用酶解酵母细胞壁
酵母生物饲料在水产养殖中的应用进展
酵母生物饲料在水产养殖中的应用进展何志刚1李小玲1,2(1,湖南省水产科学研究所,湖南长沙,410153;2,农业部渔业产品监督检验测试中心(长沙),长沙,410153)摘要:文章简单介绍了酵母的概况,重点介绍酵母生物饲料如酵母细胞壁、饲料酵母、酵母水解物、活性干酵母、酵母硒、海洋红酵母等。
对酵母生物饲料在水产养殖动物中的应用和研究进展情况进行详细介绍,并指出酵母生物饲料发展中存在的问题。
关键词:酵母生物饲料;水产养殖;应用;发展趋势酵母菌,一种传统食品酿造工业的主要生产菌株,如今已成为现代生物饲料最具吸引力的微生物细胞工厂。
这类单细胞真核微生物,其细胞及细胞内容物,如蛋白、氨基酸、多糖、有机酸、核酸、维生素等活性物质,都可参与生物饲料的绿色生产。
目前已知的酵母菌有500多种,以酵母为原料或生物载体,利用现代生物技术,并结合微生物发酵工程,已形成了一系列与酵母相关的具有特定营养或功能的生物饲料及饲料添加剂产品,通称为“酵母生物饲料”。
酵母生物饲料主要分为以下几大类:酵母细胞壁多糖、酵母水解物、活性干酵母、酵母硒、活酵母衍生物、复合酵母、酵母培养物、海洋红酵母、与芽孢杆菌等益生菌复配而成的EM菌或微生态制剂(用于水质或底质改良剂)、饲料酵母、利用酵母发酵而得到的酵母饲料。
1.酵母细胞壁多糖用于饲料中的酵母细胞壁是酵母经细胞自溶部分破壁、破壁酶解、分离洗涤、浓缩、干燥等一系列生产工艺,精制而成的富含β-葡萄糖、甘露聚糖等免疫因子的一种绿色饲料添加剂产品。
近年研究认为,酵母细胞壁含有的甘露寡糖和β-葡聚糖可对细菌、病毒引起的疾病及环境因素引起的应激反应产生非特性免疫力。
酵母细胞壁多糖是以酿酒酵母为原料,经过细胞破壁、酶解、分离提纯和干燥等工艺精制而成,在水产动物中的作用主要有:提高水产动物非特异性免疫力、提高水产动物的特异性免疫应答反应、显著提高水产动物抗病能力、能有效降低肝损伤,还具有一定促生长的作用。
细胞破碎技术
四、细胞破碎某些蛋白质在细胞培养时被宿主细胞分泌到培养液中，提取过程只需直接采用过滤和离心进行固液分离，然后将获得的澄清滤液再进一步纯化即可，其后续分离和纯化都相对简单。
但由于一些重组DNA(rDNA)产品结构复杂，必须在细胞内组装来获得生物活性，如果在培养时被宿主细胞分泌到培养液中，其生物活性往往有所改变，此类生物产品是细胞内产品(非分泌型)，这些产品主要为医药和保健产品，对于这类产品的提取，需要先应用细胞破碎技术破碎细胞，使细胞内产物释放到液相中，然后再进行提纯，为后续的分离纯化做好准备工作。
细胞破碎技术是指利用外力破坏细胞壁和细胞膜，使细胞内容物包括目的产物成分释放出来的技术，是分离纯化细胞内合成的非分泌型生化物质(产品)的基础。
随着重组DNA技术和组织培养技术上的重大进展，以前认为很难获得的蛋白质现在都可以大规模生产。
微生物细胞和植物细胞外层均为细胞壁，细胞壁里面是细胞膜，细胞膜和它所包围的细胞浆合称为原生质体。
动物细胞没有细胞壁，仅有细胞膜。
通常情况下，细胞壁较坚韧，细胞膜脆弱，易受渗透压冲击而破碎，因此细胞破碎的阻力主要来自于细胞壁。
基于遗传和环境等因素，不同类型生化物质其细胞壁的结构和组成不完全相同，故细胞壁的机械强度不同，细胞破碎的难易程度也就不同。
