细胞冻存的方法与步骤
细胞冻存
细胞冻存操作步骤：
1.用移液器吸走原培养基，加入适量PBS洗2遍；
2.加入适量胰酶，置于培养箱中消化，至细胞变圆变小；
3.待消化到位后加入等量完全培养基终止消化，800rpm离心5min；
4.配制冻存液，待细胞离心后去上清，加入冻存液重悬，转移到冻存管中；
5.将冻存管放入程序降温盒中，-80度过夜，然后转移到液氮中保存。
注意：
1. 密度的问题，ATCC建议的冻存量是10^6~10^7每mL，一瓶T75的细胞总数在1.5x10^7个这样，我一般冻存3~5支一瓶。
密度是复合ATCC的要求的。
2.冻存液常规配比为培养基：血清：DMSO=7:2:1，如果细胞比较珍贵，可以调整为血清：DMSO=9:1；
3.如果没有程序降温盒，可以将冻存细胞依次放于4度0.5h，-20度1.5h，-80过夜，大部分细胞也可以适应，但原代细胞不建议这么处理；
4. 需要长期保存的细胞尽快放到液氮中，最好过夜就放，最长不超过1星期，放的时候留一支，复苏看冻存效果。
-80超过三个月细胞基本就死绝了，除了极少数顽强的细胞。
在液氮液相中细胞无限期稳定。
5.细胞如果是第一次养，建议至少冻存两个批次以上，以尽量避免因为冻存问题导致细胞绝种；。
细胞冻存流程
细胞冻存流程细胞冻存是一种常用的细胞保存方法，通过将细胞在低温条件下冷冻保存，以延长其存活时间和保持其生物学特性。
细胞冻存流程主要包括细胞分离、细胞培养、细胞冻存液制备、细胞冷冻保存和细胞复苏等步骤。
一、细胞分离细胞分离是细胞冻存的第一步，需要将目标细胞从组织样本中分离出来。
常用的方法有机械分离、酶消化和抗体磁珠分离等。
机械分离是通过切割、研磨等手段将组织样本分散成单细胞；酶消化是利用特定的消化酶将组织样本中的细胞间连接物质降解，使细胞分离；抗体磁珠分离是利用特定抗体与目标细胞表面抗原结合，再利用磁珠将目标细胞分离出来。
二、细胞培养细胞分离后，需要将目标细胞进行培养，以保证其在冻存前的正常生长和增殖。
细胞培养需要使用培养基、培养皿和培养箱等设备。
培养基是含有营养物质和生长因子的液体，提供细胞所需的养分；培养皿是用于容纳细胞和培养基的容器；培养箱用于提供适宜的温度、湿度和CO2浓度等环境条件。
细胞培养的时间和条件因细胞类型而异，通常需要进行数代传代，使细胞数量增加到足够的数量。
三、细胞冻存液制备细胞冻存液是冻存细胞时使用的特殊液体，其成分可以保护细胞免受低温和冷冻过程中的损伤。
常用的细胞冻存液成分包括细胞培养基、血清、DMSO（二甲基亚砜）等。
细胞培养基和血清提供细胞所需的养分和生长因子，起到保护细胞的作用；DMSO则具有良好的渗透性，可以减少细胞在冷冻过程中的结晶和损伤。
四、细胞冷冻保存细胞冷冻保存是细胞冻存的核心步骤，需要将细胞与细胞冻存液混合，然后缓慢冷却至低温条件。
混合细胞和细胞冻存液时需要注意细胞密度和液体体积的比例，以保证细胞在冷冻液中的分布均匀。
冷冻过程需要使用特殊的冷却设备，如冷冻容器、冷冻架和冷冻缓冲液等。
细胞冷冻保存的温度通常在-80℃或液氮温度下进行，以确保细胞的长期保存。
五、细胞复苏细胞复苏是将冻存的细胞从低温条件中恢复到正常生长状态的过程。
细胞复苏需要将冻存管或冷冻盒从低温环境中取出，快速解冻，并将细胞转移到预先准备好的培养皿中。
细胞传代、铺板 、冻存、复苏等细胞培养相关操作步骤和注意事项
细胞传代的步骤（贴壁细胞为例）
首先，镜下观察细胞密度，90%以上即可传代培养（为了细胞的稳定，距离上 一次传代至少间隔一天。）。
准备工作：无菌枪头、培养瓶、离心管、废液桶等所需物品，培养基、血清、 PBS、胰酶等试剂类，可根据情况，提前放入生物安全柜，进行紫外灭菌；
