H2O2 诱发人成纤维细胞衰老样变化的基因表达谱3
美洲大蠊小肽预处理对H2O2诱导人卵巢颗粒细胞氧化应激及凋亡的抑制作用
山东医药2023 年第 63 卷第 35 期美洲大蠊小肽预处理对H 2O 2诱导人卵巢颗粒细胞氧化应激及凋亡的抑制作用孙蕊仙1，2，唐运萍1，2，杨礼莲1，2，伏蓉2，王婧羽1，2，隋世燕1，21 大理大学 云南省昆虫生物医药研发重点实验室，云南大理671000；2 大理大学公共卫生学院摘要：目的 探讨不同浓度美洲大蠊小肽预处理对H 2O 2诱导人卵巢颗粒细胞（KGN 细胞）氧化应激及凋亡的影响。
方法 取对数生长期的KGN 细胞，分为空白组、H 2O 2组和美洲大蠊小肽50、100、150组。
各组均常规培养24 h ，空白组不予特殊处理，H 2O 2组加入250 µmol /L H 2O 2作用6 h ；美洲大蠊小肽50、100、150组分别加入50、100、150 µg /mL 美洲大蠊小肽进行预处理，然后加入250 µmol /L H 2O 2作用6 h 。
采用CCK -8法检测空白组、H 2O 2组和美洲大蠊小肽50、100、150组分别预处理6、12、24 h 的细胞存活率，并比较各组（美洲大蠊小肽50、100、150组均预处理12 h ）细胞活性氧（ROS ）、一氧化氮（NO ）、丙二醛（MDA ）表达。
结果 H 2O 2组细胞存活率低于空白组（P <0.05）。
预处理6 h 的美洲大蠊小肽50、100、150组细胞存活率与H 2O 2组比较差异均无统计学意义（P 均>0.05），预处理12、24 h 的美洲大蠊小肽50、100、150组细胞存活率均高于H 2O 2组（P 均<0.05）。
与预处理6 h 比较，美洲大蠊小肽50、100、150组预处理12、24 h 的细胞存活率均升高（P 均<0.05）；预处理12、24 h 的美洲大蠊小肽50、100、150组细胞存活率比较差异均无统计学意义（P 均>0.05）。
与空白组比较，H 2O 2组细胞MDA 、NO 、ROS 表达均升高（P 均<0.05）；与H 2O 2组比较，美洲大蠊小肽50、100、150组细胞MDA 、NO 、ROS 表达均降低（P 均<0.05），美洲大蠊小肽50、100、150组间比较差异均无统计学意义（P 均>0.05）。
过氧化氢诱导小鼠骨髓间充质干细胞衰老细胞模型的建立
[收稿日期]㊀2021-01-16[修回日期]㊀2021-02-09[基金项目]㊀国家自然科学基金(81601951,81802160)[作者简介]㊀徐飞,博士,副主任医师,研究方向为创伤骨科疾病的诊治,E-mail 为184413361@㊂通信作者杨卿,博士,副主任医师,研究方向为关节骨科疾病的诊治,E-mail 为yangmd@㊂DOI :10.15972/ki.43-1509/r.2021.02.002㊃骨科专栏㊃过氧化氢诱导小鼠骨髓间充质干细胞衰老细胞模型的建立徐飞,郑泽航,徐汉青,杨卿(华中科技大学同济医学院附属同济医院骨科,湖北省武汉市430030)[关键词]㊀过氧化氢;㊀骨髓间充质干细胞;㊀衰老;㊀小鼠[摘㊀要]㊀目的㊀建立一种可有效㊁快速获得的小鼠骨髓间充质干细胞(BMSC )衰老细胞模型,为研究衰老BMSC 的生物学特性及功能作准备㊂方法㊀造模组采用200μmol /L 过氧化氢(H 2O 2)处理分离培养的第三代小鼠BMSC2h ,对照组加入等量PBS 处理,两组细胞继续培养72h ㊂MTT 法绘制细胞生长曲线,行SA-β-gal 染色和端粒功能失调诱导病灶(TIF )分析,提取细胞RNA ,Real-time PCR 检测衰老相关基因p16㊁p21㊁p53的表达㊂结果㊀与对照组比较,H 2O 2处理后的小鼠BMSC 生长缓慢(P <0.05),SA-β-gal 染色阳性率较高(P <0.05),TIF 阳性细胞较多(P <0.05),且Real-time PCR 显示,造模组p16㊁p21㊁p53基因表达较高(P <0.05)㊂结论㊀通过H 2O 2处理可以快速且有效地建立BMSC 的衰老细胞模型㊂[中图分类号]㊀R96[文献标识码]㊀AEstablishment of the senescence mouse bone mesenchymal stem cell model induced by hydrogen peroxideXU Fei,ZHENG Zehang,XU Hanqing,YANG Qing (Department of Orthopaedics ,Tongji Hospital ,Tongji Medical College ,Huazhong University of Science and Technology ,Wuhan ,Hubei 430030,China )[KEY WORDS ]㊀hydrogen peroxide;㊀bone mesenchymal stem cell;㊀senescence;㊀mouse[ABSTRACT ]㊀㊀Aim ㊀To establish an effective and rapid aging cell model of mouse bone marrow mesenchymal stem cell (BMSC)and prepare for the study of biological characteristics and function of BMSC.㊀㊀Methods ㊀BMSCs of the third generation mice were treated with 200μmol /L H 2O 2for 2h in the model group,and the same amount of PBS was added to the control group.㊀The cell of the two groups were cultured for 72h.㊀MTT method was used to draw the cell growth curve,SA-β-gal staining was used to analyze telomere dysfunction induced foci (TIF),RNA was extracted,and the expres-sions of p16,p21and p53were detected by real-time PCR.㊀㊀Results ㊀Compared with the control group,the growth of BMSC in H 2O 2treated mice was slow (P <0.05),the positive rate of SA-β-gal staining was higher (P <0.05),the number of TIF positive cell was more (P <0.05),and the expression of p16,p21,p53related genes in the model group was higher (P <0.05).