lipo3000质粒转染步骤
细胞转染实验实验报告
细胞转染是基因工程、分子生物学研究等领域中常用的一种技术，用于将外源基因或RNA导入细胞内，研究基因表达、基因调控等功能。
本实验旨在利用脂质体介导的方法将目的基因转染入HEK293细胞，并观察转染效率及目的基因的表达情况。
二、实验材料1. 细胞：HEK293细胞2. 载体：pEGFP-C1（绿色荧光蛋白基因）3. 试剂：胎牛血清、DMEM培养基、转染试剂（如Lipofectamine 3000）、Trizol 试剂、PCR试剂盒、DNA marker等三、实验方法1. 细胞培养：将HEK293细胞接种于6孔板，培养于含10%胎牛血清的DMEM培养基中，置于37℃、5%CO2的培养箱中培养至对数生长期。
2. 转染：按照Lipofectamine 3000说明书进行操作，将pEGFP-C1质粒与转染试剂混合，室温孵育5分钟，然后加入细胞培养液中，将细胞培养板放入培养箱中继续培养。
3. 检测转染效率：转染后24小时，观察细胞绿色荧光表达情况，以判断转染效率。
4. RT-PCR检测目的基因表达：收集转染后的细胞，使用Trizol试剂提取细胞总RNA，进行RT-PCR扩增目的基因，以判断目的基因的表达情况。
5. Western blot检测目的蛋白表达：收集转染后的细胞，提取细胞总蛋白，进行SDS-PAGE电泳，转膜，加入一抗和二抗，进行Western blot检测目的蛋白表达。
四、实验结果1. 转染效率：转染后24小时，显微镜下观察细胞绿色荧光表达情况，结果显示大部分细胞呈现出绿色荧光，说明转染效率较高。
2. RT-PCR结果：RT-PCR扩增目的基因，结果显示目的基因扩增条带清晰，说明目的基因已成功转染入细胞。
3. Western blot结果：Western blot检测目的蛋白表达，结果显示目的蛋白条带清晰，说明目的蛋白已成功表达。
1. 脂质体介导的转染方法具有操作简单、转染效率高、安全性好等优点，适用于多种细胞类型的转染。
脂质体转染操作步骤
脂质体转染操作步骤进行实验之前，请先规划好实验，一般细胞转染需要24h-72h，所以要充分了解细胞生长速度，计算所需脂质体和DNA的储备量，并确认准备好所需试剂：Opti-MEM无血清培养基，Lipofectamine转染试剂，以及DNA，这个一定要确认好。
1、细胞铺板（1）一般会选择复苏细胞传代3-4次（汇合率达到90%之前对细胞进行传代，不要长到100%），从解冻过程中恢复过来可以稳定生长的细胞进行细胞转染，传代次数高(>30-40)时，细胞的生长速度和形态会改变。
（2）如果提总蛋白，一般选择六孔板进行转染，因为转染的细胞提取蛋白的总量能达到200ug，一般够做并且需要的DNA和Lipofectamine又相对比较少。
（3）传代条件取决于所用的细胞系。
对于快速生长的细胞，倍增时间为16小时(如HEK293)。
对于生长缓慢的细胞，倍增时间为36小时(如原代细胞)。
（4）转染当天，将细胞铺板。
如果在转染前一天或更早时间铺板，转染效率可能下降，如果是简单细胞系的转染，可以直接在前一天晚上铺板，第二天来转染。
转染时，细胞密度会影响转染效率，细胞密度保持在汇合率为70-90%（这个前提是转染24h，如果转染48h则需要汇合率为50-70%），细胞的铺板和转染也可同时进行。
2、细胞转染吸去培养皿中的培养基，用PBS或者无血清培养基清洗一次。
更换无血清培养基。
准备转染制备液，用灭菌后的EP管制备。
以六孔板为例，A液：用200μl Opti-MEM稀释4μg质粒；B液:用200μl Opti-MEM稀释10μl lipo2000，分别将A液、B液轻轻混匀，静置5min，吸取B液加入至A液中，轻轻混匀，室温静置20min。
