脂质体转染实验原理与操作步骤总
生产脂质体转染试剂工艺流程
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脂质体介导转染方法
脂质介导的短暂表达
实验材料
哺乳动物细胞
试剂、试剂
质粒DNA完全培养基氯化铯DMEM
盒
仪器、耗材
培养皿培养箱聚苯乙烯管
实验步骤
1. 按5×105细胞/孔的量在六孔板中接种指数期生长的细胞，在37℃ 5%CO2培养箱中
培养过夜，直至细胞80%汇片。
（如果用100 mm 培养皿代替六孔扳，则培养细胞至80%
汇片，将所有数量扩大8倍）
2. 在聚苯乙烯管中配制DNA/脂质体复合物如下：稀释质粒DNA至1 ml DMEM-SF中，
在旋涡混合器上振荡1 s 然后加入脂质体悬液、再次旋起混匀。
在室温下温育5~ 10 min，
使DNA与阳离子脂质体结合。
3. 吸去DMEM-SF培养液，用1 ml 的完全DMEM-SF洗1次，吸去DMEM-SF。
对毎
个35 mm 孔中，直接在细胞上加1 ml DNA/脂质体复合物。
在37℃培养箱中温育3~5 h。
4. 往每孔细抱中加入1 ml 的DMEM-20完全培养液，在37℃培养箱中继续温育24~48
h。
5. 吸去完全DMEM/DNA/脂质体复合物，毎孔加入2 ml 新的DMEM-10完全培养液，
继续搵育24~48 h。
6. 收集细胞：用细胞刮于刮下细胞，或胰蛋白酶消化或冻融裂解细胞。
进行适当的表
达分析。
脂质体进行稳定表达。
脂质体转染mrna细胞原理
脂质体转染mrna细胞原理
脂质体转染mRNA细胞的原理是利用脂质体作为载体，将目的mRNA包裹在其内部，然后通过与细胞膜融合让mRNA进入细胞质，最终达到将目的mRNA表达出来的目的。
脂质体是由磷脂和胆固醇等组成的微小囊泡结构，与细胞膜结构相似。
其内部的疏水层可以容纳水溶性的物质，包括mRNA分子。
脂质体转染mRNA的步骤如下：
1. 准备目的mRNA：目的mRNA是指需要转染到细胞内进行表达的mRNA，可以是外源的mRNA，也可以是经过In vitro 转录合成的人工合成mRNA。
这些mRNA一般会在实验室中事先准备好。
2. 制备脂质体：将脂质体粉末或液体悬浮液溶解在适当的缓冲液中，形成脂质体溶液。
脂质体通过磷脂的双层结构来包裹mRNA，形成稳定的脂质体-mRNA复合物。
3. 混合脂质体与mRNA：将目的mRNA与脂质体溶液混合，并进行充分的混合和搅拌。
这样就可以使mRNA和脂质体发生相互作用，形成脂质体-mRNA复合物。
4. 转染细胞：将脂质体-mRNA复合物加入到需要转染的细胞培养液中，使其与细胞接触。
脂质体复合物会与细胞膜融合，从而使脂质体内的mRNA进入细胞质。
5. mRAN转录和表达：在细胞质中，脂质体释放的mRNA会
被细胞的核糖体识别，进而进行mRNA转录和翻译，最终使
该mRNA编码的蛋白质在细胞内得到表达。
脂质体作为转染载体具有一定的优势，如制备简单、生物相容性好等。
但是，脂质体转染也存在一些问题，如转染效率较低、引起细胞毒性等。
因此，在实际应用中需对转染条件进行优化，以提高转染效率和减少毒性。
阳离子脂质体基因转染
阳离子脂质体基因转染脂质体（lipofectinregeant，LR）试剂是阳离子脂质体N-[1-2，3-Dioleyoxy，Propyl]-n，n，n-Trimethylammonium Chloride（DOTMA）和Dioleoylphotidye-thanolamine（DOPE）的混合物[1：1（w/w）]。
它适用于把DNA转染入悬浮或贴壁培养细胞中，是目前条件下最方便的转染方法之一。