细胞传代的步骤（贴壁细胞为例）
培养液量 （ml）
0.1 0.2 0.5 1 2 2 5 10 5 15-30
100%细胞量（105） （约） 1 2.5 5 10 25 20 52 137 50 200
培养板需要加入的细胞量
细胞培养板中加入细胞的数量，需要考虑一下几点： 1. 常规实验的设计：转染siRNA（约30%-50%），转染质粒（约70%-
结合镜下观察，调整浓度。 ❖2. 计数细胞：参考前文中各种规格中100%满时细胞的大概数量，再根据实验的
要求，计算加入的细胞的数量。（使用计数板）
细胞计数板的使用
细胞计数板
0.1ul
干净的盖玻片
细胞计数板的使用
10-20 ul 细胞悬液 注意: 避免有气泡！
数上不数下，数左不数右
计算公式： n/4 x104 （个/ml）
4.其他：轻轻移动他人的细胞，轻轻关闭培养箱的门等
细胞冻存
准备工作：FBS，完全培养基，DMSO，或无血清冻存液，冻存管，冻存盒。 常规的细胞传代步骤，至细胞消化后离心完毕，根据细胞的量以及需要冻存的管
数配制冻存液； 冻存液： 10%DMSO+90%FBS/完全培养基（A），或者无血清冻存液（B）。 冻存程序： A ： 1. 使用冻存盒：可直接放入-80℃冰箱，第二天转移入液氮罐中。
把细胞转移到生物安全柜中，吸去培养基，加入无菌PBS（只要没过即 可），轻轻摇动清洗细胞，尽量弃尽PBS。
细胞冻存和细胞复苏的方法步骤以及细胞的运输
细胞冻存和细胞复苏的方法步骤以及细胞的运输细胞株(系)的使用，为医学研究和测试工作带来了极大的方便。
但细胞的传代是有限制的，长期连续传代的细胞，不仅消耗大量的人力和物力，而且细胞的生长与形态等会有一定退变或转化，因而细胞失去原有的遗传特性，有时还会由于细胞污染而造成传代中断，种子丢失。
因此，在实际工作中常需冻存一定数量的细胞，以备替换使用。
细胞冷冻与复苏是细胞培养室的常规工作和通用技术。
细胞的冻存一、概述目前，细胞冻存最常用的技术是液氮冷冻保存法，主要采用加适量保护剂的缓慢冷冻法冻存细胞。
细胞在不加任何保护剂的情况下直接冷冻，细胞内外的水分会很快形成冰晶，从而引起一系列不良反应。
如细胞脱水使局部电解质浓度增高，pH值改变，部分蛋白质由于上述原因而变性，引起细胞内部空间结构紊乱，溶酶体膜由此遭到损伤而释放出溶酶体酶，使细胞内结构成分造成破坏，线粒体肿胀，功能丢失，并造成能量代谢障碍。
胞膜上的类脂蛋白复合体也易破坏引起细胞膜通透性的改变，使细胞内容物丢失。
如果细胞内冰晶形成较多，随冷冻温度的降低，冰晶体积膨胀造成细胞核DNA空间构型发生不可逆的损伤，而致细胞死亡。
因此，细胞冷冻技术的关键是尽可能地减少细胞内水分，减少细胞内冰晶的形成。
采用甘油或二甲基亚砜作保护剂，这两种物质分子量小，溶解度大，易穿透细胞，可以使冰点下降，提高细胞膜对水的通透性，且对细胞无明显毒性。
慢速冷冻方法又可使细胞内的水分渗出细胞外，减少胞内形成冰结晶的机会，从而减少冰晶对细胞的损伤。
二、主要冷冻设备和材料常用的细胞冷冻贮存器为液氮贮存器，规格有35L3和50L3两种。
使用时要注意以下几点：（1）一般两周需充液氮一次，至少一个月充氮一次。
液氮温度达-19 6℃，使用时注意勿让液氮溅到皮肤上，以免引起冻伤。
（2）液氮容器为双层结构，中间为真空层，瓶口有双层焊接处，应防止焊接部裂开。
（3）在装入液氮时，要注意缓慢小心，并用厚纸卷筒或特制漏斗作引导，使液氮直达瓶底，如有专用液氮灌注装置则更好。
细胞梯度冻存方法
细胞梯度冻存方法细胞梯度冻存方法是一种常用的细胞冻存方法，它可以有效地保护细胞的完整性和生物活性，使得细胞可以长期保存并在需要时重新使用。