㊀㊀Conclusion ㊀Aging cell model of BMSC can be established quickly and effectively by H 2O 2treatment.㊀㊀随着中国老龄化社会的进展,衰老相关性研究逐渐成为热点㊂人体骨骼也会随着年龄的增长而发生衰老,其中骨髓间充质干细胞(bone marrow stem cell,BMSC)的衰老对骨骼系统的衰老起着至关重要的作用㊂研究衰老BMSC 的特性及生物学功能需要大量的衰老细胞,而衰老细胞的增殖能力较差,无法通过传统的传代培养方法来快速获取足量的细胞㊂现阶段获取衰老BMSC 的方法主要有以下几种:①直接从衰老个体的骨髓中分离提取衰老的间充质干细胞,但高龄小鼠比较难获得,且分离提取的细胞量较少,难以进行细胞扩增;②分离培养正常的BMSC,经过体外培养与传代处理获得自然衰老的BMSC,但此过程时间较长,通常需要多次传代培养[1];③通过化学与射线照射等方法造成细胞DNA 损伤,获得衰老的BMSC 模型[2]㊂为了建立一种快速㊁有效且稳定的获得小鼠衰老BMSC的方法,本文根据相关文献及前期预实验[3-5],采用200μmol/L过氧化氢(H2O2)处理正常的小鼠BMSC2h[5],处理完毕后,检测相关衰老指标来确认所获得的细胞为衰老的BMSC,以期建立一种快速有效且稳定的衰老BMSC模型㊂1㊀材料和方法1.1㊀小鼠骨髓间充质干细胞的分离、培养及鉴定取3周龄C57BL/6小鼠(华中科技大学实验动物中心提供),收集其双侧股骨与胫骨,取髓腔内细胞全骨髓培养法进行培养,获得BMSC,具体分离培养及鉴定方法参考文献[6]㊂1.2㊀H2O2诱导衰老骨髓间充质干细胞模型取所分离的第3代小鼠BMSC,以1ˑ104个/cm2细胞接种于25mL培养皿中,培养皿中含5mL完全培养基[α-MEM(Hyclone公司,美国),10%胎牛血清(Gibico公司,美国),1%抗生素]㊂对照组加入1μL PBS(Hyclone公司,美国);造模组加入1μL H2O2(Sigma公司,美国),其终浓度为200μmol/L,两组细胞均处理2h,处理结束后更换为完全培养基继续培养72h㊂1.3㊀骨髓间充质干细胞生长曲线的绘制将两组细胞以1ˑ104个/cm2接种于96孔板,每孔150μL,每天同一时间点取出96孔板,每孔加入20μL MTT(5g/L)(Invitrogen公司,美国),培养4h后,去上清加入DMSO测定各孔光密度(490 nm),共测定7天,以此绘制时间光密度BMSC生长曲线㊂1.4㊀SA-β-gal染色将两组细胞以1ˑ104个/cm2接种于48孔板,细胞完全贴壁后,进行衰老表型β-半乳糖苷酶(se-nescence associatedβ-galactosidase,SA-β-gal)染色(Solarbio公司,中国),衰老的BMSC于镜下呈蓝色㊂SA-β-gal阳性细胞的计算:每组镜下随机视野计数100个细胞,统计出SA-β-gal阳性细胞个数,并计算百分比㊂1.5㊀端粒功能失调诱导病灶分析将两组细胞以1ˑ104个/cm2接种于12孔板(Corning公司,美国),每孔里放置圆形载玻片,让细胞贴于载玻片上生长,细胞贴壁后,进行端粒功能失调诱导病灶(telomere dysfunction-induced foci, TIF)分析㊂简要操作如下:4%多聚甲醛(Sigma公司,美国)室温固定后,加入1%Triton-X100(Sigma 公司,美国)通透细胞;10%BSA(Abcam公司,美国)封闭后加一抗53BP1(Abcam公司,美国)和γH2AX(Abcam公司,美国)双染;荧光二抗(Abcam 公司,美国)染色后,DAPI(Invitrogen公司,美国)染核㊂封片,然后共聚焦显微镜(Cell insight CX5, Thermo Fisher,美国)下观察并拍照㊂TIF阳性细胞的计算:以53BP1和γH2AX共定位的点代表TIF,每组计数50个细胞,每个细胞存在53BP1和γH2AX共定位的点(显示为黄色点)即认为是TIF 阳性细胞,统计两组阳性细胞百分比㊂1.6㊀RNA提取与基因表达分析将两组细胞分别取1ˑ106个进行RNA提取操作,具体如下:每组细胞加入0.5mL TRIZOL(In-vitrogen公司,美国)进行充分裂解后,加入0.1mL 三氯甲烷,孵育完成后进行离心,细胞RNA位于上清中,吸取上清液,加入等量异丙醇,进行离心操作,RNA位于EP管的底部,吸去上清后以75%乙醇洗涤,并调整两组总RNA至同一浓度㊂将所提取的RNA反转录为cDNA㊂Real-time PCR分析两组细胞衰老相关基因p16㊁p21㊁p53的表达情况㊂所用引物序列见表1㊂1.7㊀统计学方法应用SPSS20.1软件进行统计学分析㊂计量资料用xʃs表示,两组间比较采用t检验,多组间比较采用单因素方差分析㊂P<0.05为差异具有统计学意义㊂表1㊀Real-time PCR引物序列基因上游引物下游引物18S5ᶄ-TTCGAACGTCTGCCCTATCAA-3ᶄ5ᶄ-ATGGTAGGCACGGGGACTA-3ᶄp165ᶄ-CGCAGGTTCTTGGTCACTGT-3ᶄ5ᶄ-TGTTCACGAAAGCCAGAGCG-3ᶄp215ᶄ-CCTGGTGATGTCCGACCTG-3ᶄ5ᶄ-CCATGAGCGCATCGCAATC-3ᶄp535ᶄ-CTCTCCCCCGCAAAAGAAAAA-3ᶄ5ᶄ-CGGAACATCTCGAAGCGTTTA-3ᶄ2㊀结㊀果2.1㊀两组BMSC 生长情况的比较细胞生长曲线如图1所示,造模组BMSC 生长明显较对照组缓慢(P <0.05)㊂2.2㊀两组BMSC SA-β-gal 阳性细胞的比较造模组BMSC 的SA-β-gal 酶活性增强,SA-β-gal 阳性细胞(染色呈蓝色)较对照组多(图2A)㊂造模组SA-β-gal 阳性细胞比例明显高于对照组(P <0.05;图2B)㊂图1㊀两组BMSC 生长情况的比较a 为P <0.05,与对照组比较㊂图2㊀两组BMSC SA-β-gal 阳性细胞的比较A 为SA-β-gal 染色结果(200ˑ),蓝色为SA-β-gal 阳性细胞;B 为SA-β-gal 阳性细胞直方图㊂2.3㊀两组BMSC TIF 阳性细胞的比较造模组BMSC TIF 阳性细胞较对照组多,差异具有统计学意义(P <0.05;图3)㊂2.4㊀两组BMSC p16㊁p21和p53基因表达的比较与对照组比较,造模组p16㊁p21和p53表达均明显增加(P <0.01,P <0.05;图4)㊂图3㊀两组BMSC TIF 阳性细胞的比较A 为TIF 染色结果(200ˑ),造模组BMSC 存在53BP1/γH2AX 共定位点的阳性细胞(白色箭头所示);B 为BMSC TIF 阳性细胞直方图㊂图4㊀两组BMSC p16㊁p21和p53基因表达的比较3㊀讨㊀论细胞与机体的衰老是生命的基本现象㊂通过体内或体外的反复细胞分裂,获得衰老细胞的方式耗时耗力且量少㊂本研究通过H2O2的诱导处理,正常的BMSC发生DNA损伤,导致细胞衰老[7]㊂衰老的细胞表现出细胞生长缓慢,SA-β-gal染色阳性,端粒功能障碍诱导的损伤灶(TIF)阳性及相关衰老基因p16㊁p21㊁p53表达增加㊂本研究以此得到的衰老细胞模型有效且快速㊂H2O2诱导处理正常的BMSC后,细胞内活性氧(reactive oxygen species,ROS)大量聚集,ROS可引发DNA损伤,蛋白质氧化损伤,形成蛋白质交联聚合物等,通过相关细胞通路阻滞细胞周期的进程,诱导细胞衰老,使细胞生长缓慢甚至停滞[8]㊂SA-β-gal作为特异性衰老细胞的标志物最早在1995年被Dimir等[9]提出,他们观察到在pH为6.0时,仅有衰老的细胞为β-gal染色阳性,其原因为衰老细胞的内源性溶酶体-半乳糖的过度表达和积累㊂端粒的主要功能是保持染色体完整性,可保护DNA免受DNA双链断裂影响㊂ROS可引起端粒功能障碍,DNA损伤反应㊂持续的DNA损伤应答,可导致细胞生长停滞,发生细胞衰老㊂当DNA损伤时,H2AX发生磷酸化,募集DNA修复蛋白进行DNA修复㊂γH2AX与53BP1等复合体共定位于DNA损伤处进行应答反应,使细胞进入生长停滞,并可能启动衰老程序[10-11]㊂因此,通过寻找细胞内53BP1和γH2AX共定位的点可以辨别衰老细胞㊂氧化应激使得细胞p16㊁p21㊁p53基因表达增加㊂p16㊁p21㊁p53在细胞衰老和细胞周期中起关键调控作用[12-13]㊂p16表达增加可阻止细胞周期通过G1/S检测点使得细胞生长停滞;与此同时,p53的上调可激活p21基因,抑制cyclinA/E-CDK2的活性,阻止细胞周期的进行[14-15]㊂刘洋等[3]为建立人胎盘源间充质干细胞的衰老模型,采用H2O2来诱导处理,成功地得到了衰老模型,其H2O2处理浓度和时间与本研究相同㊂与之不同,郭柏铭等[4]也采用了H2O2诱导大鼠间充质干细胞的方法成功地获得了衰老模型,但其处理方法为500μmol/L H2O2处理24h,其可能原因为所处理的细胞不同,郭柏铭等[4]所得到的是衰老的大鼠BMSC,而本研究为小鼠BMSC㊂综上所述,通过200μmol/L H2O2处理小鼠BMSC2h,可获得较好的细胞衰老模型,此模型细胞生长慢,SA-β-gal染色阳性率高,TIF阳性细胞多,且p16㊁p21和p53基因的表达明显增高,可用于衰老BMSC相关实验研究㊂[参考文献][1]TURINETTO V,VITALE E,GIACHINO C.Senescence in human mesenchymal stem cells:functional changes and implications in stem cell-based therapy[J].Int J Mol Sci,2016,17(7):1164. 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单细胞 成纤维细胞亚群的marker基因
单细胞成纤维细胞亚群的marker基因-概述说明以及解释1.引言1.1 概述概述部分的内容可以包括对单细胞研究和成纤维细胞亚群的marker 基因的概述。
具体内容可以参考以下示例：在生物医学研究领域，单细胞研究已经成为一种重要的技术手段。
随着高通量测序技术的发展，人们可以逐个细胞地分析其基因表达谱，从而揭示细胞的异质性和功能特性。
其中，成纤维细胞作为一类重要的细胞类型，广泛存在于人体组织中并且具有多种重要的生理功能。
在单细胞研究中，对成纤维细胞亚群的研究具有重要意义。
成纤维细胞是一类关键的结缔组织细胞，在维持细胞外基质的合成和重塑中起着重要的作用。
成纤维细胞的功能多样，包括参与生长因子的分泌与调控、参与组织修复与创伤愈合以及细胞外基质的合成与降解等。
此外，成纤维细胞还在炎症反应、免疫应答等生理和病理过程中发挥着重要的调节作用。
然而，由于成纤维细胞的异质性以及其亚群之间的功能差异，研究人员迫切需要一种能够准确鉴定和分类成纤维细胞亚群的方法。
为了解决这一问题，研究人员发展了一种名为marker基因的分析手段。
marker基因是一组具有特异性表达的基因，可以作为标志物来鉴定特定细胞类型或亚群。
通过鉴定成纤维细胞亚群的marker基因，研究人员可以更好地理解不同亚群间的功能差异和调控机制，并进一步揭示成纤维细胞在生理和病理条件下的作用。
本文将着重探讨单细胞研究中鉴定成纤维细胞亚群的marker基因的重要性，并对未来相关研究方向进行展望。
通过深入剖析marker基因的作用和意义，我们可以更好地认识成纤维细胞亚群的功能特点，为相关疾病的治疗和预防提供新的思路和方法。
1.2 文章结构文章结构是指文章整体上的组织和安排方式。
一个清晰的文章结构可以帮助读者更好地理解和掌握文章的内容。
本文的结构分为引言、正文和结论三个部分。
引言部分用于介绍文章的背景和目的，引起读者的兴趣并概述文章的主要内容。
正文部分是文章的核心部分，包括单细胞研究的背景、成纤维细胞的功能和特点、成纤维细胞亚群的重要性以及Marker基因的作用和意义等内容。
地黄多糖对过氧化氢诱导的人晶状体上皮细胞氧化损伤的保护作用
欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁氉氉氉氉引文格式：罗丽丹，李达佑，钟华，曹玲英，刘婷婷．地黄多糖对过氧化氢诱导的人晶状体上皮细胞氧化损伤的保护作用［Ｊ］．眼科新进展，２０２２，４２（８）：６１２ ６１６．ｄｏｉ：１０．１３３８９／ｊ．ｃｎｋｉ．ｒａｏ．２０２２．０１２５【实验研究】地黄多糖对过氧化氢诱导的人晶状体上皮细胞氧化损伤的保护作用△罗丽丹 李达佑 钟 华 曹玲英 刘婷婷欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁氉氉氉氉作者简介：罗丽丹（ＯＲＣＩＤ：００００ ０００３ ４２５３ ８０１２），女，１９８１年５月出生，广东梅州人，副主任医师。
研究方向：白内障和青光眼的诊治。
Ｅ ｍａｉｌ：ｌｄｌｗｏｒｋ６６＠ｙｅａｈ．ｎｅｔ收稿日期：２０２２ ０１ １９修回日期：２０２２ ０２ ２３本文编辑：董建军△基金项目：梅州市医药卫生科研课题（编号：２０１５ Ｂ ２２）作者单位：５１４０１１ 广东省梅州市，梅州市人民医院眼科（罗丽丹，李达佑，曹玲英，刘婷婷）；５１４０１１ 广东省梅州市，梅州市人民医院产前诊断中心实验室（钟华）【摘要】 目的 探讨地黄多糖对过氧化氢（Ｈ２Ｏ２）诱导的人晶状体上皮细胞（ＨＬＥＣ）氧化损伤的保护作用及机制。