转染率高，优于磷酸钙法，比它高5~100倍，能把DNA和RNA转染到各种细胞。
用LR进行转染时，首先需优化转染条件，应找出该批LR对转染某一特定细胞适合的用量、作用时间等，对每批LR都要做：第一，先要固定一个DNA的量和DNA/LR混合物与细胞相互作用的时间，DNA可从1~5μg和孵育时间6小时开始，按这两个参数绘出相应LR需用量的曲线，再选用LR和DNA两者最佳的剂量，确定出转染时间（2~24小时）。
因LR对细胞有一定的毒性，转染时间以不超过24小时为宜。
细胞种类：COS-7、BHK、NIH3T3、Hela和Jurkat等任何一种细胞均可作为受体细胞。
1、操作步骤[方法一]：（1）细胞培养：取6孔培养板（或用35mm培养皿），向每孔中加入2mL含1~2×105个细胞培养液，37℃CO2培养至40%~60%汇合时（汇合过分，转染后不利筛选细胞）。
（2）转染液制备：在聚苯乙稀管中制备以下两液（为转染每一个孔细胞所用的量）A液：用不含血清培养基稀释1-10μg DNA，终量100μL，B液：用不含血清培养基稀释2-50μgLR，终量100μL，轻轻混合A、B液，室温中置10-15分钟，稍后会出现微浊现象，但并不妨碍转染（如出现沉淀可能因LR或DNA浓度过高所致，应酌情减量）。
（3）转染准备：用2mL不含血清培养液漂洗两次，再加入1mL不含血清培养液。
（4）转染：把A/B复合物缓缓加入培养液中，摇匀，37℃温箱置6~24小时，吸除无血清转染液，换入正常培养液继续培养。
脂质体转染实验原理与操作步骤总(精)
脂质体转染的实验原理与操作步骤大全日期:2012-06-25 来源:互联网作者:青岚点击:3644次摘要:细胞转染的方法主要包括:电穿孔法、显微注射、基因枪、磷酸钙共沉淀法、脂质体转染法、多种阳离子物质介导、病毒介导的转染等, 理想的细胞转染方法是具有高转染效率、对细胞的毒性作用小等, 本文主要介绍细胞转染常用的方法 -脂质体转染的原理和操作步骤等。
找产品,上生物帮 >> >>细胞转染的方法主要包括:电穿孔法、显微注射、基因枪、磷酸钙共沉淀法、脂质体转染法、多种阳离子物质介导、病毒介导的转染等, 理想的细胞转染方法是具有高转染效率、对细胞的毒性作用小等,本文主要介绍细胞转染常用的方法 -脂质体转染的原理和操作步骤等。
脂质体 (lipofectin regeant, LR 试剂是阳离子脂质体 N-[1-2, 3-Dioleyoxy , Propyl]-n, n , n-Trimethylammonium Chloride(DOTMA和 Dioleoyl photidye-thanolamine(DOPE的混合物 [1:1(w/w]。
它适用于把 DNA 转染入悬浮或贴壁培养细胞中 ,是目前条件下最方便的转染方法之一。
转染率高,优于磷酸钙法,比它高5~100倍,能把 DNA 和 RNA 转染到各种细胞。
用 LR 进行转染时, 首先需优化转染条件, 应找出该批 LR 对转染某一特定细胞适合的用量、作用时间等,对每批 LR 都要做:第一,先要固定一个 DNA 的量和DNA/LR混合物与细胞相互作用的时间, DNA 可从1~5μg和孵育时间 6小时开始,按这两个参数绘出相应 LR 需用量的曲线,再选用 LR 和 DNA 两者最佳的剂量,确定出转染时间 (2~24小时。
因 LR 对细胞有一定的毒性,转染时间以不超过 24小时为宜。
细胞种类:COS-7、 BHK 、 NIH3T3、 Hela 和 Jurkat 等任何一种细胞均可作为受体细胞。
脂质体转染原理及操作步骤
脂质体转染原理及操作步骤脂质体转染是一种常用的基因传递技术，用于将外源的核酸（例如DNA、RNA）转入细胞内。
