如何用trizol同时提RNA和蛋白
trizol提rna方法
trizol提rna方法TRIzol提RNA方法简介TRIzol提RNA方法是一种常用的RNA提取方法，采用TRIzol试剂将RNA稳定在总RNA样品中提取出来，通过分离纯化使RNA的质量和完整性得到一定保证。
TRIzol提RNA方法具有以下特点：1. 适用范围广TRIzol提RNA方法不仅适用于多种类型的样品，如细胞、组织和微生物等，还可用于分离多种类型的RNA分子，如mRNA、rRNA和miRNA等。
2. 提高RNA的纯度和质量TRIzol试剂具有独特的成分，可以最大限度地去除DNA、蛋白质等干扰物质，提高RNA的纯度和质量。
同时，TRIzol提RNA方法还可以避免RNA的降解和失活，保证RNA完整性。
3. 操作简单、快速TRIzol提RNA方法操作简单，一般可以在1-2小时内完成RNA提取。
相对于其他RNA提取方法，TRIzol提RNA方法快速、高效。
TRIzol提RNA方法步骤TRIzol提RNA方法共分为以下步骤：1. 样品裂解将样品加入TRIzol试剂中，裂解细胞并溶解RNA。
2. 相分离将样品和TRIzol混合液沉淀，然后加入一个有机溶剂，使RNA与水相分离。
3. 提取RNA将RNA上清液收集起来，加入氯仿，进一步去除有机溶剂和DNA。
4. 沉淀RNA将RNA上清液沉淀，将RNA稳定在沉淀中，去除残留的有机溶剂和盐分。
5. 溶解RNA将RNA沉淀中的RNase-free水添加至RNA沉淀中，彻底溶解RNA。
如何提高TRIzol提RNA质量和完整性1. 样品处理不同类型的样品有不同的处理方式。
对于细胞和组织等样品，应尽量在收集后尽快进行TRIzol提RNA操作，避免RNA在细胞或组织中降解和失活。
2. TRIzol试剂的使用使用新鲜的TRIzol试剂，并根据使用说明操作。
避免直接接触试剂和皮肤等。
3. RNA逆转录和扩增在进行RNA逆转录和扩增前，应对RNA质量和完整性进行检测，以确保数据准确性。
(完整版)Trizol法提取RNA实验步骤.doc
Trizol 法使用步骤一、分离纯化的基本原理研究基因的表达和调控时常常要从组织和细胞中分离和纯化RNA。
RNA 质量的高低常常影响 cDNA 库， RT-PCR和 Northern Blot等分子生物学实验的成败。
Trizol 是一种新型总RNA 抽提试剂，内含异硫氰酸胍等物质，能迅速破碎细胞，抑制细胞释放出的核酸酶。
二、用户需自备的试剂和材料无水乙醇、氯仿、Glycogen（可能需要）、 1.5ml Eppendorf 管（ RNase-free）、 Tips（ RNase-free）三、准备工作RNase酶非常稳定，是导致 RNA 降解最主要的物质。
它在一些极端的条件可以暂时失活，但限制因素去除后有迅速复性。
用常规的高温高压蒸气灭菌方法和蛋白抑制剂都不能是RNase 完全失活。
它广泛存在于人的皮肤上，因此，在与RNA 制备有关的分子生物学实验时，必须戴手套。
RNase 的又一污染源是取液器，根据取液器制造商的要求对取液器进行处理。
用用 DEPC配制的 70%乙醇擦洗取液器的内部和外部，基本达到要求。
取时必须戴手套。
一般情况下采RNase-free 的物品1、料制品的处理尽可能使用无菌，一次性塑料制品，已标明 RNase-Free 的塑料制品，如没有开封使用过通常没有必要再次处理。
对于国产塑料制品，原则上都必须处理方可使用。
处理步骤如下：1）在玻璃烧杯中注入去离子水，加入 DEPC使 DEPC的终浓度为 0.1%。
注意： DEPC为剧毒物，活性很强，小心在通风柜中使用。
2）处理的塑料制品放入一个可以高温灭菌的容器中，注入DEPC 水溶液，使塑料制品的所有部分都浸泡到溶液中。
3）在通风柜中室温处理过夜。
4）将 DEPC水溶液小心倒到废液瓶中，用铝箔封住含已 DEPC水处理过的塑料制品的烧杯，高温高压蒸气灭菌至少 30 分钟。