本文将详细介绍细胞梯度冻存方法的原理、步骤和注意事项。
一、原理细胞梯度冻存方法是一种将细胞在不同浓度的冻存液中逐渐降温冻存的方法。
这种方法可以使细胞在冻结过程中逐渐适应低温环境，减少细胞受到冻结损伤的可能性。
同时，不同浓度的冻存液可以提供不同程度的保护作用，从而保证细胞的完整性和生物活性。
二、步骤1. 细胞培养首先需要将要冻存的细胞进行培养，使其处于生长状态。
在培养过程中，需要注意细胞的密度和培养液的成分，以保证细胞的健康和生长。
2. 制备冻存液制备冻存液是细胞梯度冻存方法的关键步骤。
一般来说，冻存液的浓度应该逐渐增加，以提供逐渐增强的保护作用。
常用的冻存液包括10% DMSO、20% FBS、30% FBS等。
在制备冻存液时，需要注意冻存液的pH值和渗透压，以保证细胞的完整性。
3. 冻存将细胞分装到不同浓度的冻存液中，然后逐渐降温冻存。
一般来说，可以将细胞在室温下静置30分钟，然后将细胞放入-80℃的冰箱中冻存。
在冻存过程中，需要注意细胞的密度和冻存液的浓度，以保证细胞的完整性和生物活性。
4. 保存将冻存管标记好，然后放入液氮罐中保存。
在保存过程中，需要注意液氮罐的温度和液位，以保证细胞的长期保存。
三、注意事项1. 细胞的密度和培养液的成分对细胞的健康和生长有重要影响，需要注意调整。
2. 制备冻存液时，需要注意冻存液的pH值和渗透压，以保证细胞的完整性。
3. 冻存过程中需要逐渐降温，以减少细胞受到冻结损伤的可能性。
4. 在保存过程中，需要注意液氮罐的温度和液位，以保证细胞的长期保存。
细胞梯度冻存方法是一种常用的细胞冻存方法，它可以有效地保护细胞的完整性和生物活性，使得细胞可以长期保存并在需要时重新使用。
在使用这种方法时，需要注意细胞的密度和培养液的成分、制备冻存液的pH值和渗透压、冻存过程中的降温速度以及保存过程中液氮罐的温度和液位等因素，以保证细胞的健康和长期保存。
细胞冻存操作步骤
细胞冻存操作步骤
一、实验原理
细胞冻存是将细胞摄取入液体氮中，将温度降至-196℃使细胞凝固，抑制其体外反应而获得的一种实验技术。
通常细胞冷冻会用到药物，这样可以在降低温度时减少细胞损伤，并且能使细胞活力保持更长的时间。
这种方法的优势在于，当细胞再次受激时，他们会恢复其活性，因此这是可行的细胞保存方法。
二、必要的物品
1.细胞培养室：多孔培养板，细胞培养液，细胞接种液，营养物质，pH调节剂，拉曼光谱
2.低温冷冻室：冰箱，液氮储存器，液氮更换器，液氮锅
3.彻底冻存：冰浆，冻存管，硅胶垫，冰箱
4.实验室用品：滤纸，棉签，试管，去离子水，消毒消毒剂
1.操作前准备：
（1）确保冰箱和液氮储存器温度处于-196℃，并且安放在细胞培养室内；
（2）准备液氮储存器用的液氮，壶内放入10%药物混合液；
（3）准备液氮锅，放入冰浆以及用于完成冻存的各种容器；
（4）检查实验室所有必需的实验室用品，并且充分准备工作台的工作环境；
2.细胞冻存：
（1）将细胞用10%的药物混合液，并且用滤纸过滤后以試管装载；。
细胞冻存实验步骤
7. 在 冻 存 管 上 标 明 细 胞 的 名 称 ，冻 存 时 间 及 操 作 者 ；
8. 冻 存 ：标 准 的 冻 存 程 序 为 降 温 速 率 -1～ -2℃ / min； 当 温 度 达 -25℃ 以 下 时 ，可 增 至 -5℃ ～ -10℃ /min；到 -100℃ 时 ，则 可 迅 速 浸 入 液 氮 中 。也 可 将 装 有 细 胞 的 冻 存 管 放 入 -20℃ 冰 箱 2h ，然 后 放 入 -70℃ 冰 箱 中 过 夜，取出冻存管，移入液氮容器内。