脂质体是由人工合成的类似于细胞膜的双层脂质膜组成，具有较好的生物相容性和可降解性，因此可以用来包裹并传递外源核酸进入目标细胞内。
本文将详细介绍脂质体转染的原理和操作步骤。
脂质体由两个疏水性脂质尾部和一个亲水性脂质头部组成，形成类似生物细胞膜的双层结构。
这种双层结构使得脂质体可以包裹水溶性的外源核酸，并形成脂质体-核酸复合物。
当复合物与细胞膜接触时，由于脂质体的类似性，这些复合物可以与细胞膜融合，并释放外源核酸进入细胞。
然而，简单地将脂质体-核酸复合物添加到细胞培养基中并不能有效地将外源核酸转入细胞内。
为了提高转染效率，常常需要使用电穿孔或钙磷共沉淀等方法，以增加细胞膜的通透性。
操作步骤：1.准备工作：-完整的脂质体转染试剂盒。
-DNA或RNA溶液。
-靶细胞。
-无菌操作条件下的实验室。
2.重组脂质体的合成：-按照试剂盒说明将脂质体复合物合成。
-使用无菌的工具和试剂。
3.核酸引物的制备：-将外源DNA或RNA与引物混合，使其形成核酸复合物。
4.细胞处理：-将培养皿中的细胞进行冲洗，去除培养基。
-将适量的细胞培养基添加到培养皿中，以保证细胞的正常生长。
5.导入核酸：-将所制备的核酸复合物滴加到细胞培养基中。
-将细胞培养皿置于无菌环境中，以便细胞吸收和利用核酸。
6.细胞培养：-按照细胞类型和所使用的培养基，将细胞置于恰当的培养条件下，并进行培养。
-根据需求添加所需要的生长因子和抗生素。
7.观察和分析：-在一定的培养时间后，观察细胞是否发生了显著的变化。
- 使用适当的实验方法（如PCR、Western blot等）检测外源基因的表达。
-观察并记录实验结果。
以上是脂质体转染的原理和操作步骤。
脂质体转染是目前常用的基因传递技术之一，可以用于研究基因功能、疾病治疗等领域。
随着技术的不断发展，转染效率和特异性将逐渐提高，为研究和治疗带来更多的机会和挑战。
lipo6000转染原理
lipo6000转染原理Lipo6000 是一种常用于基因转染的试剂，它在基因治疗和研究领域发挥着重要作用。
本文将从人类视角出发，介绍Lipo6000的转染原理及其应用。
Lipo6000是一种脂质体转染试剂，能够有效地将外源基因导入到细胞内。
在基因治疗中，我们常常需要将特定的基因传递给患者的细胞，以修复或替代缺陷基因，从而治疗疾病。
而Lipo6000就是这样一种工具，它能够帮助我们实现这个目标。
Lipo6000的转染原理是基于脂质体的特性。
脂质体是由磷脂和胆固醇等成分组成的微小球体，其外层由疏水性的脂质构成，内部则是亲水性的环境。
这种结构使得脂质体可以与DNA或RNA等带有负电荷的基因载体结合，并形成稳定的复合物。
当我们将Lipo6000和目标基因一起加入培养皿中，Lipo6000会与基因载体相互作用，形成脂质体-基因复合体。
这种复合体具有一定的正电荷，能够与细胞膜表面的负电荷相互吸引。
通过这种吸引力，脂质体-基因复合体能够与细胞膜结合，并被细胞摄入内部。
一旦脂质体-基因复合体进入细胞内部，细胞膜会自行形成小泡，将复合体包裹在内，并形成内吞体。
内吞体会随后与细胞内的溶酶体融合，释放出脂质体-基因复合体。
复合体内的基因载体则被释放到细胞质内，进一步被转运到细胞核内。
在细胞核内，基因载体会被进一步转录为mRNA，然后翻译为相应的蛋白质。
这样，我们就成功地将目标基因导入到细胞内，并实现了基因转染。
Lipo6000的转染原理简单而高效，被广泛应用于基因治疗、基因表达和基因功能研究等领域。
通过使用Lipo6000，研究人员可以将特定的基因导入到不同类型的细胞中，探索基因的功能和调控机制，以及开发新的基因治疗策略。
