种子的扩大培养

4、接种量的确定
移入种子的体积 接种量＝ ————————— 接种后培养液的体积 过大过小都不好，最终以实践定，如大多数抗 生素为7～15%。但是一般认为大一点好。 双种：两个种子罐接种到一个发酵罐中。 倒种：一部分种子来源于种子罐，一部分来源于 发酵罐。
接种量对菌体形态和产Υ亚麻酸的影响
杨博， 中国油脂，2002
10 15 20 25 30
42 36 32 30 28 不同接种量影响菌体的生长和发酵
100 102.1 102.1 102.5 101.4
表2 种源对发酵提炼生产的影响
（以种罐种子液的生产指标作对照）
种源 种罐种子液 发酵罐前期发酵液
发酵指数
提炼收率 （％）
发酵提炼的生产指数
100 106.2
25 10 15 105.4 97.1 102.3
25 15 10 105.1 98.3 103.3
30 15 15 106.7Βιβλιοθήκη Baidu98.1 104.7
30 20 10 106.2 99.3 105.5
35 20 15 106.2 98.7 104.8
20%种子罐＋10%发酵罐前期发酵液效果最好
5、种龄
Υ亚麻酸是一种人体必需多价不饱和脂肪酸，它 是人体前列腺素的前体物质，在预防与治疗心脑血 管疾病、糖尿病治疗、增强免疫力、抗癌和保护皮 肤等方面具有重要的生理功能。 Υ亚麻酸发酵一般是采用丝状真菌来进行，丝 状真菌的形态往往对发酵有较明显的影响，而丝状 真菌发酵Υ亚麻酸时菌丝体形态的不同对发酵的影 响很少有报道。
种子扩大培养的目的与要求
种子扩培的目的 接种量的需要 菌种的驯化 缩短发酵时间、保证生产水平 种子的要求： 活力强，移种至发酵后能够迅速生长，迟缓期短。 生理状况稳定，个体与群体。 菌体总量及浓度能满足大容量发酵罐的要求。 无杂菌污染。 保持稳定的生产能力。
第二节 种子制备过程举例
一、谷氨酸生产的种子制备 制备过程 斜面菌种 →一级种子培养→二级种子培养 →发酵
100 97.1
100 103.1
发酵前期发酵液作为种子，发酵指数明显 提高，发酵后期菌体自溶明显，影响提炼 收率。
表3 两种种源混合接种时的试验结果
（以接种量为20％的种罐种子液的生产指标作对照）
总接种量（％） 种罐接种量（％） 发酵罐接种量（％） 发酵指数 提炼收率（％） 发酵提炼的生产指数
20 10 10 102.9 97.4 100.2
二、实验室阶段
1、培养物选择的原则 目的：种子扩培到一定的量和质，根据菌种 的特点最终的培养物可分为两类： 对于不产孢子和芽孢的微生物 ——获得一定数量和质量的菌体。 对于不产芽孢和孢子的微生物，实验室阶 段的种子扩培最终是获得一定数量和质量 的菌体，如谷氨酸的种子培养。
对于产孢子的微生物 获得一定数量和质量的孢子。 菌丝体培养步骤少，因而更容易获得 量和质稳定的种子，但操作繁琐。 获得一定数量和质量的菌丝体。 便于操作，但需要更仔细的控制。
3、一级种子
培养基：（葡萄糖、乳糖、蔗糖）、玉米浆。 培养条件：27℃，40h。 接种量：200亿孢子/t。 200 /t 目的：菌体生长。
4、二级种子
培养基：同上 培养条件：27℃、10~14h。 接种量：10%。
种子的质量要求
菌丝长稠呈丝状、菌丝团很少，有中小 空孢，处于Ⅲ～Ⅳ期。 青霉素发酵菌丝体的生长共分为6个期， 1～4为年青期，4～6期合成青霉素的能 力最强。
镜检：24h，多个杆菌首位相连成线形，处于繁 殖旺盛期30h开始出现芽孢。
6、种子的质量要求
量：要求达到一定的浓度。 质: 菌丝形态、培养液外观 （生长处于某个阶段、均匀等等） 理化指标：C、N、P的含量，pH 值，酶活等。 无污染（无杂菌）
7、影响种子质量的因素
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原材料质量 培养条件
温度 湿度 通气量
1、斜面培养
培养基：蛋白胨 1%，牛肉膏1%，氯化钠 0.5 琼脂 2%， pH 7.0～7.2。 培养条件：32℃，生长18～24h。 培养基特点：有利于菌体的生长，原料比较精细 生长斜面要求：生长良好，所使用斜面连续传 代不超过3次。
2. 一级种子（摇瓶）
培养基：葡萄糖2%，尿素0.5%，玉米浆 2.5％ K2HPO4 0.1%。 培养条件：于1000mL三角瓶中，装液200～ 250mL，32℃培养12h。 培养基特点：有利于菌体的生长，所使用的原 料已经基本接近于发酵培养基。