细胞冻存实验步骤
1. 配 制 含 10%DMSO 或 甘 油 、10～ 20%小 牛 PBS 清 洗。
3. 去除 PBS，加入适量胰蛋白酶（覆盖培养皿表面） 把单层生长的细胞消化下来；
4. 离心 1000rpm，5min；
5. 去除胰蛋白酶，加入适量配制好的冻存培养液， 用 吸 管 轻 轻 吹 打 使 细 胞 均 匀 ，计 数 ，调 节 冻 存 液 中 细 胞的最终密度为 5×106/ml～1×107/ml；
细胞梯度冻存方法
细胞梯度冻存方法一、简介细胞梯度冻存法是一种常用的细胞冻存方法，它通过在细胞中添加梯度剂来保护细胞膜和细胞内部结构，使得细胞能够在极低温下存活。
本文将为您详细介绍如何使用这种方法来冻存您的细胞。
二、准备工作1. 组建实验室团队：在进行任何实验之前，您需要组建一个实验室团队。
这个团队应该包括至少一名有经验的主管和一些技术人员。
2. 购买试剂：您需要购买适用于您的实验的梯度剂和其他试剂，例如培养基和冻存液。
请务必确保这些试剂已经过质量检测，并且符合您的要求。
3. 准备培养皿：您需要准备好足够数量的培养皿，并确保它们是无菌的。
此外，还需要准备好移液器、离心机等实验仪器。
三、制备梯度液1. 选择合适的梯度剂：根据您所研究的细胞类型选择合适的梯度剂。
例如，对于哺乳动物细胞，可以使用DMSO或甘油等梯度剂。
2. 制备梯度液：将梯度剂加入培养基中，制成不同浓度的梯度液。
例如，您可以制备一个10%到90%的甘油梯度液。
四、细胞处理1. 收集细胞：将您需要冻存的细胞用PBS洗涤一次，并使用离心机将其收集起来。
2. 重悬细胞：使用培养基将细胞重悬，在此过程中应该避免过多地破坏细胞膜和结构。
3. 加入梯度液：将不同浓度的梯度液加入到重悬后的细胞中。
通常情况下，您应该从低浓度开始添加，并逐渐增加浓度，以避免对细胞造成伤害。
4. 离心：使用离心机对混合后的样品进行离心分层，通常情况下会形成两个相分离的层。
上层是含有较少浓度的梯度剂和较轻的细胞组分，下层是含有较高浓度的梯度剂和较重的细胞组分。
5. 收集细胞：使用移液器将上层的细胞收集起来，并用PBS洗涤一次。
五、冻存操作1. 加入冻存液：将您选择的冻存液加入到收集后的细胞中。
通常情况下，您可以使用含有10% DMSO或甘油的培养基作为冻存液。
2. 分装：将处理后的细胞分装到标有样品编号和日期的小管中。
3. 冷却：将小管放入-80℃或更低温度下进行快速冷却。
通常情况下，您可以使用干冰或液氮来实现这一步骤。
细胞传代铺板冻存复苏等细胞培养相关操作步骤和注意事项
细胞传代铺板冻存复苏等细胞培养相关操作步骤和注意事项细胞传代：细胞传代是指将已经培养得到的细胞进行继代，以维持细胞的健康生长和增殖。
具体步骤如下：1.预备培养基和消化液：准备需要的培养基和细胞消化液，将培养基预暖在37摄氏度保温箱中。
2.消化细胞：将已经生长到80-90%的细胞培养皿放到细胞消化液中消化，消化时间根据细胞的种类和生长状态而定。
消化完成后，在显微镜下观察，确保细胞基本脱落。
3.细胞计数与离心：将细胞消化液转移到离心管，进行细胞计数。
根据所需细胞数量计算所需消化液的体积，并用预暖的培养基配置所需的细胞悬液。
离心细胞消化液以去除细胞消化的消化液。
4.铺板：将计算好的细胞悬液转移到铺板中，轻轻摇晃铺板使细胞均匀分布。
放置在培养箱中，培养条件根据细胞类型而定。
注意事项：-消化时间不宜过长，否则细胞会受到过度损伤。
-细胞计数时要使用显微镜和相关计数仪器，确保准确性。
-铺板时要轻轻摇晃铺板以均匀分布细胞，避免气泡产生。