Lipo6000作为一种脂质体转染试剂，通过与基因载体相互作用，实现了外源基因的有效导入。
它在基因治疗和研究中发挥着重要作用，为我们揭示了基因的奥秘，为疾病治疗提供了新的思路和方法。
相信随着科学技术的不断发展，Lipo6000及其相关技术将为人类带来更多的福祉。
脂质体转染操作步骤
脂质体转染操作步骤进行实验之前，请先规划好实验，一般细胞转染需要24h-72h，所以要充分了解细胞生长速度，计算所需脂质体和DNA的储备量，并确认准备好所需试剂：Opti-MEM无血清培养基，Lipofectamine转染试剂，以及DNA，这个一定要确认好。
1、细胞铺板（1）一般会选择复苏细胞传代3-4次（汇合率达到90%之前对细胞进行传代，不要长到100%），从解冻过程中恢复过来可以稳定生长的细胞进行细胞转染，传代次数高(>30-40)时，细胞的生长速度和形态会改变。
（2）如果提总蛋白，一般选择六孔板进行转染，因为转染的细胞提取蛋白的总量能达到200ug，一般够做并且需要的DNA和Lipofectamine又相对比较少。
（3）传代条件取决于所用的细胞系。
对于快速生长的细胞，倍增时间为16小时(如HEK293)。
对于生长缓慢的细胞，倍增时间为36小时(如原代细胞)。
（4）转染当天，将细胞铺板。
如果在转染前一天或更早时间铺板，转染效率可能下降，如果是简单细胞系的转染，可以直接在前一天晚上铺板，第二天来转染。
转染时，细胞密度会影响转染效率，细胞密度保持在汇合率为70-90%（这个前提是转染24h，如果转染48h则需要汇合率为50-70%），细胞的铺板和转染也可同时进行。
2、细胞转染吸去培养皿中的培养基，用PBS或者无血清培养基清洗一次。
更换无血清培养基。
准备转染制备液，用灭菌后的EP管制备。
以六孔板为例，A液：用200μl Opti-MEM稀释4μg质粒；B液:用200μl Opti-MEM稀释10μl lipo2000，分别将A液、B液轻轻混匀，静置5min，吸取B液加入至A液中，轻轻混匀，室温静置20min。
加入转染试剂到每个孔的培养基中，6h后，更换成完全培养基，继续培养到24-48小时（不同的质粒和脂质体最佳搭配比例不同，转染前，应该摸一个最佳配比。
质粒：脂质体=1：1，1：1.5，1：2，1：2.5，1：3，1：3.5的梯度比例来检测最佳转染比例，一般质粒有带荧光，可以通过观察每组荧光强弱来判断转染效率）。
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脂质体转染的实验原理与操作步骤大全
日期：2012-06-25 来源：互联网作者：青岚点击：3644次
摘要：
细胞转染的方法主要包括：电穿孔法、显微注射、基因枪、磷酸钙共沉淀法、脂质体转染法、多种阳离子物质介导、病毒介导的转染等，理想的细胞转染方法是具有高转染效率、对细胞的毒性作用小等，本文主要介绍细胞转染常用的方法-脂质体转染的原理和操作步骤等。
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细胞转染的方法主要包括：电穿孔法、显微注射、基因枪、磷酸钙共沉淀法、脂质体转染法、多种阳离子物质介导、病毒介导的转染等，理想的细胞转染方法是具有高转染效率、对细胞的毒性作用小等，本文主要介绍细胞转染常用的方法-脂质体转染的原理和操作步骤等。
脂质体(lipofectin regeant，LR)试剂是阳离子脂质体N-[1-2，3-Dioleyoxy，Propyl]-n，n，n-Trimethylammonium Chloride(DOTMA)和Dioleoyl photidye-thanolamine(DOPE)的混合物[1：1(w/w)]。