5）烘箱用合适的温度烘拷至干燥。
置于干净处备用。
2、璃玻和金属物品250°C 烘烤 3 小时以上。
Trizol提取RNA_DNA_PR步骤
Trizol提取RNA、DNA、蛋白质步骤1st step RNA的提取一、材料食管癌组织。
二、设备研钵，冷冻台式高速离心机，低温冰箱，紫外检测仪，电泳仪，电泳槽。
三、试剂耗材1、无RNA酶灭菌水：用将高温烘烤的玻璃瓶（180℃2小时）装蒸馏水(去离子水或MilliQ 的高纯水更好)，然后加入0.01%的DEPC（体积/体积），处理过夜后高压灭菌。
2、75%乙醇：用DEPC处理水配制75%乙醇，（用高温灭菌器皿配制），然后装入高温烘烤的玻璃瓶中，存放于低温冰箱。
3、trizol4、氯仿5、手套、帽子、口罩6、1ml、100ul、10ul枪头、1.5ml和200ul EP管（DEPC处理过的）7、液氮8、甲醛1.2 DEPC水配制的3 M，pH5.2 的NaAc：在80 mL DEPC水中溶解40.8 克NaAc.3H20（Amresco公司），用冰乙酸调pH至5.2，定容到100 mL。
1.3 10×甲醛变性胶缓冲液[10×FA（formaldehyde agarose）gel buffer：200 mM的MOPs，50 mM的NaAc，10 mM的EDTA]：称6.8 克NaAc.3H20，溶于400 mL DEPC处理过的去离子水中，然后加20.9 克MOPs溶解，再加1.86 克EDTA二水二钠，用1 M灭菌的NaOH调pH至7.0（约用NaOH 40 mL）加DEPC处理过的水定容到500 mL，棕色瓶中室温避光保存。
1.4 5×加样缓冲液（5×loading buffer）：先配水饱和的溴酚兰液，在一只1.5 mL 离心管中加入约0.1 mg 溴酚兰，加入 1 mL DEPC 水溶解，充分振荡溶解，离心，可见离心管底部有溴酚兰粉末剩余，上层液体即水饱和的溴酚兰液。
加入以下各种成分：4.00 mL 10×FA gel buffer3.84 mL 甲酰胺2.00 mL 100%的甘油720.00 μL 37%（约12.3 M）的甲醛80.00 μL 0.5 M 的EDTA（pH8.0）16.00 μL 水饱和的溴酚兰（若颜色太淡，可以加40 μL）100.00 μL DEPC 水分装1.5 mL 离心管，除常用的4℃保存外，其余-20℃保存。
Trizol法提取RNA实验步骤及原理(新手详细注释版)
Trizol法提取RNA实验步骤及原理(新手详细注释版)Trizol法提取RNA实验步骤及原理(新手详细注释版)一、实验步骤1. 涂布区域准备- 确保实验室台面干净整洁，并消毒工作区域。
- 准备所需的试剂和材料，包括Trizol试剂、异丙醇、70%乙醇、无菌乙酸纯水等。
2. 细胞样本处理- 从培养皿中收集所需的细胞样本，注意避免污染。
- 使用无菌PBS缓冲液洗涤细胞，以去除培养基和细胞碎片。
- 加入适量的Trizol试剂至细胞样本中，充分悬浮细胞。
- 注意：为了保护RNA的完整性，在细胞样本处理过程中尽量迅速操作，避免长时间接触Trizol试剂。
3. 提取RNA- 将含有细胞样本和Trizol试剂的混合物转移到无菌离心管中。
- 加入适量的氯仿，摇匀混合，并静置15分钟，使混合物体相分离。
- 低速离心10分钟，将上层的无色透明液体转移到新的无菌离心管中。
4. 分离RNA- 加入等体积的异丙醇，轻轻倾斜离心管，使RNA沉淀形成。
- 低速离心10分钟以沉淀RNA，上清液中通常含有DNA。
- 倒掉上清液，并加入70%乙醇洗涤RNA沉淀，轻轻颠倒离心管以洗涤RNA。
- 低速离心5分钟，倒掉乙醇。
5. 干燥RNA- 用洗涤过的无菌乙酸纯水溶解RNA沉淀，轻轻颠倒离心管以溶解RNA。
- 将溶解的RNA转移至无菌离心管中。