加入转染试剂到每个孔的培养基中，6h后，更换成完全培养基，继续培养到24-48小时（不同的质粒和脂质体最佳搭配比例不同，转染前，应该摸一个最佳配比。
质粒：脂质体=1：1，1：1.5，1：2，1：2.5，1：3，1：3.5的梯度比例来检测最佳转染比例，一般质粒有带荧光，可以通过观察每组荧光强弱来判断转染效率）。
lipo转染操作步骤
L i p o2000瞬时转染细胞步骤Stealth?RNAiorsiRNATransfection以24孔板为例，其余规格的转染见表11中板，细胞密度为30-50%适宜。
注意：根据转染后细胞检测时间长短决定细胞中板密度，如果转染后需要长时间后检测，则细胞中板密度适当降低，已避免细胞过度生长导致存活降低。
2第二天（24-36小时后）每个孔转染方式如下：A将20pmolsiRNA溶于50ulOpti-mem无血清培养基中。
B将1ullipo2000溶于50ulOpti-mem无血清培养基中，混匀室温放置5min。
C将AB两管混合，放置20min。
3转染期间，将24孔板培养基换成无血清培养基，每孔400ul。
将C管mix加入24孔板对应孔中，4-6小时候换成有血清培养基。
PlasmidDNATransfectionDNA(ug):lipo2000(ul)=1:2-3转染时细胞密度越高，转染效率，表达效率也越高，并且可以降低细胞毒性。
1中板。
贴壁细胞：0.5-2X105cells/well，第二天待细胞密度达到70-80%时转染悬浮细胞：4-8X105cells/well，中板后随即转染。
2转染。
A将0.8ugDNA溶于50ulOpti-mem无血清培养基中。
B将2ullipo2000溶于50ulOpti-mem无血清培养基中，混匀室温放置5min。
C将AB两管混合，放置20min。
转染期间，将24孔板培养基换成无血清培养基，每孔400ul。
将C管mix加入24孔板对应孔中，4-6小时候换成有血清培养基。
Table1.CultureSharedreagentsDNAtransfectionRNAitransfection*：中板密度根据不同细胞不同实验有所不同，这里仅提的数据仅供参考**：6孔板细胞质粒转染量1-2ug足以。
***：6cmdish细胞质粒转染量4-6ug足以。
Opti-MEM?I减血清培养基是EMEM的改良型,其中使用了HEPES和碳酸氢钠进行缓冲,并添加次黄嘌呤、胸苷、丙酮酸钠、L-谷氨酰胺、痕量元素和生长因子.常用其作为无血清培养基与质粒和lip2000分别混合。
质粒转化、细胞转染步骤
质粒转化、细胞转染步骤
转化是指将外源DNA（常以质粒作为载体）导入受体细
胞（如大肠杆菌），从而使其获得新的遗传特性。
具体步骤如下：首先将12ul的质粒DNA加入50ul感受态cell中，轻柔混合后进行冰浴30min。
接着向管中加入培养基，混匀后使细菌
恢复正常生长状态。
然后在42℃下热激90s，迅速冰浴2min，最后在37℃下震荡培养（﹤225rpm）1h，使细菌获得新的遗
传特性。
转染（n）是将含有目的基因的载体转移到真核细胞内的
过程。
在进行质粒转染时，需要先将6-well-plate中的每个孔
培养至60-70%的状态。
然后在接种时每个孔加入2.5×105个
/ml的细胞。
接下来，将2.5ug质粒DNA和200ul的opti-
MEM混合，再加入6ul的转染液进行混匀，并在室温下静置
15min。
待转染细胞换成1.3ml的opti-MEM培养基后，将转
染复合物（200ul）轻轻均匀滴入细胞培养基中，并十字形摇
晃6-well-plate以混匀转染复合物。
