藻类叶绿素a的测定
叶绿素a测定方法
叶绿素a测定方法
1 采取表层水样0.3－1L。
2 低温避光保存。
3 0.45um孔径的醋酸纤维滤膜，抽滤。
4 滤膜对折后，写好标签，冰藏。
5 将滤膜剪碎，放入研钵，加入少许碳酸镁、石英砂和10ml90％的
丙酮研磨（6ml左右研磨，其余润洗），倒入离心管，混匀，存8－
20小时。
6 离心，取上清夜，90％丙酮定容至10ml。
7 以90％丙酮为空白测定750nm，663 nm，645 nm，630 nm处
的吸光值。
8 计算公式：
Chla(mg/m3)={[11.64*(D663-D750)-2.16*(D645-D750)+0.10*(
D630-D750)]×10}/V
V=水样体积（L）
D=表示波长
水质叶绿素a的测定分光光度法编制说明
⽔质叶绿素a的测定分光光度法编制说明附件3《⽔质叶绿素a的测定分光光度法》（征求意见稿）编制说明《⽔质叶绿素a的测定分光光度法》标准编制组⼆○⼀五年⼋⽉项⽬名称：⽔质叶绿素a的测定分光光度法项⽬统⼀编号：939承担单位：辽宁省环境监测实验中⼼编制组主要成员：王秋丽、赵丽娟、王琳、丁振军、刘畅、徐天赐、姜永伟、秦⾬、郭杨、朱⼴钦、叶明、贺业菊标准所技术管理负责⼈：周⽻化、雷晶、张虞标准处项⽬负责⼈：张朔⽬录1项⽬背景 (1)1.1任务来源 (1)1.2⼯作过程 (1)2标准制订的必要性分析 (3)2.1叶绿素A的环境危害 (3)2.2相关环保标准和环保⼯作的需要 (4)3国内外相关分析⽅法研究 (5)3.1主要国家、地区及国际组织相关分析⽅法研究 (5)3.2国内相关分析⽅法研究 (8)4标准制订的基本原则和技术路线 (10)4.1标准制订的基本原则 (10)4.2标准制订的技术路线 (10)5⽅法研究报告 (12)5.1⽅法研究的⽬标 (12)5.2⽅法原理 (13)5.3试剂和材料 (13)5.4仪器和设备 (16)5.5样品的采集和保存 (17)5.6分析步骤 (21)5.7结果计算 (31)5.8质量保证和质量控制 (34)5.9注意事项 (34)6⽅法验证 (35)6.1⽅法验证⽅案 (35)6.2⽅法验证过程 (36)7与开题报告的差异说明 (38)8本标准实施的建议 (39)9参考⽂献 (39)《⽔质叶绿素a的测定分光光度法》编制说明1项⽬背景1.1任务来源（1）2006年6⽉，根据《关于下达2006年度国家环境保护标准制订项⽬计划的通知》（环办函[2006]371号），原国家环保总局办公厅下达了制订《⽔质叶绿素a的测定分光光度法》国家环保标准制修订计划，项⽬统⼀编号为：939。
（2）《⽔质叶绿素a的测定分光光度法》项⽬承担单位为：辽宁省环境监测实验中⼼。
1.2 ⼯作过程1.2.1 前期调研⼯作（1）成⽴标准编制组2006年7⽉，辽宁省环境监测中⼼承接了《⽔质叶绿素a的测定分光光度法》制修订任务以后，成⽴了标准编制组。
水体叶绿素a测定方法
水体叶绿素a测定方法叶绿素a的测定方法——乙醇+分光光度法1、水样的保存水样注入水样瓶后，应放置在阴凉处，并避免阳光直射。
若水样的进一步处理需要较长时间（大于12h），则应置于0℃~4℃低温下保存。
水样量视水体中浮游植物多少而定，一般应采0.5~2L。
2、抽滤在抽滤装置的滤器中放入GF/C滤膜。
抽滤时负压应不大于50kPa。
抽滤完毕后，用镊子小心地取下滤膜，将其对折（有藻类样品的一面向里），再用普通滤纸吸压，尽量去除滤纸上的水分。
如不立即提取，应将滤膜放在黑暗低温条件下保存。
在普通冰箱冷冻室中可存放几天，在-20℃低温冰箱中可保存30天。
3、提取研磨可用玻璃研钵。
将滤膜剪碎放入研钵，加入90%乙醇溶液7~8ml，研磨3~5分钟直至变为匀浆。
将研磨后的匀浆移入具塞带刻度的离心管中。
用少量提取液冲洗研钵或匀浆器，冲洗液并入离心管中，使终容积略小于10ml。
盖上关塞，摇动后置于黑暗低温处进行提取至少6-24h。
4、离心将装有提取液的离心管放入离心机中，转速3500~4000rpm，离心10~15min。
将上层叶绿素提取液移入定量试管中，再用少量提取液清洗、离心二次取得提取液。
最后将提取液定容到10ml。
如果大批样品需同步操作时，可减少离心步骤，直接在提取液中浸泡滤膜6-24h，取其清液即可。
5、测定用90%乙醇溶液作为参照液（参照比色皿中盛放90%乙醇溶液，并用90%乙醇调分光光度计零点）。