- 在室温或37摄氏度下迅速干燥RNA，避免长时间曝露。
6. 储存RNA- 使用RNase-free水溶解RNA沉淀，测定RNA的浓度和纯度。
- 分配等量的RNA至多个RNase-free离心管中，储存在-80摄氏度的冰箱中。
二、实验原理Trizol法是一种常用于提取RNA的方法，其原理如下：1. 细胞破裂- Trizol试剂能够迅速破坏细胞膜，使细胞释放出RNA。
- Trizol试剂中含有酚和氯仿，酚用于破坏脂质，氯仿用于改变混合物的密度，从而使RNA与其他细胞成分分离。
2. 分离RNA- 经过破裂后，细胞内的DNA、RNA和蛋白质等成分被混合在一起，形成上清液。
trizol提取rna的原理
trizol提取rna的原理
Trizol提取RNA的原理
Trizol是一种用于提取RNA的试剂，其原理基于酚-氯仿法。
该方法通过将细胞或组织样品与Trizol试剂混合，使细胞膜破裂，细胞核释放出来，RNA与DNA等核酸被溶解在Trizol试剂中。
接着，加入氯仿进行相分离，使RNA在上清液中，DNA在有机相中，蛋白质在界面形成沉淀，从而实现RNA的提取。
Trizol试剂中的酚会破坏细胞膜，使RNA与DNA等核酸被释放出来。
酚具有疏水性，可以与细胞膜疏水区域相互作用，破坏细胞膜完整性，从而释放内部的核酸。
酚的存在还有助于保护RNA不受核酸酶的降解。
添加氯仿后，形成两相体系。
RNA在上清液中，DNA在有机相中。
通过离心分离，可以将RNA从上清液中提取出来。
氯仿对RNA有很强的萃取能力，可以有效地将RNA从混合体系中分离出来。
加入异丙醇沉淀RNA。
异丙醇可以改变RNA的溶解性，使RNA沉淀下来。
此时，RNA呈现出丝状状况，可以通过离心将RNA沉淀物收集起来。
最终，通过洗涤和溶解步骤，可以得到高质量的RNA。
总的来说，Trizol提取RNA的原理是通过酚破坏细胞膜，释放核酸；氯仿相分离，将RNA与DNA分离；异丙醇沉淀RNA，最终得到纯净的RNA。
这种方法简单、快速，适用于各种类型的样品，是一种
常用的RNA提取方法。
通过了解Trizol提取RNA的原理，可以更好地操作和优化RNA提取的实验过程，确保得到高质量的RNA样品。
Trizol法提取RNA实验步骤及原理(新手详细注释版)
Trizol法提取RNA实验步骤及原理(新手详细注释版)RNA提取是一种常用的实验技术，它可以用于研究基因表达、蛋白质合成等方面。
而Trizol法是一种常用的RNA提取方法，下面我将详细介绍该方法的实验步骤及原理。
一、实验材料和设备1. 细胞样本：如洋葱、酵母等植物或动物细胞；2. Trizol试剂盒：包括Trizol reagent、DMEM/F12培养基、异丙醇、氯仿等试剂。
3. 离心机：用于分离细胞和RNA;4. 紫外分光光度计：用于测定RNA的浓度和纯度。
二、实验步骤1. 取适量的细胞样本，加入适量的DMEM/F12培养基中，用离心机离心去除细胞碎片和杂质。
2. 将上清液转移到新的管子中，加入2 mL异丙醇，轻轻摇匀，使其与细胞充分混合。
3. 加入1 mL Trizol reagent,混匀后室温下静置10 min;4. 离心管中液体分为4层，从上往下分别是黄色(含有RNA)、白色(含有蛋白质)、透明(上清液)和红色(含有DNA)。
取出黄色层进行下一步处理。
5. 用吸头将黄色层的RNA吸取到一个新的试管中，加入适量的氯仿，轻轻摇匀。
6. 离心试管，将RNA和氯仿分离。
7. 用吸头将上层的白色RNA溶液吸出一部分，加入等量的异丙醇，混匀后离心。
8. 将上清液倒掉，留下含RNA的沉淀物。
9. 用紫外分光光度计测定RNA的浓度和纯度。
三、实验原理Trizol法提取RNA的原理是利用Trizol reagent中的Trizol和氯仿对细胞进行裂解，使RNA释放出来。
具体来说，Trizol reagent中的Trizol是一种有机溶剂，它能够破坏细胞膜并将细胞内的RNA溶解在水中。