最后将6-well-plate放入37℃、CO2培养箱中进行培养。
[说明]转染详细步骤大攻略
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[说明]转染详细步骤大攻略转染详细步骤大攻略范例----真核重组表达质粒pDsRed-N1-NS1在A549细胞中表达按上海索莱宝生物科技有限公司去内毒素质粒小提试剂盒说明书方法进行质粒抽提，测得质粒浓度为410.32ng/µl。
将培养的A549细胞铺板，待细胞密度长到90%左右时，按lipo2000说明书转染A549细胞，36h后于荧光显微镜下观察DsRed-NS1融合蛋白的表达情况。
具体操作步骤如下: 1)质粒准备按上海索莱宝生物科技有限公司去内毒素质粒小提试剂盒说明书方法进行质粒抽提，具体步骤如下:(1) 取1-5ml细菌培养物，12000rpm离心1 min,尽量吸除上清(菌液较多时可以通过多次离心将菌体沉淀收集到一个离心管中)。
(2) 向留有菌体沉淀的离心管中加入200µl溶液P1(请先检查是否已加入RNaseA),使用移液器或涡旋振荡器彻底悬浮细菌细胞沉淀。
(注:如果菌块未彻底混匀，会影响裂解导致质粒提取量和纯度偏低)(3)向离心管中加入200µl溶液P2，温和地上下翻转6-8次使菌体充分裂解。
(注:混匀一定要温和，以免污染基因组DNA，此时菌液应变得清亮粘稠，所用时间不应超过5min，以免质粒受到破坏)(4)向离心管中加入250µl溶液P3，立即温和地上下翻转6-8次，充分混匀，此时会出现白色絮状沉淀。
12000rpm 离心10min，用移液器小心地将上清转移到另一个干净的离心管中，尽量不要吸出沉淀。
(注:溶液P3加入后应立即混合，避免产生局部沉淀。
如果上清中还有微小白色沉淀，可再次离心后取上清)(5)加入1/5体积冰预冷的去内毒素清除剂，振荡混匀，溶液变浑浊，冰浴2min至溶液变清亮。
(6)37?水浴5 min，不时振荡，溶液又变浑浊。
12000rpm室温离心5min，溶液应分为两相，上层水相含质粒DNA，下层油状相含内毒素。
(7)将质粒DNA上层水相转移至新管，弃下层油状相，注意不要吸入油状相，重复抽提三次，即重复步骤5-7三次。
质粒转染实验步骤
质粒转染是哺乳动物细胞蛋白表达和昆虫细胞表达中至关重要的一步，转染的效率直接影响着整体实验的成败，本文阐述了昆虫细胞扩P1转染、293细胞小试转染、ExpiCHO细胞转染的具体操作步骤与实验体系，同时附有一些我们整理的提高质粒转染效率的注意事项，供大家参考。
1、昆虫细胞扩P1转染：（1）取细胞状态良好，活力98%以上，对数生长期细胞铺六孔板，90万/孔；（2） 27°静置培养30 min,待完全贴壁后进行转染；（3）转染体系注：转染过程中一个实验一个滤器一个离心管，完全独立，避免交叉污染；质粒室温预热，转染试剂和培养基37度预热3、ExpiCHO细胞转染：（1）前一天取细胞状态良好，活力98%以上，对数生长期细胞稀释至3-4 x10^6个/ml；（2）转染当天细胞计数7-9 x10^6个/ml细胞状态良好，活力98%以上,将细胞稀释至6 x10^6个/ml；（3）转染体系（3）.细胞种类不同细胞种类的细胞在做转染时所需要的转染体系是不同的，不能一种体系用在所有类型细胞的转染实验。
如上所示，针对昆虫细胞转染、293细胞小试转染、ExpiCHO细胞转染我们分别使用了三种不同的转染体系。
