锈钢筛网 ：Ｈ计（ 十梅特 勒 一托 利多 公司 ） Ａ ｉｒｎ 究 型 ｐ 瑞 ：ｘ ｔ 研 ｏｏ 显 微镜（ ＥＳ ， 国）弯头和直头眼科无齿镊 、 Ｚ￣ 德 Ｓ ； 弯头虹膜镊 、 直
胞数 的 比例为神 经元 纯度 。
２ 结 果
２ １ 原代 培养 大鼠海 马神经元 形 态观察 ．
在倒置相差显 微镜
下， 刚种植 的神 经元 呈 圆 形 ， 积 小 ， 亮 ， 体 透 单个 均 匀 分布 ； 培 养 ２ 后开 始贴壁 ； ｈ 培养 ６ ｈ后绝 大 部分 细胞 已贴 壁 ， 镜下 光 晕 明显 ；２ ４ 后 细胞全部贴 壁 ， 长 出短 小的突起 ： ２ １ ～２ ｈ 且 第 ｄ更换 无血清 培养基 ， 细胞胞 体呈梭形 或锥 形 ， 带有 突起 的细 胞数 明 显增 多 ， 背景 中可见少数 扁平状 多边 形 的神经 胶质 细胞铺 垫 ； ３ 后 神经元形状 已很典 型 ： 体饱满 ， ｄ 胞 多呈 梭形 、 形 ， 锥 少数 呈 多边形 ， 胞浆 丰富 ， 大 ， 仁 隐约 可 见 ， 起 明显 增 长 ， 景 核 核 突 背 中仍然 可见极 少数扁平 状多边 形的神经 胶质 细胞铺 垫 。４ ｄ后 神经元胞 体逐 渐增大 ， 突起延 伸并 逐渐 成 网 ， 背景 中几乎 不 见 扁平状 多边形 的神经 胶质 细胞 ；ｄ后 神 经元 突起 密 集联 结成 ５ 网 ， 经元胞体继续 增 大 ；ｄ后 细 胞 开始 互相 迁 移靠 近 ， 神 ６ 突起
大鼠脑海马神经元原代培养方法的建立及其纯度的鉴定
ｋｎ ｓｏ ｎ ｙ ｓ ｔ ｎ ｅ ｔ ａ ｈ ｕ ｎ ｉ ｎ ｕ ｉ ｆｔ ｅ ｃ ｌ ｒ ｄ ｎ ｕ ｏ ｓ Ｒｅ ｕ ｔ ： Ｔ ｅ ｎ ｕ ｏ ｓ ｃ ｌ ｒ ｄ ｂ ｈ ｗ ｉ ｄ ｎ ｉ ｄ ｆｅ ｚ ｍｅ ｏ ｉｖ ｓｉ ｔｔｅ ｑ ａ ｔｔ ａ ｄ ｐ ｒ ｙ ｏ ｕ ｔ ｅ ｅ ｒｎ ． ｇ ｙ ｔ ｈ ｕ ｓ ｌｓ ｈ ｅ ｒ ｎ ｕｔ ｅ ｙ ｔ ｅ ｔ ｏ ｋ ｎ ｓ ｅ — ｕ
ｇ ｓｅ ｔ ａ ａ ｎ ｅ ｚ ｍｅ ａ ｄ ｃ ｌｕ ｅ ｔ ｅ ｒ ｂ ｓ ｌａ ｅ ｓａ ｉｉａ ｉｎ ａ ｄ ｓ ｆ ｔ Ｏ ｉ ｒａ ｅ ｔｅ ｑｕ ｎ ｉ ｎｄ ｐｕ ｉｙ ｏ ｅ ｏ ． ｅ ｔ ｄ ｗｉ ｐ ｐ ｉ ｎ ｙ ｎ ｕｔ ｒ ｄ ｗｉｈ ｎ ｕ ｏ ａ ａ ｒ ｔ ｂｌｚ ｔｏ ｎ ａｅｙ Ｓ ｎｃ ｅ ｓ ｈ ａ ｔｔ ａ ｒｔ ｆｎ ｕｒｎｓ ｈ ｙ
ｔ ｅＮ Ｙ ｅ ，Ｓ ｉ—ｉ ｇ ，Ｚ Ｎ ｏｇ ，ＺＨＡＮＧ ｎ —ｈｅ Ｅ ｕ Ｕ Ｑｕｘａ ＨＡ Ｇ Ｙ ｎ ｎ
（ ． Ａ ａｅ ｃＡｆ ｒ Ｄ ｓ ｎ ｈｎ ａｇＭｅ ｉ ｌ ｏｌ ｅ Ｓ ｅ ｙ ｎ １ ０ ４ ｈｎ ；２ ｅ ａｔ ｅ ｔ ｆＨ ｓ ｌ ｙａ ｄＥ ｒ ｌ ｙ １ ｃｄｍｉ ｆｉ Ｍ ｉ ，Ｓ ｅｙｎ ｄｃ ｌｇ ， ｈ ｎ ａ ｇ１ ０ ３ ，Ｃ ｉａ ．Ｄ ｐ ｒ ｎ ｉ ｏｏ ｎ ｍｂｙ ｏ ） ａｓ ｏ ａＣ ｅ ｍ ｏ ｔ ｇ ｏｇ
（ ．沈 阳医 学 院 教 务 处 ，辽 宁 沈 阳 １０ ３ １ １０ ４；２ 基 础 医学 院组 织 与 胚 胎 学 教 研 室 ） ．
［ 摘要 ］目的 ：为建立一种稳定的大鼠胎鼠海马神经元培养方法并能够有 效的鉴定其 纯度 。方法 ：分 离 Ｗｉａ大鼠胚胎 并 ｓ ｔ 取海马组织 ，比较 两种 常用酶 ，胰 酶和木瓜 酶消化效果对海马神经元产量的影响及 两种不 同培养方法对海马神 经元纯度 的