而氯仿则是一种脂溶性溶剂，它能够与RNA结合形成复合物，使得RNA更容易被提取出来。
在实验过程中，首先加入异丙醇的作用是破坏细胞膜，使RNA更容易释放出来。
然后加入Trizol reagent,使其与细胞充分混合并裂解细胞。
Trizol法提取RNA实验步骤32839教学提纲
T r i z o l法提取R N A 实验步骤32839Trizol法使用步骤一、分离纯化的基本原理研究基因的表达和调控时常常要从组织和细胞中分离和纯化RNA。
RNA质量的高低常常影响cDNA库，RT-PCR和Northern Blot等分子生物学实验的成败。
Trizol是一种新型总RNA抽提试剂，内含异硫氰酸胍等物质，能迅速破碎细胞，抑制细胞释放出的核酸酶。
二、用户需自备的试剂和材料无水乙醇、氯仿、Glycogen（可能需要）、 1.5ml Eppendorf管（RNase-free）、 Tips（RNase-free）三、准备工作RNase酶非常稳定，是导致RNA降解最主要的物质。
它在一些极端的条件可以暂时失活，但限制因素去除后有迅速复性。
用常规的高温高压蒸气灭菌方法和蛋白抑制剂都不能是RNase完全失活。
它广泛存在于人的皮肤上，因此，在与RNA制备有关的分子生物学实验时，必须戴手套。
RNase的又一污染源是取液器，根据取液器制造商的要求对取液器进行处理。
一般情况下采用用DEPC配制的70%乙醇擦洗取液器的内部和外部，基本达到要求。
取RNase-free的物品时必须戴手套。
1、料制品的处理尽可能使用无菌，一次性塑料制品，已标明RNase-Free 的塑料制品，如没有开封使用过通常没有必要再次处理。
对于国产塑料制品，原则上都必须处理方可使用。
处理步骤如下：1）在玻璃烧杯中注入去离子水，加入DEPC使DEPC的终浓度为0.1%。
注意：DEPC为剧毒物，活性很强，小心在通风柜中使用。
2）处理的塑料制品放入一个可以高温灭菌的容器中，注入DEPC水溶液，使塑料制品的所有部分都浸泡到溶液中。
3）在通风柜中室温处理过夜。
4）将DEPC水溶液小心倒到废液瓶中，用铝箔封住含已DEPC水处理过的塑料制品的烧杯，高温高压蒸气灭菌至少30分钟。
5）烘箱用合适的温度烘拷至干燥。
置于干净处备用。
2、璃玻和金属物品250°C烘烤3小时以上。
TRIZOL法提取总RNA
目录
• 实验原理 • 实验步骤 • 结果分析 • 注意事项 • 实验优化和常见问题处理
01
实验原理
Trizol的组成和作用
Trizol是一种常用的细胞裂解液，主要由苯酚、异硫氰酸胍和苯酚等成分 组成。
苯酚的作用是使蛋白质变性并释放核酸，异硫氰酸胍的作用是抑制DNA 酶活性，防止DNA降解，同时能ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ效地变性蛋白质，使RNA充分释放。
RNA的完整性检测
琼脂糖凝胶电泳
将RNA样品进行琼脂糖凝胶电泳，观察28S和18S rRNA条带的亮度及完整性， 判断RNA的质量。
生物信息学分析
将RNA测序数据与基因组数据进行比对，分析转录本的拼接情况，评估RNA的 完整性。
反转录和PCR验证
反转录
将RNA反转录成cDNA，以便进行后 续的PCR验证。
效果。
去除DNA和蛋白质
在提取RNA的过程中，需要去除DNA 和蛋白质等杂质，以避免对后续实验 的干扰。
在去除杂质的过程中，需要注意控制 好离心时间和转速，以保证去除效果。
Trizol法中，DNA和蛋白质可以通过 离心和洗涤的方法去除。在离心后， 上清液中的DNA和蛋白质可以被去除， 而RNA则留在沉淀中。
在使用Trizol法时，通常采用玻璃匀浆器或匀浆机进行匀浆破碎。
抽提RNA
抽提RNA的目的是将RNA从细 胞碎片和其他杂质中分离出来。
Trizol法是一种常用的RNA抽提 试剂，它能够有效地分离出