（4）DNA纯度在制备高纯度质粒时，还需要对DNA进行内毒素的去除，内毒素的存在会造成细胞毒性，严重影响转染效率，因此我们在做质粒转染时，对交付的质粒有如下要求：交付的质粒使用TE溶解（10 mM Tris-HCl,1 mMEDTA）, A260/A280比值在1.8-2.0之间，质粒浓度在1000 ng/ul左右①内毒素小于0.128 eu/ug②质粒大抽要求：无内毒素、无苯酚、无氯化钠③质粒需经过跑胶鉴定，超螺旋质粒含量大于50%，无明显蛋白污染（5）.转染试剂转染试剂的原则是高效、低毒、方便、廉价，每种转染试剂都会提供一些已经成功转染的细胞株列表和文献，通过这些资料可选择最适合实验设计的转染试剂。
质粒转染实验步骤
质粒转染大肠杆菌材料试剂：胰化蛋白胨，酵母提取物，琼脂，胰化蛋白胨，酵母提取物，琼脂，NaCl NaCl NaCl，，NaOH NaOH（调（调pH pH）），氨苄青霉素，卡那霉素，质粒提取试剂盒仪器：高压灭菌锅，4242℃恒温水浴锅，℃恒温水浴锅，，恒温摇床（3737℃℃,225rpm ,225rpm）），无菌培养板，消毒1.5ml 离心管，消毒枪头，无菌操作台实验步骤：1. LB 培养基的配制：在950 ml 去离子水中加入去离子水中加入: :胰化蛋白胨 10g 酵母提取物 5g NaCl 10g 摇动容器直至溶质溶解动容器直至溶质溶解..用5mol/LNaOH 调pH 至7.0.7.0.用去离子水定容至用去离子水定容至1L.1L.在在15psi 高压下蒸汽灭菌20min.固态培养基LB 固体培养基及倒板 ：（1）.配制：配制：100mlLB 100mlLB 培养基加入1.5g 琼脂粉（2）.抗生素的加入：高压灭菌后，将融化的LB 固体培养基置与5555℃的水浴中，待培℃的水浴中，待培养基温度降到5555℃时（手可触摸）加入氨苄抗生素（终浓度为℃时（手可触摸）加入氨苄抗生素（终浓度为5050μμg/ml g/ml）），以免温度过高导致抗生素失效，并充分摇匀。
（3）.倒板：一般10ml 倒1个板子。
培养基倒入培养皿后，打开盖子，在紫外下照10-15分钟。
（4）.保存：用封口胶封边，并倒置放于4℃保存，一个月内使用。
2. 从-70-70℃冰箱中取℃冰箱中取200μl 感受态细胞悬液，室温下使其解冻，解冻后立即置冰上。
3. 加入质粒DNA 溶液（含量不超过50ng 50ng，体积不超过，体积不超过10μl），轻轻摇匀，冰上放置30分钟后。
4. 4242℃水浴中热击℃水浴中热击45s/90s ，热击后迅速置于冰上冷却3-5分钟。
5. 向管中加入1ml LB 液体培养基（不含Amp ），混匀后3737℃振荡培养℃振荡培养1小时，使细菌恢复正常生长状态，并表达质粒编码的抗生素抗性基因（复正常生长状态，并表达质粒编码的抗生素抗性基因（Ampr Ampr ）。
质粒的转化及转染
质粒的转化转化（transformation）是某一基因型的细胞从周围介质中吸收来自另一基因型的细胞的DNA而使它的基因型和表型发生相应变化的现象。
这现象首先发现于细菌，也是细菌间遗传物质转移的多种形式中最早发现的一种；转化的研究不但在理论上有重要意义，而且在基因工程中是将质粒或病毒载体引入宿主细胞的一种重要手段。
质粒转化的目的：将质粒转入细菌内以便获得更多的质粒，达到扩增的目的。
1、从－80℃冰箱中取出感受态的细菌在冰上融化。
（感受态下的细菌更容易接受外源性的DNA）2、打开大实验室（千万不可拿进细胞房，天敌）的细菌专用超净操作台的紫外灯灭菌10min。
3、打开水浴锅加热，温度设置为42℃。
4、取若干EP管，标记后，每EP管中加入50μL的菌液。
如質粒難抽，則加大用量。
5、每EP管加入2.5μL的质粒后打匀，动作要轻柔，感受态细菌比较脆弱。
6、将EP管放在冰上孵育25min。
7、将EP管插入浮萍放入42℃水浴锅加热60s（要求时间绝对精确）。
8、将EP管插入冰块90s。
9、每EP管加入1ml细菌培养基后放入大摇床上摇45min（大摇床带有加热功能，温度为37℃）。