方法 取对数生长期的Ｂ ３细胞（ＨＬＥＣ）作为研究对象。
筛选Ｈ２Ｏ２和地黄多糖最佳作用浓度。
依据筛选的地黄多糖抑制Ｈ２Ｏ２致Ｂ３细胞损伤的最佳作用浓度处理细胞，将Ｂ ３细胞分为：空白组、Ｈ２Ｏ２组和地黄多糖组。
空白组：用１０ｇ·Ｌ－１羧甲基纤维素钠预处理细胞２４ｈ后，换为ＥＭＥＭ培养基培养２４ｈ；Ｈ２Ｏ２组：用１０ｇ·Ｌ－１羧甲基纤维素钠预处理细胞２４ｈ后，换为含１００ｍｏｌ·Ｌ－１Ｈ２Ｏ２的ＥＭＥＭ培养基培养２４ｈ；地黄多糖组：用含４０ｍｇ·Ｌ－１地黄多糖的培养基预处理细胞２４ｈ后，换为含１００ｍｏｌ·Ｌ－１Ｈ２Ｏ２的ＥＭＥＭ培养基培养２４ｈ。
资料
（一）H2O2活性氧包括以自由基形式存在的超氧化物自由基O(－)/(*)2，羟自由基OH·，以及不以自由基形式存在的H2O2、脂质过氧化物ROOH等。
活性氧的来源众多，如吸烟、多形核白细胞或单核细胞的激活，内毒素、TNFα的损伤作用很可能也是通过ROS来实现的［1］。
ROS是许多病理生理过程中的重要发病介质，如ARDS、缺血再灌注损伤等。
过氧化氢(H2O2）对内皮细胞的毒性效应早为人们所重视，但是以往的研究多着重H2O2的急性毒性效应，而对其急性作用去除后内皮细胞的迟发性改变研究较少。
我们以Chen等［2］报道的方法，经改良后培养了PMVEC，观察低浓度H2O2对PMVEC增殖代谢及调亡的影响。
1.过氧化氢处理K562细胞中JWA基因的表达及其与DNA损伤和凋亡的关系0.01、0.1、1 mmol/L的H2O2 K562细胞用0.1 mmol/L H2O2处理不同时间(6 ～48 h)和不同浓度(0.5 ～ 1 000 μmol/L)的H2O2处理48 h分别诱导K562细胞凋亡,在低剂量H2O2(0.01 mmol/L)处理时,JW A和热休克蛋白的表达均显著增高;在细胞凋亡模型中,JW A、hsp70、hsp27和p53的表达均显著增高2低浓度H2O2对肺微血管内皮细胞的迟发效应——凋亡H2O2DMEM溶液：0，5，10，20，50，100 μmol/L肺微血管内皮细胞(PMVEC)3 H2O2诱导PC12细胞凋亡的作用机制用终浓度分别为0～400nmol／L H2O2处理PC12细胞8h，随H2O2浓度从25～400nmol ／l。
增加，PC12细胞存活率逐渐降低（P〈0．05）：4 H2O2 预处理对PC12 细胞氧化应激损伤的适应性细胞保护作用PC12 细胞经10μmol·L - 1 H2O2 预处理90 min 后,20～60μmol·L - 1H2O2 对PC12 细胞生长的抑制程度明显下降, H2O2 (20 、30μmol·L - 1) 对PC12 细胞凋亡的诱导作用明显受到抑制,BD2 NF 的表达强度增强(二)LPSLPS刺激可诱导巨噬细胞的NF2κB 活化、NO 分泌并最终导致细胞凋亡,而特异性PKC 抑制剂(Cal C) 和NF2κB 阻断剂(PDTC) 能在不同程度上抑制LPS 的生物活性作用。
过氧化氢对Hela肿瘤细胞毒性和衰老的影响
过氧化氢对Hela肿瘤细胞毒性和衰老的影响作者：陈婉嫦等来源：《中国当代医药》2012年第25期[摘要] 目的体外实验探讨过氧化氢对Hela肿瘤细胞毒性和衰老的影响。
方法不同浓度的过氧化氢处理Hela细胞，CCK—8法检测细胞毒性，β—半乳糖苷酶染色法测定细胞衰老，测定平均荧光强度（MFI）反映细胞产生活性氧的水平。
结果细胞增殖实验显示，400 μmol/L、800 μmol/L、1 600 μmol/L对体外培养的Hela细胞有不同程度的细胞毒性，最高达89.0%。
过氧化氢处理后，细胞衰老率和活性氧产生水平随过氧化氢浓度升高而增高，呈现量效关系。
结论过氧化氢对Hela细胞有明显的细胞毒性，还能诱导其衰老和影响活性氧的产生水平。
[关键词] 过氧化氢；Hela细胞；细胞增殖；细胞衰老；活性氧[中图分类号] R—33 [文献标识码] A [文章编号] 1674—4721（2012）09（a）—0009—02现有研究表明，过氧化氢是肿瘤发生、发展和死亡过程的关键事件，通过改变过氧化氢的含量或许能达到化学预防和治疗的目的[1]。
本研究旨在探讨过氧化氢对体外Hela细胞的增殖和衰老的影响，为过氧化氢在肿瘤生长中的作用提供参考。
1 材料与方法1.1 实验材料1.1.1 试剂小牛血清（杭州四季青生物工程材料有限公司），DMEM（GIBCO，上海英骏生物有限公司），胰酶细胞消化液（Beyotime），CCK—8试剂盒（碧云天生物技术研究所），活性氧检测试剂盒（碧云天生物技术研究所），细胞衰老β—半乳糖苷酶染色试剂盒（碧云天生物技术研究所）。
1.1.2 仪器多功能酶标仪（Biotek），倒置显微镜（OLYMPUS），荧光显微镜（Leica），CO2培养箱（RSBiotech），超净工作台（苏净集团苏州安泰空气技术有限公司）。
1.1.3 细胞株人宫颈癌Hela细胞株，由广东医学院衰老研究所提供。
1.2 方法1.2.1 细胞培养将人宫颈癌细胞置于含10%小牛血清的DMEM培养液中，在 37℃，饱和湿度，5%CO2培养箱中培养。
丹酚酸B对H2O2诱导的HaCaT细胞衰老作用的影响及机制研究
【关键词 】 丹酚酸 Ｂ； 细胞衰老 ； 基因调控 ［中 图分 类 号 ］Ｒ７５１ ［文 献 标 识 码 ］Ａ ＤＯＩ：１０．３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ．１００２—１２５６．２０１８．１０．００１
Ｓｔｕｄｙ ｏｎ ｔｈｅ ｉｎｆ ｌｕｅｎｃｅ ｏｆ ｓａｌｖｉａｎｏｌｉｃ ａｃｉｄ Ｂ ｏｎ ｔｈｅ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｓｅｎｅｓｃｅｎｃｅ ｏｆ Ｈ ａＣａＴ ｃｅｌｌｓ ｉｎｄｕｃｅｄ ｂｙ Ｈ ，０ ， ａｎｄ ｉｔｓ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ＸＵ Ｙｉ—ｄａｎ． Ｘｉａｍｅｎ Ｍｅｄｉｃａｆ Ｃｏｌｌｅｇｅ，Ｘｉａｍｅｎ，Ｆｕｊｉａｎ．３６１００８．Ｃｈｉｎａ．
齐 齐 哈尔 医学 院学 报 ２０１８年 第 ３９卷 第 １０期 Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｏｉｑｉｈａｒ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，２０１８，Ｖｏ１．３９，Ｎｏ．１０
丹 酚 酸 Ｂ对 Ｈ２ Ｏ２诱 导 的 ＨａＣａＴ细胞 衰 老 作 用 的影 响及 机丹