此外，不同的生化物质其稳定性有较大差别，在破碎过程中应防止变性和被胞内的酶水解。
因此，破碎方法的选择和操作条件的优化是十分必要的。
(一)机械破碎法机械破碎法分为高压匀浆破碎法、高速搅拌珠研磨破碎法和超声波破碎法三种。
1．高压匀浆破碎法Manton Gaulin高压匀浆器是高压匀浆破碎法常用的设备，它由可产生高压的泵和排出阀组成，排出阀具有狭窄的小孔，其大小可以调节。
细胞浆液通过止逆阀进入泵体内，在高压下迫使其在排出阀的小孔中高速冲出，并射向撞击环上，由于突然减压和高速冲击，使细胞受到高的液相剪切力而破碎。
在操作方式上，可以采用单次通过匀浆器或多次循环通过等方式，也可连续操作。
酿酒酵母表面展示表达系统及应用
凝集素展示表达系统
凝集素展示表达系统
凝集素展示表达系统
絮凝素展示表达系统
絮凝素Flo1p 是一种新兴的展示系统,它是酿酒酵母细 胞表面类似凝集素的细胞壁蛋白。 • 目前，已经形成了两种类型的絮凝素展示系统 ： • 一是GPI 系统 ；根据目的蛋白的特性和实验目的确定截去 Flo1p 肽段的长度,然后,目的蛋白的C 端融合到锚定序列 上。 • 二是利用Flo1p 的絮凝结构域的黏附能力创建一个表面展 示系统。
• 其中分别由AGα1、AGa1／AGa2和Flo1表达异源蛋白的 凝集素和絮凝素酵母细胞展示表达系统应用较多。
凝集素展示表达系统
α凝集素和ａ凝集素是酵母细胞壁上的两种甘露糖 蛋白，它们在酿酒酵母的交配型α（ＭＡＴα ）和 交配型ａ（ＭＡＴａ）单倍体细胞之间介导细胞 与细胞的性粘附，使细胞融合形成双倍体 。
二、两种系统
•
酿酒酵母细胞壁主要由外层的甘露糖蛋白和内层的葡
聚糖骨架组成，两者通过共价健相连。外层甘露糖蛋白有
两种类型：
• 一种是通过非共价健与酵母细胞壁松散相连并能被ＳＤＳ 提取出来的低分子量蛋白；
• 一种是必须被葡聚糖酶酶解细胞壁的β-１，3-和β-１，６葡聚糖层后才能被ＳＤＳ抽提的高分子量蛋白，包括凝集 素、絮凝素、Sed1p、Cwp1p、 Cwp 2p和Tip1p、Tir1p 、Srp1p等。后者的结构中大多都含有GPI锚定区域
主要内容
1
概念2两种系统来自3 应用4优缺点
一、概念
酿酒酵母表面展示表达系统： 一种固定化表达异源蛋白质的真核展示系统，
即把异源靶蛋白基因序列与特定的载体基因序列融 合后导入酵母细胞，利用酿酒酵母细胞内蛋白转运 到膜表面的机制（糖基磷脂酰肌醇，GPI锚定）， 使靶蛋白表达并定位于酵母细胞表面，之后用葡聚 糖酶抽提细胞壁目的蛋白。
酵母细胞壁
1前言随着绿色养殖模式的推广，抗生素和化学药物的使用在水产养殖受到越来越多的限制，其引起的病原菌耐药性和养殖水体中微生态环境失衡等问题逐渐成为水产养殖业中日益严峻的问题。
这促使水产科技工作者寻找既能提高水产动物的生产性能并能预防疾病而又不会明显增加生产成本的营养和管理新措施。
此类措施主要针对：1.饲料设计和饲料添加剂；2.药物的使用；3.水环境的控制；4.免疫程序；5.放养密度；6.改良水产动物的遗传品系。
这些措施多数在于要么改变动物胃肠道微生物菌群，要么增强动物的免疫体系。
后者是最受政府和消费市场欢迎的策略。
因此水产饲料配方师和饲料加工厂商开始着重于通过设计饲料配方和加入新型添加剂而增强水产动物的免疫体系。
酵母提取物，尤其是酵母细胞壁就是在这方面具有很大潜力的一种新型添加剂。