10、将Amp细菌培养板（培养基预先加入Amp）放入细菌培养箱中加热至37℃。
11、将枪头预先折弯，吸入菌液后均匀涂在细菌培养板上。
（每盘100μ）12、待液体稍干后将细菌培养板倒置放入细菌培养箱中12—16h。
（过夜）（倒置的目的是为了液体影响细菌生长，另外液体影响观察单克隆体）Amp青霉素（氨苄青霉素Ampicillin）：目的并不是为了灭菌，Amp本身就是抗生素，而是用它来筛菌。
是一种抗生素。
为广谱半合成青霉素，毒性极低。
抗菌谱与青霉素相似，对青霉素敏感的细菌效力较低，对草绿色链球菌的抗菌作用与青霉素相仿或略强。
对白喉杆菌、破伤风杆菌和放线菌其效能基本和青霉素相同。
对肠球菌及李司忒菌的作用则优于苄青霉素。
对耐药葡萄球菌及其它能产生青霉素酶的细菌均无抗菌作用。
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lipo3000质粒转染步骤
引言：
质粒转染是生物学实验中常用的一种技术手段，用于将外源基因导入到细胞内，从而实现对目标基因的研究。
lipo3000是一种常用的质粒转染试剂，具有高效、快速和稳定的特点。
本文将详细介绍lipo3000质粒转染的步骤及相关操作注意事项。
一、实验前的准备工作
在进行lipo3000质粒转染之前，需要准备以下实验材料：
1. 质粒：根据实验需要选择合适的质粒，如表达载体、报告载体等。
2. 细胞培养基：根据实验需要选择适合细胞的培养基，如DMEM、RPMI-1640等。
3. 细胞：选择合适的细胞株，如HEK293、HeLa等。
4. lipo3000试剂盒：包括lipo3000试剂、Opti-MEM培养基等。
5. 离心管、无菌移液器、培养皿等实验器材。
二、lipo3000质粒转染步骤
1. 细胞的预处理：
将细胞培养在含有10%胎牛血清的培养基中，使其在培养皿中达到80%～90%的密度。
2. 质粒和lipo3000试剂的混合：
将所需质粒和lipo3000试剂分别按照试剂盒说明书的要求稀释至适
当浓度。
然后，将等体积的质粒和lipo3000试剂混合，并轻轻摇晃管子使其充分混合。
3. 混合物的静置：
将混合物静置15-30分钟，使质粒和lipo3000试剂充分结合形成复合物。
期间避免剧烈震荡或振荡。
4. 细胞的转染：
将预处理好的细胞用细胞培养基洗涤2次，使细胞附着在培养皿上。
然后，加入含有混合物的培养基，使细胞与质粒和lipo3000试剂的复合物接触。
注意避免气泡的产生。
5. 转染液的去除：
将转染液去除，用含有10%胎牛血清的培养基洗涤细胞，以去除未吸附的质粒和lipo3000试剂。
6. 细胞的培养：
将洗涤后的细胞加入新鲜的培养基中，继续培养。
根据实验需要，可以添加相应的筛选剂或诱导剂。
三、操作注意事项
1. 在操作过程中，保持实验环境的无菌，减少外源污染的可能性。
2. 严格按照试剂盒说明书的要求操作，避免试剂的浓度过高或过低。
3. 在混合质粒和lipo3000试剂时，注意轻轻摇晃管子，避免剧烈震荡或振荡，以免损害复合物的结构。
4. 在细胞转染过程中，避免气泡的产生，以免影响转染效果。
5. 转染液的去除时要注意轻柔操作，避免对细胞造成损伤。
6. 在细胞培养过程中，要注意培养基的更换和细胞的定期观察，以确保细胞的正常生长和表达。
结论：
lipo3000质粒转染是一种常用的基因传递技术，通过有效的质粒转染，可以实现外源基因的导入和表达。
本文详细介绍了lipo3000质粒转染的步骤及相关操作注意事项，希望能对相关实验研究提供一定的指导与帮助。
在实验过程中，科学严谨的操作和细心的观察是确保实验成功的关键。