丹 酚酸 Ｂ（Ｓａｌ Ｂ）是 丹参 的 含水 生 物 活 性 成 分 ， 是 一种 多 酚 类 化 合 物 ，在 该 植 物 中丰 度 较 高 。研 究 发 现 ，Ｓａｌ Ｂ 可 以 对 抗 泼 尼 松 致 大 鼠 皮 肤 衰 老 作 用 ＿】Ｊ。丹酚 酸 Ｂ（Ｓａｌ Ｂ）分 子 式 为 Ｃ３６Ｈ３００１６，是 丹 参 的重 要水 溶 性 活 性 成 分 ，具 有 丹 参 药 材 的大 部 分 生 物活 性 ｜２］．研 究 显 示 Ｓａｌ Ｂ 已 广 泛 应 用 于 多 种 疾 病 。如 心绞 痛 、肺 纤 维 化 和恶 性 肿 瘤 ＿３ ］。其 最 常 用 于心血 管疾 病 ，如 心 肌 梗 死 和 心 力 衰 竭 ［２’ 。最 近 大量文 献 表 明 。ＳａｌＢ可 以通 过促 进 细胞 生长 、抑 制 细
人巨细胞病毒感染新生儿血液微量元素的检测
Ｈ ｕｍ ａｎ ｃｙｔｏｍ ｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ ｉｎｆｅｔｉｏｎ ｏｆ ｔｒａｃｅ ｅｌｅｍ ｅｎｔｓ ｉｎ ｂｌｏｏｄ
ＹＵ Ｆｅｉ，ＬＩ Ｍｅｎｇ，ＧＵＯ Ｍ ｉｎ （Ｎａｎｊｉｎｇ Ｃｈｉｌｄｒｅｎ Ｓ Ｈｏｓｐｉｔａｌ ｏｆＮａｎｊｉｎｇ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｎａｎｆ ｉｎｇ ２１０００８，Ｃｈｉｎａ）
ｔｗｅｅｎ ｔｈｅ ｄｉｓｅｑｕｉｌｉｂｒｉｕｍ ｉｎ ｔｒａｃｅ ｅｌｅｍ ｅｎｔｓ ａｎｄ ｔｈｅ ｉｎｆ ｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ＨＣＭ Ｖ． Ｔｈｅｒｅｆｏｒｅ ｉｔ ｉＳ ｉｍｐｏｒｔａｎｔ ｔｏ ｂａｌａｎｃｅ ｔｈｅ ｔｒａｃｅ
［收稿 日期 ］２００９—０３—０６ ［修 回 日期 ］２００９—１０—１２ ［作者简 介］郁 飞（１９７８一），男 ，江苏南京人 ，住院医师 。Ｅ—ｍａｉｌ：ｎｊｅｔｙｙｙｆ＠ｙａｈｏｏ．ｃｏｍ．ｃｎ
［Ａｂｓｔｒａｃｔ］０ｂｊｅｃｔｉｖｅ：Ｔｏ ｅｘｐｌｏｒｅ ｔｈｅ ｒｅｌａｔｉｖｉｔｙ ｂｅｔｗｅｅｎ ｔｈｅ ｃｏｎｔｅｎｔｓ ｏｆ ｔｒａｃｅｓ ｅｌｅｍｅｎｔ ａｎｄ ｔｈｅ ＨＣＭＶ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｉｎ ｎｅｗｂｏｒｎｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ：Ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ ｂｙ ＰＣＲ ａｎｄ ＥＬＩＳＡ，８０ ｓａｍｐｌｅｓ ｗｉｔｈ ＣＭＶ。ＩｇＭ ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｓｅｒｕｍｎ ａｎｄ ＦＱ—ＣＭＶ— ＤＮＡ ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｉｎ ｓｅｒｕｍ ａｎｄ ｕｒ ｉｎｅ ｗｅｒｅ ｒｅｃｒｕｉｔｅｄ ａｓ ｓｕｂｊｅｃｔ ｇｒｏｕｐ ａｎｄ １０２ ｓａｍｐｌｅｓ ｗｉｔｈ ｔｈｏｓｅ ｏｆ ｎｅｇａｔｉｖｅ ｗｅｒｅ ｅｎ·
ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｖｉａ ｌｏｓｓ ｏｆ ａ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｍｏｔｏｒ ｐｒｏｔｅｉｎ ｌ Ｊ Ｉ．Ｃｕｒｒ Ｂｉ—
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H2O2诱发人成纤维细胞衰老样变化的基因表达谱3马 宏 张宗玉33 童坦君33(北京大学医学部生物化学与分子生物学系,北京100083)摘要 以50μmol/L H2O2作用体外培养的人胚肺二倍体成纤维细胞4次,使之出现不可逆的衰老表型.提取年轻细胞及H2O2处理早老细胞的mRNA,以荧光物Cy3标记年轻细胞cDNA,Cy5标记H2O2处理的细胞cDNA,并与点有4096条人类基因的芯片杂交,利用计算机数据处理判断基因是否存在表达差异.结果显示:有123种基因的表达变化较显著,这些基因参与细胞周期进程、细胞代谢及蛋白质修饰、细胞外基质及细胞骨架蛋白的形成和调节、炎症反应、调节受体酪氨酸蛋白激酶和G蛋白耦联受体信号转导.关键词 基因芯片,基因表达谱,早老,复制衰老,氧化压力学科分类号 Q26,Q52 活性氧基团(reactive oxygen species,ROS)引起生物大分子的氧化损伤被认为是影响细胞衰老进程的重要因素.ROS有许多种,H2O2分子小,无电荷,可以自由渗透质膜,并且相对稳定,是体外培养细胞最常用的“早老”诱导剂.H2O2诱导人成纤维细胞出现明显的衰老样改变,如胞体变大、扁平,胞浆内颗粒增多,细胞排列不规则,生长阻滞于G1期等,但目前对其分子机理还知之甚少.本文以亚致死量的H2O2重复4次处理体外培养的人胚肺二倍体成纤维细胞(2BS细胞),使细胞出现衰老样变化.为了排除H2O2引发的瞬时细胞周期阻滞,对研究过氧化氢诱导的长期衰老样变化基因表达谱的干扰,我们在H2O2最后一次处理2BS细胞48h后提取RNA,用含有4096种人类基因的基因芯片,检测H2O2诱导体外培养的成纤维细胞出现衰老样变化的基因表达情况.结果显示:在检测的4096种人类基因中,有123种基因的表达变化较显著,这些基因参与细胞周期进程、细胞代谢及蛋白质修饰、细胞外基质及细胞骨架蛋白的形成和调节、炎症反应、调节受体酪氨酸蛋白激酶和G蛋白耦联受体信号转导.最令我们感兴趣的是与分泌功能相关的基因亦有表达增强现象.1 材 料人胚肺二倍体成纤维细胞由卫生部北京生物制品研究所建系.2 方 法211 细胞培养及早老表型的诱导2BS细胞用含10%胎牛血清的DM EM培养液,于37℃5%CO2条件下培养,长至80%～90%融合时,1瓶细胞分存两瓶,传代.30代以下为年轻细胞,55代以上为老细胞.细胞培养至28代,当长至60%～70%融合时,倒掉培养液,加入含50μmol/L H2O2的PBS于37℃孵育30min,倒掉H2O2溶液,以PBS洗两遍,加入含10%胎牛血清的DM EM培养液孵育,每隔两天作用一次,共作用4次,提取总RNA.212 衰老相关的β2半乳糖苷酶染色参考文献[1]进行.213 总RNA的提取参考G ibco公司的Trizol试剂提取总RNA的方法.214 基因芯片与探针制备;杂交与荧光扫描参考文献[2]进行.215 RT2PCR验证分析将上面提取的早老细胞和对照组2BS细胞的总RNA逆转录合成cDNA,进行PCR扩增.3 结 果311 H2O2诱导2BS细胞出现衰老表型50μmol/L H2O2作用2BS细胞4次,细胞增殖速度明显降低,细胞变平、变大,最后一次H2O2处理48h后,对细胞进行衰老相关的β2半乳 3国家重点基础研究发展规划资助项目(G2000517001和G1999053906)和国家自然科学基金重点资助项目(39930170). 