酵母是一类单细胞微生物．其结构简单，属于真菌类。
目前已知的酵母菌有370余种。
酵母及酵母饲料用作饲料添加剂始于2O世纪2O年代中期，最早是用作反刍动物的蛋白质补充饲料。
酵母细胞中含有丰富的蛋白质、B族维生素、脂肪、糖、酶等多种营养成分和某些协调因子。
酵母菌具有的众多生理功能，使其在饲料工业中得到了广泛的研究与应用。
酵母细胞壁是一种全新、天然、绿色添加剂，其产品淡黄色，粉末状，无苦味。
它是生产啤酒酵母过程中由可溶性物质提取的一种特殊的副产品，占整个细胞干重的2O％－3O％。
它在维持细胞形态和细胞与细胞间的识别中起重要作用。
近年研究认为，酵母细胞壁含有的甘露寡糖和β－葡聚糖可对细菌、病毒引起的疾病及环境因素引起的应激反应产生非特性免疫力。
2. 酵母细胞壁的成分及其免疫机理2.1 酵母细胞壁的成分酵母细胞壁的结构是一个动态且被调控的结构，其结构和组成可以被严格调控并能对环境变化作出广泛地响应（邵明丽和许梓荣，2002）。
酵母细胞壁主要由葡聚糖、甘露寡糖、糖蛋白和几丁质组成，葡聚糖构成细胞壁的基质，其上覆盖一层甘露寡糖。
它们与细胞壁干重的85％左右。
酶解工艺的好处
酶解工艺的好处酶解工艺的好处酶解是一种生物技术，利用酶的作用将大分子化合物转化为小分子化合物的过程。
在食品、医药、农业等领域中，酶解工艺被广泛应用。
下面将详细介绍酶解工艺的好处。
一、提高产量1.1 食品加工领域在食品加工中，酶解可以提高产量。
例如，在制作豆腐时，加入凝固酶可以促进豆腐凝固，提高豆腐产量。
此外，在制作啤酒时，添加淀粉酶可以将大分子淀粉转化为小分子糖类，提高啤酒产量。
1.2 医药领域在医药领域中，通过对蛋白质的酶解可以得到具有生物活性的多肽或单肽。
例如，在制备降压药“依普利钠”时，需要对血管紧张素进行酶解处理。
二、改善产品质量2.1 食品加工领域在食品加工中，通过对食材进行适当的酶解处理可以改善产品质量。
例如，在制作面包时，加入适量的淀粉酶可以使面包口感更加柔软。
2.2 纤维素酶的应用纤维素是大自然中最常见的有机物之一，广泛存在于植物细胞壁中。
通过对纤维素进行酶解处理，可以得到具有生物活性的多糖或单糖。
这些产物具有广泛的应用前景，如在医药领域中可以用作抗肿瘤药物、抗血栓药物等。
三、提高反应速率3.1 食品加工领域在食品加工中，通过添加酶类催化剂可以提高反应速率。
例如，在制作葡萄酒时，添加葡萄酒酵母可以促进葡萄汁发酵过程。
3.2 医药领域在医药领域中，通过对蛋白质进行酶解处理可以提高反应速率。
例如，在制备“利福平”时，需要对头孢菌素进行酶解处理。
四、降低成本4.1 食品加工领域在食品加工中，通过适当的酶解处理可以降低成本。
例如，在制作豆腐时，加入凝固酶可以降低生产成本。
4.2 医药领域在医药领域中，通过对蛋白质进行酶解处理可以降低成本。
例如，在制备“头孢菌素”时，需要对蛋白质进行酶解处理。
五、节能减排5.1 食品加工领域在食品加工中，通过适当的酶解处理可以节能减排。
例如，在制作啤酒时，添加淀粉酶可以将大分子淀粉转化为小分子糖类，减少了糖化过程中的能耗和废水排放。
5.2 医药领域在医药领域中，通过对蛋白质进行酶解处理可以节能减排。
酿酒酵母表面展示表达系统及应用
。Ｇ Ｐ Ｉ 锚定区域与细胞蛋白的 Ｃ 端共价相 ?