原代神经元培养
神经细胞原代培养从动物（大鼠或小鼠等）的胚胎或新生动物的脑组织取下某一局部区域，分离细胞，培养在培养容器后不再移植，常称为原代神经细胞培养。
一、培养前准备1. 器械和器皿器械：外科剪、镊子、虹膜剪等、小剪刀、细镊子和虹膜小刀等各种金属器械如解剖器械，使用后及时刷洗干净，用酒精棉球擦拭后晾干，或经60℃烘干，以防生锈。
由于湿热消毒对手术器械容易可用70－80％酒精浸泡1小时以上消毒。
器皿：1)玻璃瓶及相应的胶塞或胶木螺旋盖，2)用于分装血清、多聚赖氨酸、解剖液、各种盐溶液和培养液等。
3)培养瓶、盖玻片4)培养用的盖玻片必须不含铅、不发霉，可用0.2N盐酸浸泡10分钟，用蒸馏水洗2次，每次10分钟，然后移入丙酮或乙醇浸泡10分钟，再用双蒸水洗2次，每次10分钟，烘干待消毒。
凡组织学用过的旧盖玻片一般不用。
5)移液管、吸管、烧杯、离心管和培养皿。
6)塑料培养皿（35mm）、塑料培养板（6、24、96孔）。
辅助工具：放置试管、吸管和玻璃瓶等的架子。
2. 培养基和培养用液的配制1) 培养基质：有多聚赖氨酸、牛皮胶原和鼠尾胶原。
本室目前常用分子量为7-140000多聚赖氨酸（Poly-L-lysine，浓度为0.1mg/ml。
2) 平衡盐溶液：主要以无机盐和葡萄糖配制而成。
各种平衡盐溶液主要的不同点在于NaCl的浓度、离子浓度及缓冲系统的不同，可根据实际需要选用适当的平衡盐溶液。
3) 培养液：目前已有现成的干粉出售，按说明书进行配制即可。
神经细胞培养需高糖，培养液应含有或加葡萄糖至6g/L。
目前培养海马神经元可选用B27无血清培养液。
4) 血清：有胎牛血清、小牛血清和马血清等。
分装成小瓶，4℃保存备用（分装前需56℃灭活30分钟）。
5) 胰蛋白酶溶液：用于分离细胞。
先用少量灭菌三蒸水将胰蛋白酶粉末溶成糊状，然后补水至2.5%浓度，振荡摇匀，4℃过夜，待完全溶解后用滤器过滤灭菌，并分装成1-2ml冻存。
用前以D-Hanks平衡盐水或其他无钙镁离子溶液溶解稀释至0.25%或0.125%。
SD大鼠海马神经元原代培养及形态学观察
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ Ｈｉｐｐｏｃａｍｐａｌ ｎｅｕｒｏｎ；Ｐｆｉｍａ￣ ｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎ；ＨＥ ｓｔａｉｎｉｎｇ
海 马锥 体神 经元 是 海 马 区的 主要 成分 ，主 要功 能 是参 与近 期 记 忆 、情 绪 及 内脏 功 能 调 节 ，是 老 年 性 痴 呆、癫痫等疾病 的主要病变部位¨Ｉ２ Ｊ。原代培养神经 元能建 立一 个很好 的体 外 神 经元 活 动 实验 模 型 ，具 有 影响因素单一、机体干扰因素少和结果易分析等优点。 从 细胞 和分 子 水 平 上 深 入研 究 海 马神 经 元 的 物 质 代 谢 、生理 、药理 及形 态 特 征 ，海 马神 经 元 原代 培 养 是一 个 必不 可少 的前提 条件 Ｊ。 １ 材料 与方 法 １．１ 试剂 胰 蛋 白酶 （Ｓｉｇｍａ）、Ｂ２７、胎 牛 血清 （ＰＡＡ）、 Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ（Ｇｉｂｏｃｏ）。小 鼠抗大 鼠 ＭＡＰ一２单 克 隆抗体