它适用于把DNA转染入悬浮或贴壁培养细胞中，是目前条件下最方便的转染方法之一。
转染率高，优于磷酸钙法，比它高5~100倍，能把DNA和RNA转染到各种细胞。
用LR进行转染时，首先需优化转染条件，应找出该批LR对转染某一特定细胞适合的用量、作用时间等，对每批LR都要做：第一，先要固定一个DNA的量和DNA/LR混合物与细胞相互作用的时间，DNA可从1~5μg和孵育时间6小时开始，按这两个参数绘出相应LR需用量的曲线，再选用LR和DNA两者最佳的剂量，确定出转染时间(2~24小时)。
因LR对细胞有一定的毒性，转染时间以不超过24小时为宜。
细胞种类：COS-7、BHK、NIH3T3、Hela和Jurkat等任何一种细胞均可作为受体细胞。
一、脂质体(liposome)转染方法原理
脂质体(liposome)转染方法原理：脂质体((Iiposome)作为体内和体外输送载体的工具，已经研究的十分广泛，用合成的阳离子脂类包裹DNA，同样可以通过融合而进人细胞。
使用脂质体将DNA带人不同类型的真核细胞，与其它方法相比，有较高的效率和较好的重复性。
中性脂质体是利用脂质膜包裹DNA，借助脂质膜将DNA导入细胞膜内。
带正电的阳离子脂质体，DNA并没有预先包埋在脂质体中，而是带负电的DNA自动结合到带正电的脂质体上，形成DNA-阳离子脂质体复合物，从而吸附到带负电的细胞膜表面，经过内吞被导入细胞。
二、脂质体转染操作步骤
1、操作步骤[方法一]：
(1)细胞培养：取6孔培养板(或用35mm培养皿)，向每孔中加入2mL含1~2×105个细胞培养液，37℃CO2培养至40%~60%汇合时(汇合过分，转染后不利筛选细胞)。
(2) 转染液制备：在聚苯乙稀管中制备以下两液(为转染每一个孔细胞所用的量)A液：用不含血清培养基稀释1-10μg DNA，终量100μL，B液：用不含血清培养基稀释2-50μgLR，终量100μL，轻轻混合A、B液，室温中置10-15分钟，稍后会出现微浊现象，但并不妨碍转染(如出现沉淀可能因LR或DNA浓度过高所致，应酌情减量)。
(3)转染准备：用2mL不含血清培养液漂洗两次，再加入1mL不含血清培养液。
(4)转染：把A/B复合物缓缓加入培养液中，摇匀，37℃温箱置6~24小时，吸除无血清转染液，换入正常培养液继续培养。
(5)其余处理如观察、筛选、检测等与其它转染法相同。
注意：转染时切勿加血清，血清对转染效率有很大影响。
2、快速脂质体转染法操作步骤如下[方法二]：
(1)以5×105细胞/孔接种6孔板(或35mm培养皿)培养24小时，使其达到50~60%板底面积。
(2)在试管中配制DNA/脂质体复合物方法如下：
①在1mL无血清DMEM中稀释PSV2-neo质粒DNA或供体DNA。
②旋转1秒钟，再加入脂质体悬液，旋转。
③室温下放置5~10分钟，使DNA结合在脂质体上。
(3)弃去细胞中的旧液，用1mL无血清DMEM洗细胞一次后弃去，向每孔中直接加入1mL DNA/脂质体复合物，37℃培养3~5小时。
(4)再于每孔中加入20%FCS的DMEM，继续培养14~24小时，
(5)吸出DMEM/DNA/脂质体混合物加入新鲜10%FCS的DMEM，2mL/孔，再培养
24~48小时。
(6)用细胞刮或消化法收集细胞，以备分析鉴定。
3、稳定的脂质体转染方法如下：
(1)接种细胞同前，细胞长至50%板底面积可用于转染。
(2)DNA/脂质体复合物制备转染细胞同前(2)、(3)步骤。
(3)在每孔中加入1mL、20%FCS的DMEM，37℃培养48小时。
(4)吸出DMEM，用G418选择培养液稀释细胞，使细胞生长一定时间，筛选转染克隆，方法参照细胞克隆筛选法进行。