连， 为蛋白与细胞膜提供稳定的连接。Ｇ Ｐ Ｉ 锚定蛋白的 Ｃ 端包含疏水多肽， 当细胞蛋白被合成， 前体蛋白通过 ? 羧基末端的疏水序列锚定在内质网膜上， 其余蛋白则 位于内质网的内腔中。在极短的时间内， 疏水序列在 Ｐ Ｉ 锚置换， 转酰氨基酶作用下 ω位点裂开并同时被 Ｇ 然后蛋白被运输到高尔基体再通过分泌途径分泌至细 胞膜外。在蛋白水解酶作用下， 分泌信号序列被切除， Ｉ Ｐ Ｌ Ｃ从细胞膜上释放以 Ｇ Ｐ Ｉ 锚定形式与 细胞蛋白被 Ｐ ?
２ ］ 葡聚糖共价相连并被转运至细胞壁外 ［ 。可在许多真 ［ ３ ］ 核生物的质膜蛋白中发现 Ｇ Ｐ Ｉ ， 其结构高度保守。酵
生物活性的复杂蛋白。
１ 酵母细胞表面展示表达系统构成
１ ． １ 载 体 一个成功的表达载体应满足 ４个条件： （ １ ） 具有信 号肽序列， 使已经表达的融合蛋白能够被分泌至细胞 外； （ ２ ） 具有较强的定位结构使融合蛋白固定于细胞表 ３ ） 与外源蛋白融合后， 载体蛋白的定 面而不能脱落； （ 位特性和外源蛋白的生物活性不会改变； （ ４ ） 在宿主菌 株中能稳定存在， 不会被细胞壁膜之间和培养基中的
中国生物工程杂志 Ｃ ｈ ｉ ｎ ａＢ ｉ ｏ ｔ ｅ ｃ ｈ ｎ ｏ ｌ ｏ ｇ ｙ ， ２ ０ ０ ８ ， ２ ８ （ １ ２ ） ： １ １ ６～ １ ２ ２
酿酒酵母表面展示表达系统及应用
郭 钦１ 张 伟２ 阮 晖１ 何国庆１ （ １浙江大学生物系统工程与食品科学学院 杭州 ３ １ ０ ０ ２ ９ ２温州医学院 温州 ３ ２ ５ ０ ３ ５ ）
３ 酿酒酵母细胞表面展示表达系统的应用
酵母提取物的分类及工艺,应用领域,水分含量标准,水分测定方法
酵母提取物（yeast extract）是酵母经破壁后将其中蛋白质、核酸、维生素等抽提，再经生物酶解的富含小分子的氨基酸、肽、核苷酸、维生素等天然活性成分的物质。
其中氨基酸含量30%以上，总蛋白50%以上，核苷酸10%以上，主要应用于食品、调味品、化妆品等领域。
一、酵母提取物的分类及工艺1.干食用酵母的生产工艺比较简单，直接将洗净的酵母乳质壁分离后进行滚筒干燥，得到的产品即为干食用酵母。
2.干自溶酵母是酵母质壁分离后先经过部分自溶，然后进行滚筒干燥后得到的产品。
3.酵母抽提物是酵母通过质壁分离后利用自身水解酶系完全自溶后，去除细胞壁和不溶性分子后的产品。
4风味化酵母抽提物,利用美拉德反应生产具有各种风味浓郁的香料，如鸡肉风味、牛肉风味、蔬菜风味、海鲜风味等等.二、酵母提取物的应用领域1.方便面:调料包中添加可以增强鲜味、醇厚感，面身中添加可以提高面饼口感。
2.鸡精：有效提高鸡精中的氨基氮、总氮及呈味核苷酸含量，有效增鲜。
3.食用香精：作为香精基料，提供口感及香气的载体4.肉制品：增强色泽；改善产品肉质原味及醇厚味，5.酱卤制品：增强色泽；强化风味6.餐饮火锅：增强鲜美感及醇厚感、掩盖肉腥味7.焙烤食品：提供风味,改善口感及结构8.膨化食品:平衡各种滋味料的口感；增强醇厚感。
9.酱油:突出产品酱香,协调、平衡滋味，提高产品氨基酸态氮等质量指标。
10.化妆品:添加后起到美白，保湿锁水的作用。
三、酵母提取物水分含量标准GB/T 23530-2009 酵母提取物1.液状：水分≤62%2.膏状：水分≤40%3.粉状：水分≤6%四、酵母提取物水分含量测定方法1.烘干法2.快速水分测定法。
细胞分离与胞内产物的溶解
1
生物分离过程的一般流程
原原料料液液 细细胞胞分分离离(( 离离心心，，过过滤滤))
路线一 细细胞胞－－胞胞内内产产物物
路线二 清液－胞外产物
路线一B 包含体
细胞破碎 碎碎片片分分离离
路线一A
溶解(加加盐盐酸酸胍胍、、脲脲)