RNA，同时抑制DNA和蛋白质 的降解。
在抽提过程中，需要按照试剂说 明书进行操作，注意控制好细胞 碎片的浓度和体积，以保证抽提
将提取的RNA存储在无菌环境中， 避免污染。
Trizol法提取RNA实验步骤及原理(新手详细注释版)
Trizol法应用步调一.分别纯化的基起源基础理研讨基因的表达和调控时经常要从组织和细胞平分别和纯化RNA.RNA质量的高下经常影响cDNA库,RTPCR和Northern Blot等分子生物学试验的成败.Trizol是一种新型总RNA抽提试剂,内含异硫氰酸胍等物资,能敏捷破裂细胞,克制细胞释放出的核酸酶.二.用户需自备的试剂和材料无水乙醇.氯仿.Glycogen（可能须要）. 1.5ml Eppendorf管（RNasefree）. Tips（RNasefree）三.预备工作RNase酶异常稳固,是导致RNA降解最重要的物资.它在一些极端的前提可以临时掉活,但限制身分去除后有敏捷复性.用通例的高温高压蒸气灭菌办法和蛋白克制剂都不克不及是RNase完全掉活.它普遍消失于人的皮肤上,是以,在与RNA制备有关的分子生物学试验时,必须戴手套.RNase的又一污染源是取液器,依据取液器制作商的请求对取液器进行处理.一般情形下采取用DEPC(焦炭酸二磷脂,一种RNase克制剂)配制的70%乙醇擦洗取液器的内部和外部,根本达到请求.取RNasefree 的物品时必须戴手套.1.料成品的处理尽可能应用无菌,一次性塑料成品,已标明RNaseFree 的塑料成品,如没有开封应用过平日没有须要再次处理.对于国产塑料成品,原则上都必须处理方可应用.处理步调如下：1）在玻璃烧杯中注入去离子水,参加DEPC使DEPC的终浓度为0.1%.留意：DEPC为剧毒物,活性很强,当心在通风柜中应用.2）处理的塑料成品放入一个可以高温灭菌的容器中,注入DEPC水溶液,使塑料成品的所有部分都浸泡到溶液中.3）在通风柜中室温处理留宿.4）将DEPC水溶液当心倒到废液瓶中,用铝箔封住含已DEPC水处理过的塑料成品的烧杯,高温高压蒸气灭菌至少30分钟.5）烘箱用适合的温度烘拷至湿润.置于清洁处备用.2.璃玻和金属物品250°C烘烤3小时以上.四.从组织中提取总RNA1)液氮研磨：组织块直接放入研钵中,参加少量液氮,敏捷研磨,待组织变软,再加少量液氮,再研磨,如斯三次,按50100mg组织/ml Trizol参加Trizol,转入离心管进行第2步操纵.（液氮既能使各类组织成分不轻易被损坏或降解,又能使组织变硬,脆性增长易于磨碎.终止细胞表里一切生物反响,防止RNA酶的降解反响）2) 匀浆：组织样品按50100mg/mlTrizol 参加Trizol.别的,组织体积不克不及超出Trizol体积的10%,不然匀浆后果会不好,用电动匀浆器充分匀浆约需12分钟.五.从细胞中提取总RNA1) 造就贴壁细胞：不须消化,可直接用Trizol进行消化.裂解,Trizol体积按10cm2/ml比例参加.2) 悬浮细胞可直吸收集.裂解,每1ml Trizol可裂解5×106动物.植物或酵母细胞,或107细菌细胞.六.操纵步调1.细胞或组织加Trizol后,室温放置5min,使其充决裂解.注：此时可放入70℃长期保持.2.12,000rpm 离心5min,弃沉淀.3.按200ul氯仿/ml Trizol参加氯仿,振荡混匀后室温放置15min.注：禁用漩涡振荡器,以免基因组DNA断裂.（氯仿为有机溶剂,有用的使有机相和无机相敏捷分别.有机相中主如果酚和蛋白联合,从而使得蛋白和RNA离开,RNA进入水相）4.4℃12,000g离心15min.5.汲取上层水相,至另一离心管中.注：万万不要汲取中央界面;若同时提取DNA和蛋白质,则保存基层酚相存于4℃冰箱,若只提RNA,则弃基层酚相.6.按0.5ml异丙醇/ml Trizol 参加异丙醇（沉淀RNA）混匀,室温放置510min.7.4℃12,000g离心10min,弃上清,RNA沉于管底.8.