冻存：冻存是将细胞保存在低温条件下，以备日后使用。
具体步骤如下：1.细胞准备：选择处于对称生长期的细胞进行冻存。
对细胞进行消化并离心，将细胞沉淀取出至干燥的离心管。
2.冻存液准备：根据细胞的特性和保存要求选择合适的冻存液，如含有二甲基亚砜（DMSO）和甘油的培养基。
将冻存液预暖。
3.冻存管装填：将已洗净的冻存管放入液氮中预冷，稍微干燥后将细胞沉淀均匀加入冻存管中。
用塑料冻存盖或冷却后的金属冻存夹紧。
4.冷冻：将装有细胞的冻存管放入-80摄氏度的深冷冰箱中，预冻24小时到48小时。
等冷冻固化后将管子迁移到液氮冷冻罐中。
注意事项：-使用合适的冻存液，避免对细胞造成过度伤害。
-在严格消毒和无菌条件下进行冻存操作。
-细胞冷冻时，必须迅速并且均匀降温，以避免冷冻诱导的细胞损伤。
复苏：复苏是指冻存的细胞被解冻、恢复生长和增殖的过程。
具体步骤如下：1.细胞解冻：将冻存的细胞管迅速取出，直接放入37摄氏度的水浴中，轻轻摇动直至融化。
细胞冻存操作
细胞冻存操作
细胞冻存是一种常用的细胞保存方法，可避免细胞长时间存放后出现的变异和污染，同时也方便细胞的长期保存和分享。
以下是细胞冻存的操作步骤：
1. 增殖期的细胞：将增殖期的细胞用PBS（磷酸盐缓冲液）洗涤，去除培养基和残留物质。
2. 用离心机离心：离心细胞，去除PBS，避免细胞形成团。
3. 加入冻存液：将适当的冻存液加入离心后的细胞中，用低速旋转混合均匀。
4. 分装：将混合后的细胞分成小分装管中，每一管中的细胞数量不宜过多，以免影响后续解冻操作。
5. 冷冻：将分装好的细胞置于-80℃冷冻箱中冷冻，直至完全冻结。
6. 保存：将冰冻的细胞存放于液氮罐中长期保存。
7. 解冻：需要使用细胞时，将细胞从液氮罐中取出，加入预先准备好的解冻液中缓慢解冻，避免细胞受到冰冻损伤。
细胞冻存操作需要注意以下几点：
1. 冻存液的配制和选用应根据不同种类的细胞进行调整。
2. 细胞的分装数量不宜太多，以免影响后续解冻操作。
3. 冷冻箱和液氮罐的温度应保持稳定，避免细胞受到温度变化的影响。
4. 解冻液的配制和选用应根据不同种类的细胞进行调整，以确
保细胞被尽可能少地破坏。
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细胞冻存、解冻方法与细胞计数
江苏大学附属医院风湿科李晶〖返回主页〗
一、细胞冷冻保存
１、材料:
生长良好之培养细胞、新鲜培养基、DMSＯ(Ｓigma Ｄ—２６50)、无菌塑料冷冻保存管(Nalｇｅne 5０００-002０)、０.4%(ｗ/v)tｒypan blｕe(GibｃｏＢＲＬ15250-061)、血球计数盘与盖玻片、等速降温机(KＲYO10SeriesII)
2、冷冻保存方法:
(1)传统方法: 冷存管置于４℃1０分钟---〉-２0℃30分钟-－—＞-８0℃16～18小时(或隔夜)--->液氮槽vaｐｏrpｈａｓｅ长期储存。
—２0℃不可超过１小时,以防止胞内冰晶过大,造成细胞大量死亡,亦可跳过此步骤直接放入-8０℃冰箱中,惟存活率稍微降低一些。
(2)程序降温:利用已设定程序得等速降温机以－1~—3℃／分钟之速度由室温降至(-8０℃以下)－120℃,再放在液氮槽vapoｒphase长期储存。
适用于悬浮型细胞与hyｂrｉdｏmａ之保存。
3、步骤:
(1)冷冻前２4—4８小时更换半量或全量培养基,使细胞处于指数生长期。
(2)配制冷冻保存溶液(使用前配制):另取一离心管,加入培养基、血清,逐滴加入二甲基亚砜(DＭSO)至２０％浓度,即制成双倍得冻存液,置于室温下待用、