粗分离(盐盐析析、、萃萃取取、、超超过过滤滤等等)
复性
纯化( 层层析析、、电电泳泳)
本章内容
脱盐(凝凝胶胶过过滤滤、、超超过过滤滤)
浓缩(超超过过滤滤)
精制( 结结晶晶、、干干燥燥)
2
本节的主要内容
常见的细胞壁结构
细胞破碎技术
包涵体的纯化方法
3
概述
不同类型的细胞分泌目标产物的类型： 动物细胞多分泌到细胞外培养液 植物细胞多为胞内产物 微生物（细菌/酵母/真菌）胞内、胞外
高压匀浆器各种阀型设计
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高压匀浆器的种类
高压匀浆器的种类较多： WAB公司的AVP Gaulin 31MR型 Bran and luebbe 公司SHL40型 意大利Niro Soavi
高压匀浆机
21
高压匀浆法使用时注意事项
高压匀浆器的操作温度上升约２-３℃/10MPa 为了控制温度的升高，可在进口处用干冰调节 温度，使出口温度调节在20℃左右。
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3）超声波破碎
超声波破碎法（Ultrasonication)利用超声波 振荡器发射的15-25kHz的超声波探头处理细胞 悬浮液。
超声波振荡器以可分为槽式和探头直接插入介 质两种型式，一般破碎效果后者比前者好。
超声波的细胞破碎效率与细胞种类、浓度和超 声波的声频、声能有关。
31
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酿 酒 酵 母 载 体 的 种 类 和 构 建
(1). YIp载体－酵母整合型载体
该类载体依靠本身携带的某种酵母基因与酵母染色体上的同
源DNA发生同源重组而整合到染色体上去。这种转化体十分稳定， 但转化率低（１－１０个转化子／微克ＤＮＡ）．由ＣｏｌＥ１ 质粒和酵母提供的基因（亮氨酸lue2）构成．
YCp-Yeast Centrometric plasmid ** 若在YCp 或YRp 中插入一段酵母的端粒结构，该 质粒称之为YLp-Yeast Linear plasmid *** 若将YLp质粒构建成环状分子,该质粒称之为 pYAC载体(Yeast Artificial Chromosome)
载 体 的 整 合
(2). YRp载体－酵母复制型载体
1）酵母染色体复制子（ARS）
酵母染色体总长为15,000 kb,根据电镜观察结果预计有 400个复制起点，根据基因克隆分离ARS的实验结果估计有 480个ARS。
2） YRp７由ｐＢＲ３２２质粒和酵母提供的基因（色氨酸ｔ
ｒｐ１）、复制子（ARS）构成．
(2)利用Li+盐进行转化： 这种方法不需要消化酵母的细胞 壁，产生原生质球，而是将整个细胞暴露在Li+盐(如0.1 mol／L LiCl)中一段时间，再与DNA混合，经过一定处理 后，加40％PEG4000，然后经热应激等步骤，即可获得 转化体。
8.2 用于转化子筛选的标记
大多数是以酵母菌氨基酸或碱基合成途径中的结构 基因作为选择标记，如lue2，trp1， his3和 ura3 。 使用这些遗传标记时，受体菌应是相应标记基因的 突变型，且是稳定的突变体（缺失突变或多点突 变），利用遗传互补进行转化体选择的。
组氨酸his3—咪唑磷酸甘油脱氢酶; 亮氨酸lue2—β-异丙基苹果酸脱氢酶; 赖氨酸lys2—β-氨基已二酸还原酶; 色氨酸trp1—N-邻氨基苯甲酸异构酶; 尿嘧啶ura3—乳清苷-5`-磷酸脱羧酶;
亮氨酸lue2—β-异丙基苹果酸脱氢酶