Ｎｉｓｓｌ ｂｏｄｉｅｄ ｗｅｒｅ ｉｎ ｔｈｅ ｃｙｔｏｐｌａｓｍ．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ：Ｎｅｕｒｏｎｓ ａｒｅ ｄｉｖｅｒｓｉｆｉｅｄ，ａｎｄ ａｒｅ ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｉｎ ＭＡＰ一２，ａｓ ｗｅｌｌ ａｓ ＮＳＥ ｓｔａｉｎｉｎｇ．
Ｆｏｒ ＨＥ ｓｔａｉｎｉｎｇ，ｎｕｃｌｅｕｓ ａｎｄ ｃｙｔｏｐｌａｓｍ ａｒｅ ｂｌｕｅ ａｎｄ ｒｅｄ，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ． Ｎｉｓｓｌｅ ｂｏｄｉｅｓ ａｒｅ ｉｎ ｃｙｔｏｐｌａｓｍ ａｎｄ ｓｅｌｄｏｍ ｉｎ Ｎｅｕｒ ｉｔｅ．
ｂｏｄｉｅｓ ｗｅｒｅ ｔｒ ｉａｎ￣ｅ，ｆｕｓｉｆｏｒｍｉｓ ａｎｄ ｅｌｌｉｐｓｅ ｓｈａｐｅ．Ｃｅｌｌｓ ｗｅｒｅ ｂｒｏｗｎ ｉｎ ＭＡＰ－２ ａｎｄ ＮＳＥ ｓｔａｉｎｉｎｇ．Ｔｈ ｅ ｐｕｒｉｔｙ ｄｅｇｒｅｅ ｏｆ ｎｅｕｒｏｎｓ
大鼠海马神经细胞原代培养技术的优化_张金波
大鼠海马神经细胞原代培养技术的优化张金波,王淑秋,朱金玲,罗佳滨,张淑红,金岳雷(佳木斯大学基础医学院,黑龙江佳木斯154007)摘要:目的:建立海马神经细胞原代培养技术。
方法:取新生1～3d 的W istar 大鼠,开颅,迅速分离出海马组织在H ank s 中剪碎,加入0.125%胰蛋白酶2mL 消化,胎牛血清终止消化,细胞计数后种植于多聚赖氨酸包被的6孔培养板中。
结果:神经细胞存活率高,纯度达90%以上,神经细胞生长良好。
结论:用此方法能成功获取大鼠海马神经细胞。
关键词:海马神经细胞;原代培养;胰蛋白酶中图分类号:Q 421;R 388 文献标识码:A 文章编号:1008-0104(2009)04-0020-02 海马锥体神经元是海马区的主要成分,主要功能是参与近期记忆、情绪及内脏功能调节,是老年性痴呆、癫痫等疾病的主要病灶之一[1]。
为了能在细胞水平和分子水平深入研究发育中海马神经细胞的生化、代谢、生理、药理及形态,建立海马神经细胞原代分散培养技术,越来越引起基础医学和临床医学的重视。
1 材料与方法1.1 动物与试剂实验动物:新生1～3d 的W istar 大鼠,由佳木斯大学实验动物中心提供。
主要试剂:N euralbasal 培养基、B 27培养基添加剂、青链霉素(Gibco 公司产品),胰蛋白酶、胎牛血清、多聚赖氨酸(Sigm a 公司产品),阿糖胞苷(上海华联制药有限公司)。
1.2 方法1.2.1 培养板的处理在取海马前一天,用35mm 孔径的6孔培养板,每个孔中加入0.1g L 的聚L -赖氨酸2mL ,静止30m in 除去溶液,用三蒸水冲洗3遍,放入二氧化碳培养箱内过夜待用。
1.2.2 培养方法取新生1～3d 的W istar 大鼠,用95%乙醇消毒,开颅,剥离脑膜,迅速分离出海马组织在H ank s 液中剪碎约1mm 3,然后离心500r m in ,5m in ,去掉H ank s 液,加入0.125%胰蛋白酶2mL ,消化约20m in (37℃、5%CO 2条件下),中间轻轻振摇2～3次,尽量去除胰酶,加入10%胎牛血清终止消化,离心500r m in ,5m in ,去上清,加入无血清培养基,用火焰刨光的玻璃吸管轻轻吹打数次,用200目的细胞筛过滤后,取0.1mL 按台盼蓝拒染法进行活细胞计数,制成5×105 mL 密度的细胞悬液,种植于多聚赖氨酸包被的6孔培养板中,每孔加2mL ,24h 后全量换无血清培养基。