33通讯联系人. Tel:010*********,E2mail:ttj@ 收稿日期:2002206207,接受日期:2002206228糖苷酶染色,阳性率明显高于年轻细胞,与衰老细胞相似(图1).Fig 11 2B S cells stained for senescence 2associated β2g alactosid ase(a )early passage 2BS cells ;(b )senescent 2BS cells ;(c )premature senescence of 2BS cells induced by H 2O 2.Photomicrographs were takenunder bright field using a 10×objective.312 基因芯片的质量标准控制提取纯化H 2O 2诱导前和诱导后细胞的mRNA ,分别逆转录合成以Cy3和Cy5标记的cDNA 探针,混合后与含有4096条人类全长基因的芯片(HGEC 240S )杂交,用预先选定的内参基因(40个管家基因)对Cy3和Cy5的原始信号进行均衡和修正.同时,为了监控芯片制备和杂交过程,设定水稻U2RNA 、HCV 外壳蛋白及空白液为阴性对照,经验证这些点都为阴性,从而证明了数据的可靠性.313 H 2O 2诱导早老样2BS 细胞基因表达谱的变化在所检测的4096种人类基因中,有303种基因的荧光信号强度比在2倍以上(图2),可能为差异表达的基因(该结果的详细内容请与作者联系,E 2mail :hongma @ ).荧光信号强度比在215倍或215倍以上的基因有123种,其中部分基因列于表1.Fig 12 Scattered plot graph of Cy32labeled and C y52labeledprobes hybridizing with HGEC 240s microarrayEach point on the plot represented a gene hybridization signal.The red points represented the ratios ranged from 015to 210,belong to the undifferential group.The yellow points represented the ratios greater than 210or smaller than 015,whose gene expression was mostlypossible altered.314 Mad2与α22巨球蛋白基因表达变化的验证我们用R T 2PCR 验证了有丝分裂检控点激酶Mad2及α22巨球蛋白在早老细胞中的表达变化(图3).Fig 13 The RT 2PCR results of Mad 22and α222macroglobulinA :early passage 2BS cells ;B :premarure 2BS cells induced by H 2O 2.T able1 P artial gene expression changes in H2O22induced premature senescence of2BS cells G enBank-ID Ratio DefinitionA1G enes involved in controlling and mediating the progress of cell cycleK025*******Thymidine kinaseNM-00103401128Ribonucleotide reductase M2polypeptide(RRM2)AF0533*******Mititic checkpoint kinase Mad3LD5571601210P1cdc47NM-00398101214Protein regulator of cytokinesis1(PRC1)M2575301256Cyclin BU6541001307Mad2(hsMAD2)M3758301320Histone(H2A.Z)U010*******PL KX6253401334HM G22AF0715*******K inesin superfamily motor KIF4AJ00697301375TOM1proteinB1Enzymes and protein factors involved in metabolism and protein processingU5762301300Fatty acid binding protein FABPNM-00657901316Emopamil2binding protein(EBP)AF03866001330Beta21,42galactosyltransferaseNM-00196001336Eukaryotic translation elongation factor1deltaAC00452201349Z inc2alpha222glycoprotein precusorAB003226101389Stearoyl2CoA desaturase(Scd)Z9702901395Ribonuclease H1Y1080501397Arginine methyltransferaseX5140521513Carboxypeptidase EAF05607221611Kynurenine32hydroxylaseU4049021722Nicotinamide nuceoltide transhydrogenaseX71125421784G lutamine cyclotranferaseU00559831180Dihydrodiol dehydrogenaseU0586131292Hepatic dihydrodiol dehydrogenaseC1Receptor and signal transduction associated genesU8746001350Putative endothelin receptor type B2like proteinX8075401381GTP2binding proteinNM-00362021538Protein phosphatase1D magnesium2dependent,delta isoformNM-00284821593Protein tyrosine