种龄：是指种子罐中培养的菌体开始移入 下一级种子罐或发酵罐时的培养时间。 种龄短：菌体太少；种龄长：易老化。 原则：对数生长期末，细胞活力强，菌 体浓度相对较大，但是最终由实验结果 定。
表4 菌龄对产酶的影响
菌龄（h） 12 18 24 30
发酵时间（h） 72 56 48 60
酶活力（U/mL） 62.37 66.12 74.55 52.10
二、青霉素生产的种子制备
制备过程： 安瓿管 → 斜面孢子 → 大米孢子 → 一级种子 → 二级种子 → 发酵
1、斜面孢子
培养基：甘油、 葡萄糖、 蛋白胨等。 培养条件：25℃、7d，注意湿度50%左右。 培养基特点：有利于长孢子，用量少而精细。
2、大米孢子
培养基：大米及氮源（玉米浆）。 培养条件：25℃、7d，控制湿度。 培养基的特点：成本低、米粒之间结构 疏松提高比表面积和氧的传质， 营养适当（要求大米的白点小） 有利于孢子的生长。 大米孢子的要求：1粒米含1.4×106个孢子。
例：柠檬酸发酵
以蔗糖为原料 成分 麦芽汁 蔗糖 NH4NO3 K2HPO4 MgSO4.H2O KCl 琼脂 斜面 麦汁 种子罐 2.5-5% 0.225% 0.03% 0.025% 2% 发酵 20% 0.11% 0.025% 0.015%
薯干粉
成分
斜面
种子罐
发酵
麦芽汁 麦汁 薯干粉 (NH4)2SO4 琼脂 2％
3、二级种子（种子罐）
培养基：和一级种子相似，其中葡萄糖用水解 糖代替，浓度为2.5%。 培养条件：在种子罐中培养（容积为发酵罐的 1%），32℃培养7～10h。 培养基的特点：菌体生长，更接近于发酵培养基。
种子的质量要求：
108～109cfu/mL。（菌数） 大小均匀，呈单个或八字排列。（菌体） pH 7.0～7.2时结束。（性能） 活力旺盛。（活力）
10％ 0.5％
22-28％
3、发酵级数的确定
一般由菌丝体培养开始计算发酵级数，但有 时，工厂从第一级种子罐开始计算发酵级数。 谷氨酸：三级发酵 一级种子（摇瓶）→二级种子 （小罐）→发酵 青霉素：三级发酵 一级种子 （小罐）→二级种子（中罐）→发酵
发酵级数确定的依据
级数受发酵规模、菌体生长特性、接 种量的影响。 级数大，难控制、易染菌、易变异， 管理困难，一般2～4级。 在发酵产品的放大中，反应级数的确 定是非常重要的一个方面。
2、培养基选择的原则
培养基的选择应该是有利于菌体的生长， 对孢子培养基应该是有利于孢子的生长。 在原料方面，实验室种子培养阶段，规模 一般比较小，因此为了保证培养基的质量， 培养基的原料一般都比较精细。
3、起始接种物的传代问题
细菌 保藏斜面 → 活化斜面 产孢子 保藏 → 母斜面 → 子斜面 原则：使菌种的传代次数尽可能的少。
第六章
种子扩大培养
生物工艺学
第六章 种子的扩大培养
第一节 种子扩大培养的目的与要求 第二节 种子制备实例 第三节 种子制备的技术概要
第一节 种子扩大培养的目的与要求
种子扩大培养的概念:种子扩大培养是指将 保存在砂土管、冷冻干燥管中处休眠状态 的生产菌种接入试管斜面活化后，再经过 扁瓶或摇瓶及种子罐逐级扩大培养,最终获 得一定数量和质量的纯种过程。这些纯种 培养物称为种子。
采用被孢霉进行Υ亚麻酸发酵时接种量可 以明显影响菌丝体
本研究发现，采用被孢霉进行Υ亚麻酸发酵时接种 量可以明显影响菌丝体的形态，从而影响菌体干 重和Υ亚麻酸产量。
青霉素发酵罐生产工艺的改进
表1 种罐种子液的接种量试验结果
到达40％菌浓度的发酵周期 发酵指数 （h） （发酵指数以接种量10％为对照） 接种量（％，v/v）
三、生产车间阶段
1、培养物的选择原则 在生产车间阶段，最终一般都是获得一定 数量的菌丝体。 菌丝体比孢子要有利： 缩短发酵时间 有利于获得好的发酵结果
2、培养基选择的原则
目的：获得一定数量和质量的菌体，因此培养基 的选择应首先考虑的是有利于孢子的发育和 菌体的生长，所以营养要比发酵培养基丰富 在原料方面 不如实验室阶段那么精细，而是基本接近于发酵 培养基，这有两个方面的原因: 一是成本；二是驯化。
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斜面冷藏时间
第三节 种子制备的技术概要
一、种子制备的过程
实验室阶段：不用种子罐，所用的设备为培养箱、摇 床等实验室常见设备，在工厂这些培养过程一 般都在菌种室完成，因此现象地将这些培养过 程称为实验室阶段的种子培养。 生产车间阶段：种子培养在种子罐里面进行，一般 在工程归为发酵车间管理，因此形象地称这些 培养过程为生产车间阶段。