(３)离心收集培养之细胞,用加血清得培养基重悬起细胞,取少量细胞悬浮液(约0、1ml)计数细胞浓度及冻前存活率。
(4)取与细胞悬液等量得冻存液,缓慢逐滴加入细胞悬液,并晃动试管,制成细胞冻存悬液(DMSO最后浓度为５～1０％),使细胞浓度为１～5×1０6ｃells/ml,混合均匀,分装于已标示完全之冷冻保存管中,1～2ml／vial,并取少量细胞悬浮液作污染检测。
严密封口后,注明细胞名称、代数、日期。
然后进行冻存、
4、注意事项:
(1)欲冷冻保存之细胞应在生长良好(logphａｓｅ)且存活率高之状态,约为80～90％致密度。
冷冻前检测细胞就是否仍保有其特有性质,例如ｈybｒidｏｍa应在冷冻保存前一至二日测试就是否有抗体之产生。
(2)细胞在液氮中可长期冻存无限时间,而不会影响细胞活力;在—７0度可保存数月。
(3)注意冷冻保护剂之品质。
DMSO应为试剂级等级,无菌且无色(以0。
22mｉcroｎＦＧLP Telｆlon过滤或就是直接购买无菌产品,如Sigma D—2650),以5～1０ml小体积分装,4℃避光保存,勿作多次解冻。
Glycｅrol亦应为试剂级等级,以高压蒸汽灭菌后避光保存。
在开启后一年内使用,因长期储存后对细胞会有毒性、本方法中先制备双倍冻存液,可避免DMSO直接加入时释放得热量对细胞得损伤。
缓慢逐滴加入细胞悬液就是使细胞逐步适应高渗,可降低细胞受损、DMSO可能引起部分白血病细胞株得分化,可换用10％甘油冻存。
(4)冷冻保存之细胞浓度:
①ｎoｒmaｌhuman fiｂrｏｂlａst:１～3×106cells/ml
②ｈｙbridｏｍa:1～3×106cells／ml,细胞浓度不要太高,某些hｙｂｒidｏma会因冷冻浓度太高而在解冻24小时后死去。
③aｄhereｎt tuｍor ｌinｅs:5～7×10６,依细胞种类而异、Adenｏcaｒcｉｎomａ解冻后须较高之浓度,而ＨｅＬa只需1～3×106ceｌｌs／ml
④othｅr susｐenｓｉons:5～1０×106celｌs/mｌ,ｈｕmａn lｙｍphocyｔe须至少5×106celｌs／ｍl。
(５)冷冻保护剂浓度为5或10％DMＳO,若就是不确定细胞之冷冻条件,在做冷冻保存之同时,亦应作一个backｕｐｃuｌｔure,以防止冷冻失败。
(6)冻存可用10%～90%得血清,一般高浓度血清有助于维护细胞活力,此处介绍20%终浓度有利于细胞悬浮而少沉积(4度时),复苏存活率在80％~90％以上,对原代培养细胞,以90％血清冻存更为有效、
二、冷冻细胞活化
1、冷冻细胞之活化原则为快速解冻,以避免冰晶重新结晶而对细胞造成伤害,导致细胞之死亡。
２、细胞活化后,约需数日,或继代一至二代,其细胞生长或特性表现才会恢复正常(例如产生单株抗体或就是其它蛋白质)、
３、材料
37℃恒温水槽、新鲜培养基、无菌吸管/离心管/培养瓶、液氮或干冰容器
4、步骤:
(1)操作人员应戴防护面罩及手套,防止冷冻管可能爆裂之伤害。
(２)自液氮或干冰容器中取出冷冻管,检查盖子就是否旋紧,由于热胀冷缩过程,此时盖子易松掉、
(3)将新鲜培养基置于37℃水槽中回温,回温后喷以７0％酒精并擦拭之,移入无菌操作台内。
(4)取出冷冻管,立即放入37℃水槽中快速解冻,轻摇冷冻管使其在１分钟内全部融化,以７0％酒精擦拭保存管
外部,移入无菌操作台内、
(5)取出解冻之细胞悬浮液,缓缓加入有培养基之培养容器内(稀释比例为1:10~1:1５),混合均匀,放入CO２培养箱培养。
取０.１ｍl解冻细胞悬浮液作存活测试。
(6)解冻后就是否立即去除冷冻保护剂(例如DMＳO或ｇlyｃｅｒｏl),依细胞种类而异,一般而言,大都不需要立即去除冷冻保护剂。