该酶是把丙酮酸转化成亮氨酸的代谢酶之 一．只要使用亮氨酸lue2突变的营养缺陷型 酵母作受体，载体上带有亮氨酸lue2基因就 能在不含亮氨酸的培养基上实现转化克隆的 筛选（书１７０页图）．
1-YEp13 探针; 2-2μ质粒探针; 3-LEU2探针; 4-pBR322探针
(4). YCp载体－－酵母着丝粒载体(YCp)
第一个着丝粒于1980年分离自第三染色体, 现已从酿酒酵 母菌中分离到多个着丝粒。着丝粒（ＣＥＮ）插入含有ＡＲ
Ｓ的质粒就形成YCp载体。可使质粒在子、母细胞中均匀
分配。
YRp的特点
i. 高频转化（１千－１万个转化子／微克ＤＮＡ）． ii. 转化子不稳定 iii. 子代细胞质粒分散不均匀 iv. 可整合到染色体中去，与YIp整合过程相同
YRp载体示意图
(3). YEp载体---酵母附加体型载体
1) 酵母2μ质粒
2μ 质粒的结构
2）YEp载体
YIp中可插入整个或部分2μ质粒DNA构成YEp。大多数酿酒酵 母菌株中都含有2μ质粒，YEp复制所需的酶可由2μ质粒提供。 YEp具有YRp载体相同的特点，它还可以与2μ质粒发生重组。重 组质粒不稳定，在无选择压力条件下可很快消失。利用此特点可 除去酵母菌株中的天然质粒。
8.1 酵母菌的特征
酵母菌是一群以牙殖或裂殖进行无性繁殖 的单细胞真核微生物。
酵母菌表达外源基因的优势
酵母菌基因组已测序，基因表达调控机理比 较清楚，遗传操作简单。
蛋白翻译后可修饰加工 安全性高 大规模发酵工艺简单，成本低 能将表达产物分泌到培养基中 特别适合于遗传分析
YCp载体结构
(5). YLp载体
真核细胞染色体的末端DNA有独特的性质：能使染色体保持 稳定，能成功地进行DNA复制。这种末端DNA称之为端粒（Ｔ
ＥＬ）。端粒结构与染色体其余部分的结构是不同的。 最先 用于构建YLp的端粒来自四膜虫的核糖体DNA，不同长度的YLp 具有不同的特点
(6). pYAC载体
2. 酵母克隆载体的结构与特点
1) 穿梭载体，YIp除外 2) 有适合两种生物的标记基因 3) 环状或线状DNA
酿酒酵母各种载体的特征
载体类型 存在方式 所需DNA序列 标记基因 转化频率
（菌落/μgDNA）
整合型 整合 与染色体DNA Apr Tcr
酵母菌人工染色体(yeast artificial chromosomYAC载体。 pYAC载体具有以下特点：
1） 双TEL位点； 2） 三个酵母菌遗传标记基因； 3）克隆能力大
pYAC载体的结构
* 若在YRp中插入酿酒酵母着丝粒序列，该种载体
8.3 酵母菌的载体系统
8.3.1 野生型酵母质粒: 2μm环状质粒，存在于酿酒酵母中，是 6318bp大小的野生型2μm长双链环状质粒， 其拷贝数达50-100。其上有复制起点、4个 基因、使质粒在细胞中稳定的STB序列。
8.3.2 酵母菌载体及构建
1.克隆载体的种类 1) 按复制方式划分 i. 自主复制型； ii. 整合型（非自主复制型） Yeast Integration plasmid(YIp) 2)按复制子来源划分 i. 附加体型- yeast episomal plasmid(YEp)，其复制起点来 自于酿酒酵母的天然质粒-2μ质粒 ii. 染色体复制型- Yeast Replicating plasmid(YRp)，其复制起 点来自染色体上的自主复制序列(ARS-autonomous replicating sequence)
酵母菌的选择
选择转化率高的菌株 选择回复突变频率低的菌株
酵母菌的转化
(1)利用酵母的原生质球进行转化 ： 首先，用酶解酵母细 胞壁，产生原生质球，再将原生质球置于DNA、CaCl2和 多聚醇(如聚乙二醇)中，多聚醇可使细胞壁具有穿透性， 并允许DNA进人。然后使原生质球悬浮于琼脂中，并使 其再生新的细胞壁。