按1ml 75%乙醇/ml Trizol参加75%乙醇（沉淀RNA）,平和振荡离心管,悬浮沉淀.9.4℃8,000g离心5min,尽量弃上清.10.室温晾干或真空湿润510min.注：RNA样品不要过于湿润,不然很难消融.11.可用50ul H2O,TE buffer或0.5%SDS消融RNA样品,5560℃,510min.注：H2O.TE或0.5%SDS均须用DEPC处理并高压.（TE缓冲液由Tris和EDTA配制而成,重要用于消融核酸,能稳固储存DNA和RNA.用于酶切反响不克不及应用SDS）12.测O.D值定量RNA浓度.注：此办法提取RNA A260/A280值在1.61.8之间;产率估量：组织标本：（ug RNA/mg组织）110ug,造就细胞（ug RNA/106 Cell）：515ug.注：组织或细胞量过少,可酌情削减Trizol用量;组织或细胞用量过多,会引起DNA对RNA的污染;高蛋白.脂肪或多糖类组织,肌肉组织或块状植物组织等,组织匀浆或液氮研磨后须4℃12,000g离心10min去掉落不溶物,再进行下面操纵,若顶层有脂肪物,则也须去掉落;热天提RNA,带手套是必须的,手是RNase的重要起源;组织块用液氮研磨,后果最好,若没有液氮或电动匀浆器,可用手动匀浆器代替,此时组织块不宜过大,且需先用眼科铰剪将组织碱碱剪碎,然后再充分研磨.6.1.2.1 肝脏.肠道.肌肉总RNA提取办法①应用已高温蒸汽灭菌的手术刀和镊子从鱼的腹部剖解开,从中掏出完全的肝脏.肠.肌肉等组织,置于离心管后立刻放入液氮中;②组织在液氮下研磨成粉,取少量至加有1mLTrizol的1.5ml离心管中,充分混杂后于4℃,12,000rpm离心15min;③取上清移至新1.5ml离心管中,参加200ul氯仿,激烈震动直至呈乳白色,于4℃,12,000rpm离心15min;④取上清移至新1.5ml离心管中,参加500ul异丙醇,轻轻颠倒10次,冰上放置20mins,于4℃,12,000rpm离心15min;⑤弃上清,参加1ml75%乙醇（用DEPC水现配现用）,于4℃,12000rpm离心5min,反复此步调一次;⑥弃上清后,室温湿润57mins;⑦参加适量（2030ul）的DEPC水消融沉淀65℃消融,20℃（最好80℃）保管,检测RNA浓度,并电泳检测.6.1.2.2 RNA浓度测定和电泳检测取2ul提取好的RNA溶液,于Nanodrop 2000 Spectrophptpmeter测定RNA浓度及A260/A280的相对吸光度,纯净RNA的A260/A280应在1.82.2之间.电泳检测：1%琼脂糖,1×A TE缓冲液,90V电泳30min,凝胶成像体系不雅察,剖析成果.6.1.2.3 肝脏.肌肉.肠道样品cDNA的合成反响按照TaKaRa公司的PrimeScript® RT reagent Kit With gDNA Eraser（Perfect Real Time) 反转录试剂盒解释书进行,合成cDNA模板.①（残存的）基因组DNA的除去反响,在PCR管中设置装备摆设如下缓冲液.试剂用量5×gDNA Eraser Buffer 2.0 μlgDNA Eraser 1.0 μlTotal RNA X* ulRNase Free dH2O up to 10 μl （gDNA.genomic DNA.基因组DNA：是指有机体在单倍体状况下的DNA全体含量,是染色体DNA,与质粒等染色体外DNA差别.）X*：依据检测到的RNA浓度来设置装备摆设;混杂平均后,室温放置2030min②反转录反响,在PCR管中设置装备摆设如下缓冲液（20ul system）,反响液配制在冰长进行.为了包管反响液配制的精确性,进行各项反响时,先按反响数+1的量配制Master Mix ,然后再分装到每个反响管中.试剂应用量5×PrimeScript® Buffer 2（for Real Time） 4.0 ulPrimeScript® RT Enzyme Mix I 1.0 μlRT Primer Mix 1.0 μl①的反响液10.0 ulRNase Free dH2O up to 20 μl③混杂平均后,在PCR仪长进行逆转录反响,反响前提为：37℃ 15 min85℃ 5 sec 然后将得到的cDNA存放于20℃冰箱保管待用.。