惟若要立即去除,则将解冻之细胞悬浮液加入含有5-１０ml培养基之离心管内,离心1００0rpm,５分钟,移去上清液,加入新鲜培养基,混合均匀,放入ＣＯ2培养箱培养。
(7)若不需立即去除冷冻保存剂,则在解冻培养后隔日更换培养基。
三、细胞计数与存活测试
1、原理:
(1)计算细胞数目可用血球计数盘或就是Coｕltercounter粒子计数器自动计数、
(2)血球计数盘一般有二个ｃｈａmｂers,每个chamｂｅｒ中细刻9个1ｍm２大正方形,其中4个角落之正方形再细刻１6个小格,深度均为0.1mm。
当chaｍber上方盖上盖玻片后,每个大正方形之体积为1ｍｍ2×0．1ｍm=1、0x10—4ml。
使用时,计数每个大正方形内之细胞数目,乘以稀释倍数,再乘以104,即为每ｍl中之细胞数目。
(3)存活测试之步骤为dyeｅｘclusion,利用染料会渗入死细胞中而呈色,而活细胞因细胞膜完整,染料无法渗入而不会呈色、一般使用蓝色之ｔrypan ｂlue染料,如果细胞不易吸收trypan ｂlｕｅ,则用红色之Eｒythrosiｎ b ｌuish。
计算细胞活率:活细胞数/(活细胞数＋死细胞数)×10０%。
计数应在台盼兰染色后数分钟内完成,随时间延长,部分活细胞也开始摄取染料;因为台盼兰对蛋白质有很强得亲与力,用不含血清得稀释液,可以使染色计数更为准确。
2、材料:
0.4%ｗ／ｖｔrypan bｌuｅ(GiｂcoＢRL15２50—061);Erytｈosｉn bluish ｓtain;取0、1ｇｒam Ｅryｔｈrosiｎ bｌｕish(ＳｉgmaＥ—92５9)及０、05ｇram prｅseｒvatiｖe meｔhyl ｐaraｂeｎ(SigmａH-3647)溶于10０mlCａ++/Mg＋＋freesaｌine;血球计数盘及盖玻片(Hｅｍocyｔomeｔｅrａndcoｖｅrｓｌiｐ);计数器(couｎter);低倍倒立显微镜;粒子计数器(Cｏｕｌtｅrｃounter,ＣoulterEleｃｔroｎiｃs)。
白细胞稀释液(4％乙酸溶液)。
3、步骤:
(1)取50μl细胞悬浮液与50μl trypan blｕe(orErｙthｒosinｂluish)等体积混合均匀于１、5ｍｌ小离心管中。
(2)取少许混合液(约15μl)自血球计数盘cｈamber上方凹槽加入,盖上盖玻片,于10０倍倒立显微镜下观察,活细胞不染色,死细胞则为蓝色(或红色—Erｙthrosin ｂlｕiｓh)、
(3)计数四个大方格之细胞总数,再除4,乘以稀释倍数(至少乘以２,因与tｒyｐanbluｅ等体积混合),最后乘以104,即为每ml中细胞悬浮液之细胞数。
若细胞位于线上,只计上线与右线之细胞(或计下线与左线之细胞)、
注:4大格细胞总数×稀释倍数×１０４/4=细胞数/mｌ;每一大格得体积＝0.1cm×0.1ｃm×0．01ｃm＝10－４ml
计数板计数时,最适浓度为５～１0×105细胞/ｍl,此范围外计数误差偏大。
高浓度细胞悬液,可取出部分作稀释或连续稀释后计数、
5、范例:
T75 mｏnｏlayｅr ｃulｔure制成１0ｍl细胞悬浮液,取０。
1ml溶液与０、1ml trypan blｕｅ混合均匀于试管中,取少许混合液加入血球计数盘,计数四大方格内之细胞数目。
活细胞数/方格:55,６2,4９,59;死细胞数／方格:5,3,4,6;细胞总数=2４３
平均细胞数/方格=60。
７5;稀释倍数=2;
细胞数/ｍl:６0.75×1０４×2(稀释倍数)=1、２2×106;
细胞数／flask(１0ｍｌ):1.22×１06×１０ml=1２。
2×１06
存活率:225/2４3﹦9２、6%。