phosphatase,receptor type OAF0357*******Caveolin22X1757621908Melanoma nck proteinM2753431020Guanine nucleotide2binding protein(G i)alpha subunitNM-00289031255RAS p21protein activatorX7779431879Cyclin G1AB01450931451Nck2associated protein1(Nap1)D89094412263′,5′2cyclic GMP phosphodiesteraseZ2253341470AL K21D1Cytoskeleton and extracellular matrix associated genesU5804801198Metallopeptidase PRSM1Z4819901343Syndecan21D6399821585G olgi alpha2mannosidaseⅡS8056221594Acidic calponinX1442021631Pro2alpha21type3collagenS6573821646Actin depolymerizing factorJ0462121682Heparan sulfate proteoglycan(HSPG)core proteinM8321631006Aorta caldemonM2325431011Ca2+2activated neutral protease large subunitU5344531025Ovarian cancer downregulated myosin homologNM-00144931025Four and a half L IM domains1(FHL1)续 表G enBank-ID Ratio DefinitionD8793031042Myosin phosphatase target subunit1NM-00229131092Laminin beta1D6703141051Adducin2like protein(ADDL)E1G enes involved in stress responseNM-00030521563Paraoxonase2(PON2)NM-00151221652G lutathione S2transferase A4NM-00703421699DnaJ2like heat shock protein40AF10379621918Placenta2specific ATP2binding cassette transporterAF0518943104215kDa selenoproteinU3633631342Lysosome2associated membrane protein22bF1G enes involved in cellular secrection and secretory proteinM1131321112Alpha222macroglobulinNM-01232921520Monocyte to macrophage differentiation2associated proteinAJ131********Sec24proteinX6367921568TRAMP proteinNM-00314421677Signal sequence receptor alphaM3405721700Tranform factor2beta1binding proteinAB02690821782Microvascular endothelial differentiation gene1X7230821883Monocyte chemotactic protein23(MCP23)AB01345221979ATPaseIIM2311431184Calcium2ATPase(HK1)Y1675231700SecretagoginM1551841132Tissue2type plasminogen activator(t2PA)M60802851242K eratinocyte growth factor4 讨 论 从表1可以看出H2O2诱导早老样2BS细胞部分基因表达谱的变化.411 细胞周期蛋白及细胞周期进程相关基因H2O2诱导体外培养年轻的成纤维细胞,出现细胞周期G1期阻滞是其与复制性衰老细胞的共同特征(表1A).亚致死量的H2O2诱导的早老细胞中,细胞蛋白及细胞周期进程相关的基因普遍下调.我们研究室曾在老年鼠的脑中发现非组蛋白HM G22的表达下调,Ly等[3]在老年人的皮肤成纤维细胞中检测到HM G22、PL K和cyclin B的表达下调,cyclin B在体外培养的人视网膜色素上皮细胞、血管内皮细胞及皮肤成纤维细胞的复制性衰老过程中表达均下调[4],这些基因表达在体内、体外衰老过程中的普遍下调,说明它们可能对引发细胞周期G1期阻滞起重要作用.412 细胞代谢及蛋白质修饰相关基因由表1B可见,H2O2诱导2BS细胞生长阻滞,细胞内多数参与代谢的酶及相关蛋白表达下调,然而,氧化压力诱导生长抑制,同时并不排除某些蛋白质合成增加及一些新蛋白质的出现,还有一些原有的蛋白质的结构和活性发生了改变.我们观察到蛋白质合成后的修饰酶呈现不同的变化趋势:精氨酸甲基转移酶表达下调可能通过降低细胞的转录活性,及其他多种方式影响2BS细胞衰老表型的出现;羧肽酶E、谷氨酰胺环化酶催化的反应是分泌蛋白质剪接过程中起重要作用的修饰方式,这二种酶的高表达可能与过氧化氢诱导2BS细胞分泌行为的改变有关;研究者很早就发现色氨酸与哺乳动物整体衰老的关系,犬尿氨酸羟化酶作为色氨酸代谢的关键酶,在早老样细胞中表达上调,提示色氨酸可能在细胞的衰老过程中起着重要的作用.在早老的2BS细胞中,与活性氧基团(ROS)生成相关的NADH转氢酶及两种二氢苯二醇还原酶的表达明显上调,在2BS细胞复制性衰老细胞及其他哺乳动物的组织细胞中观测到同样的趋势[5].这说明:ROS水平的升高是体内、体外及过氧化氢诱导细胞早老的共同结果.413 受体、离子通道及细胞信号传导相关的基因由表1C可见,受体酪氨酸蛋白激酶(receptor tyrosine kinases,R T Ks)和G蛋白耦连受体(G2 protein2coupled receptor,GPCRs)是将细胞外信号转化为胞内反应的两大类主要受体.“早老”细胞中,下调R T Ks信号通路的基因表达普遍升高,一种新型的GTP结合蛋白表达下调.这一结果提示: H2O2诱导的“早老”细胞对外环境中生长因子等有丝分裂刺激原的可诱导性下降.