三、个人经验：
本人用的是Invitrogen公司的Lipofectamine2000在24孔板转染单层贴壁细胞。
(别的方法可以参考生产商提供的protocol)
1、转染前1天将0.5～2×105细胞接种于24孔培养板，并加入500ul不含抗生素的完全培养基，以保证转染时细胞汇合达90～95%。
2、准备复合物
(1) 将0.8ug DNA稀释于50ul无血清无抗生素的培养液中轻轻浑匀。
(2) 将2ul Lipofectamine2000稀释于50ul无血清无抗生素的培养液中，轻轻浑匀，室温孵育5分。
注意：必须在25分内进行。
(3) 5分后将它们混合，并轻轻浑匀，室温孵育20分。
3、吸去培养板的培养基，用PBS或无血清培养基(最好)清洗细胞2次。
4、将复合物(总体积100ul)加入培养孔，前后摇动培养板使其分布均匀。
5、将细胞放入培养箱孵育4～6h后，可以更换含血清培养液去除复合物(也可不用)。
6、24～48h后可以观察转入基因表达情况。
7、稳定转染：换含血清培养基24h后将细胞以1：10(或更高比例)传代，1天后更换筛选培养基筛选。
8、优化：要保证细胞汇合率达90～95%(比较高);DNA/ Lipofectamine2000比率1：0.5～1：5，一般细胞1：2～3.
脂质体转染法的主要优点是可用将DNA转染至悬浮或者铁壁细胞培养、转染效率相对较高、对基因片段大小的限制较小等，但是
阳离子脂质体对细胞的毒性相对较高，为了防止其毒性，要摸索好如下实验条件：脂质体与质粒的比例、细胞转染时间等。
脂质体是由脂双分子层组成的颗粒，可介导基因穿过细胞膜。
通过脂质体介导比利用病毒转导进行基因转移具有以下明显的优势：①脂质体与基因的复合过
程比较容易；②易于大量生产；③脂质体是非病毒性载体，与细胞膜融合将目的
基因导入细胞后，脂质即被降解，无毒，无免疫原性；④DNA或RNA可得到保护，
不被灭活或被核酸酶降解；⑤脂质体携带的基因可能转运至特定部位；⑥体外和
体内试验都表明，接近染色体大小的DNA片段也能被转运至宿主基因组中并增
长；⑦转染过程方便易行，重现性好。
脂质体是具有双层膜的封闭式粒子，自身聚集性脂类分子包封内水相介质，可分为大、小多层，寡多层和单室脂质体，医学应用较多为小单室脂质体。
基于
脂质体作为药物载体系统的经验，理想的用于转运基因的脂质体，对于质粒DNA
具有高包封率，保护DNA不被血浆核酶降解的特点，它们粒径分布范围窄，粒径
平均为100 nm或者更小。
为使脂质体接近血管外区域，故采用具有广泛的结合
潜力脂类，这种特殊脂类可促进与细胞膜融合和/或提高脂质体在循环系统中的
稳定性。
第1种为传统上的脂质体，人们可控制其体外行为，但不能控制其体内
行为，它们很快被灭活或被固定；第2种为无活性脂质体（即不与外界作用），
由于聚合物包封于表面的立体稳定性而抑制其相互作用；第3种脂质体表面结合
抗原、凝集素或其他基团，由于表面结合的特定配基，也可特定地相互作用；第
4种为反应活性脂质体，如离子型、靶敏感型和融合性脂质体，这种脂质体有时
指相转变的多孔脂质体，脂质体内有离子敏感亚基，Ca2+ 其他金属离子敏感性
脂质体，也包括阳离子脂质体，阴离子脂质体。
阴离子脂质体不属于有反应活性
类，但特殊的试验如试管内与相反电荷（多）离子相互作用例子除外。
常规脂质体进入细胞转运DNA实验，其原理是脂质体增强细胞体的聚集，即加速大分子、荷电多的分子透过膜，该过程相当复杂，尤其在包封较大片段时，
在实践中这种技术只在体外使用且要用融合剂，荷电越多用途越少。
脂质体可用于转基因，或制备的药物，利用脂质体可以和细胞膜融合的特点，将药物送入细胞内部。