TRIzol提RNA
一、TRIzol试剂适用于从细胞和组织中快速分离RNA。
TRIzol试剂有多组分分离作用,与其他方法如硫氰酸胍/酚法、酚／SDS法、盐酸胍法、硫氰酸胍法等相比，最大特点是可同时分离一个样品的RNA\DNA\蛋白质．TRIzol使样品匀浆化，细胞裂解，溶解细胞内含物，同时因含有RNase抑制剂可保持RNA的完整性。
在加入氯仿离心后，溶液分为水相和有机相，RNA在水相中。
取出水相用异丙醇沉淀可回收RNA；用乙醇沉淀中间层可回收DNA；用异丙醇沉淀有机相可回收蛋白质。
TRIzol试剂可用于小量样品（50-100mg组织、5×106细胞）也适用于大量样品（≥1g组织、>107细胞）。
对人，动物，植物组织，细菌均适用，可同时处理大量不同样品，整个提取过程在一小时内即可完成。
分离的总RNA无蛋白质和DNA污染，可用于Northern Blot，dot blot，ployA筛选，体外翻译，RNase保护分析和分子克隆。
在用于RT-PCR时，如果两条引物存在于一个单一外显子内，建议用无RNase的DNase Ⅰ处理RNA样品，避免出现假阳性。
共纯化的DNA可用作标准，比较不同样品RNA的得率，也可用于PCR 和酶切。
蛋白质可用于Western Blotting。
规格：100ml 黄色透明液体储存条件：2-8℃避光保存12个月注意：请勿直接接触皮肤或吞咽，以免灼伤。
如接触皮肤应立即用洗涤剂和大量水冲洗。
忌用乙醇擦洗，乙醇会加重灼伤程度。
预防RNase污染注意事项：1．经常更换新手套，皮肤上常带有的细菌，霉菌可能成为RNase的来源。
2．使用灭过菌的RNA专用塑料制品避免交叉污染。
3．RNA在TRIzol试剂中时不会被RNase污染，但提取后继续处理过程中应使用不含RNase的塑料和玻璃器皿。
玻璃器皿可在150℃烘烤4小时，塑料制品可在0.5M NaOH中浸泡10分钟，然后用水彻底清洗，高压灭菌，即可去除RNase。
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样品加氯仿分层后,移去上层水相,每使用1ml TRIzol加0.3ml无水乙醇混匀，室温放置3分钟，2-8℃不超过2000×g离心5分钟。
2.取上清，用异丙醇沉淀蛋白质。
每使用1ml TRIzol加1.5ml异丙醇，室温放置10分钟，2-8℃12000×g离心10分钟弃上清。
3．用含0.3M盐酸胍的95%乙醇洗涤蛋白质沉淀。
每使用1ml TRIzol加2ml洗涤液，室温放置20分钟，2-8℃7500×g离心5分钟，弃上清，重复两次。
4.用2ml无水乙醇室温放置20分钟，2-8℃7500×g离心5分钟，弃上清。
5．把无水乙醇倒掉，开盖子静置4-8min分钟，用1%SDS溶解蛋白质，反复吸打，50℃温浴使其完全溶解，不溶物2-8℃10000×g离心10分钟除去。
分离得到的蛋白质样品可用于Western Blot或-5至-20℃保存备用。
注意事项：
1.蛋白质沉淀可保存在含0.3M盐酸胍的95%乙醇或无水乙醇中2-8℃一个月以上或-5至-20℃一年以上。
2．这一步可省去：用0.1% SDS在2-8℃透析三次，10000×g离心10分钟取上清即可用于Western Blot。
常见问题分析：
得率低：
A.样品裂解或匀浆处理不彻底
B．最后得到的蛋白质沉淀未完全溶解
蛋白质降解：组织取出后没有马上处理或冷冻
电泳时条带变形：蛋白质沉淀洗涤不充分。