在介导两大类受体与胞内信号的分子中,只有Nck分子及Nck相关蛋白1(Nck2associated protein1,NAF1)的表达上调,Nck的效应分子多为细胞骨架蛋白,Nck 的上调可能与过氧化氢诱导的细胞形态的改变有关,而NAF1的下调可以诱导凋亡,Nck的上调可诱导P21Cip1途径.P21Cip1是P53作用的重要靶基因,受P53诱导的周期素G1(cyclin G1)、蛋白磷酸酶wip21及P21激活蛋白在“早老细胞”也表达上调,wip21与P21相似,过高的表达会抑制细胞克隆的形成,受环境中多种压力的诱导,介导P38～P53通路的负调控,有助于抑制凋亡的诱导[6].上述结果提示:“早老细胞”可能与复制衰老细胞一样,对凋亡诱导因素的反应性降低[7].近年研究表明:环鸟苷酸可通过J N K1途径介导凋亡的诱导[8],环鸟苷酸二酯酶表达的上调从另一方面提示“早老”细胞抗凋亡诱导能力增强.414 细胞外基质及细胞骨架相关基因由表1D可见,与文献报道氧化压力下皮肤与心肌体外培养成纤维细胞的变化趋势[9]相反,我们用H2O2诱导的早老细胞中,细胞外基质的胶原组分、非胶原组分及参与细胞外基质合成和降解的金属蛋白酶的表达变化,与肾成纤维细胞氧化压力下细胞外基质组分的变化趋势相似[10],与2BS细胞复制衰老时也有相似之处.这一结果提示:不同组织来源的成纤维细胞在氧化压力下,细胞外基质组分的变化不尽相同,甚至差异很大,这可能与成纤维细胞在不同组织中的功能密切相关.细胞骨架蛋白是决定细胞形状的重要因素,微丝连接蛋白(calponin)表达、肌动蛋白解聚因子、抑制肌动肌球蛋白A TP活性的钙调结合蛋白等细胞骨架及调节蛋白表达的变化,可能是导致早老细胞形态衰老样变化的根本原因.415 抗细胞损伤基因由表1E可见,细胞的抗氧化防御机制分为两级:一级防御系统由一些低分子质量的抗氧化合物和酶组成,阻止自由基与靶分子的氧化作用;二级防御系统修复氧化损伤.热休克蛋白是一类受热反应激活的蛋白质,研究表明:热休克蛋白的生成有利于细胞对抗高温、氧化压力、细胞毒药物等不利生存的因素.H2O2诱导的早老细胞中,一种新的热休克蛋白———类DNA J热休克蛋白表达升高,与自由基清除相关的酶和蛋白质表达亦升高.这一结果表明:早老细胞中,抗氧化一级防御系统能力增强.另外,早老细胞中保护溶酶体膜的溶酶体结合糖蛋白2、消除有机磷毒性的对氧磷酸酶以及与细胞多药抗性相关的A TP结合传递蛋白的表达增强,提示早老细胞对凋亡信号及多种细胞毒性物质的抵抗力增强.416 细胞分泌蛋白及相关基因由表1F可见,早老细胞的基因表达谱中,上调幅度最大的角质细胞生长因子(KGF),在生物体许多组织细胞的衰老过程中都上调,肺成纤维细胞分泌的KGF与肺的发育、成熟有关;我们首次发现α222巨球蛋白在人成纤维细胞复制性衰老过程中不可逆地逐渐积累(待发表),其在早老细胞中表达亦上调,这提示α222巨球蛋白表达升高是与细胞衰老密切相关的事件之一;转化生长因子β1 (TGFβ1)的表达与细胞衰老表型的出现密切相关[11],我们检测到促进TGFβ1成熟的TGFβ1结合蛋白质,及一种新型的TGFβ受体超家族成员AL K21在早老2BS细胞表达上调,此二者可能通过调节TGFβ1的活性、传递TGFβ1信号,介导细胞衰老表型的出现.此外,参与蛋白质分泌的基因,如Secretagogin、A TPaseⅡ在早老细胞中均表达上调.上述结果提示:早老成纤维细胞分泌增强,分泌蛋白将影响临近细胞发生相应衰老相关的变化. 综上所述,亚致死量H2O2诱导2BS细胞出现衰老样变化的同时,也诱导细胞周期蛋白、细胞骨架蛋白、细胞代谢、信号传导、分泌蛋白以及相关基因的表达发生显著的变化.与复制衰老相比,尽管差异表达的基因不尽相同,变化的幅度也不一致,但从总体看,变化的趋势很相近.最令我们感兴趣的是早老细胞中,分泌蛋白的表达增高,分泌蛋白作为自分泌或旁分泌的细胞因子,作用临近的细胞,影响其形态和功能,这就可以解释为什么机体内极少量的衰老细胞就能损伤整体组织器官的功能.参 考 文 献1 Dimri G P,Lee X,Basile G,et al.A biomarker that identifies senescent human cells in culture and in aging skin i n vivo.Proc Natl Acad Sci USA,1995,92(20):9363～93672 许沈华,牟瀚舟,吕桂泉,等.高转移人卵巢癌细胞系基因表达谱差异.中国肿瘤,2001,10(1):41～43Xu S H,Mu H Z,LüG Q,et al.China Cancer,2001,10:41～433 Ly D H,Lockhart D J,Lerner R A,et al.Mitotic misregulation and human 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Cy5respectively were hybridized with microarray containing4096human genes.The gene expression changes were identified by GnePix4000B and G enePix310.123genes changed their expression significantly,which involved in progress of cell cycle,metabolism and protein processing,formation and modification of cytoskeleton and extracellular matrix and signal transduction,and the most interesting finding was that secretory function seemed to be enhanced in premature senescence of fibroblasts.K ey w ords gene chip,gene expression,replicative senescence,premature senescence,oxidative stress 3This work was supported by grants from The Special Funds for Major State Basic Research of China(G2000517001and G1999053906),The National Natural Sciences Foundation of China(39930170). 33Corresponding author.Tel:86210262091454,E2mail:ttj@ Received:J une7,2002 Accepted:J une28,2002。