测定定容后的提取液在665nm和750nm处的吸光度，并计算两个吸光度的差记为A；1然后向比色皿中加入1滴1mol/L的盐酸酸化，酸化5—10min(可以用不同时间实验再进行调整)后再次测定酸化后的提取液在665和750nm处的吸光度，并且把酸化后的两个吸光度的差记为A2.则提取液中叶绿素a的浓度为：Chla=27.9×（A1－A2）×V提取液/V脱镁叶绿素浓度为：Chla=27.9×（1.7 A2－A1）×V提取液/V其中Chla为水样中的叶绿素a含量，单位为ug/L；V提取液为提取液的最终定容体积,单位为mL；V为抽滤水样的体积，单位为L。
叶绿素测定实验方法
叶绿素测定实验方法引言：叶绿素是一种存在于植物和藻类细胞中的绿色色素，它在光合作用中起着至关重要的作用。
因此，测定叶绿素含量对于研究光合作用的过程和效率具有重要意义。
本文将介绍一种常用的叶绿素测定实验方法，通过该方法可以准确快速地测定叶绿素的含量。
实验材料：1. 叶绿素提取液：含有乙醇和醋酸的混合液；2. 磷酸盐缓冲液：用于稀释样品和调整pH值；3. 丙酮：用于去除样品中的类胡萝卜素；4. 乙醇：用于去除样品中的脂类物质；5. 乙酸镁溶液：用于稀释样品和调整pH值；6. 纯水：用于稀释样品和制备试剂。
实验步骤：1. 取一片新鲜的叶片，用研钵将其研磨成细碎的叶浆。
添加适量的磷酸盐缓冲液，使叶浆与缓冲液的体积比为1:10，并搅拌均匀。
2. 将混合物过滤，收集滤液，滤液即为叶绿素提取液。
3. 将叶绿素提取液分装到两个试管中，分别标记为A和B。
4. 在试管A中加入适量的丙酮，用于去除样品中的类胡萝卜素。
搅拌均匀后，使其静置5分钟。
5. 在试管B中加入适量的乙醇，用于去除样品中的脂类物质。
搅拌均匀后，使其静置5分钟。
6. 分别离心试管A和B，将上清液转移到两个新的试管中。
7. 在试管A中加入适量的乙酸镁溶液，用于稀释样品和调整pH值。
搅拌均匀后，使其静置5分钟。
8. 在试管B中加入适量的纯水，用于稀释样品和制备试剂。
搅拌均匀后，使其静置5分钟。
9. 分别使用分光光度计测量试管A和B中溶液的吸光度。
选择适当的波长（通常为665nm和649nm），分别记录吸光度值为A665和A649。
10. 根据公式A = (A665 - A649) × V / M，计算叶绿素的含量。
其中，V为取样体积，M为叶绿素的摩尔吸光系数。
结果分析：通过测量试管A和B中溶液的吸光度，可以计算出叶绿素的含量。
试管A中的溶液经过丙酮处理，去除了类胡萝卜素的干扰；试管B 中的溶液经过乙醇处理，去除了脂类物质的干扰。
因此，通过计算两个试管中溶液的吸光度差，可以准确测定叶绿素的含量。
浅析地表水叶绿素a的测定
浅析地表水叶绿素a的测定地表水中叶绿素a的测定是评价水质的重要方法之一。
叶绿素a是植物及浮游生物中广泛存在的一种光合色素，它在光合作用中具有重要的作用，同时叶绿素a在水中主要来源于植物和藻类的生长。
测定地表水叶绿素a的方法有很多，常用的方法包括光谱法、高效液相色谱法（HPLC）、荧光法和叶绿素-a水柱吸收光谱法等。
光谱法是一种比较简单的方法，它通过测定地表水样品在特定波长下的吸光度来计算叶绿素a的浓度。
具体操作步骤为：将水样过滤，去除颗粒物质；然后，用乙醇溶解过滤后的样品，使叶绿素a溶解在乙醇中；接下来，利用分光光度计测定溶液在665nm和750nm 波长下的吸光度，根据比例关系计算叶绿素a的浓度。
HPLC方法是一种精确度较高的测定方法，它利用液相色谱仪分离地表水中的叶绿素a，并通过检测峰面积或峰高来计算叶绿素a的浓度。
这种方法需要较为复杂的仪器设备和技术操作，适用于高精度测定和研究。
荧光法是另一种常用的测定方法，它利用地表水样品中叶绿素a的荧光特性来计算其浓度。
荧光法具有操作简单、快速等优点，适用于大规模水质监测。
叶绿素-a水柱吸收光谱法是一种用来测定地表水中叶绿素a浓度的新方法。
该方法通过利用叶绿素a与纳米粒子共吸附在水柱上的原理，实现对地表水样品中叶绿素a浓度的测定。
这种方法具有简单、快速、灵敏度高等特点，是一种有潜力的测定方法。
测定地表水叶绿素a的方法有很多种，每种方法都有其优点和不足。
在实际应用中，可以根据具体需要选择合适的方法进行分析，以评价水体中叶绿素a的浓度，从而了解水体的富营养化程度和藻类生长状况，更好地保护和管理水资源。
叶绿素含量测定方法(精)
叶绿素含量测定方法---丙酮法由于微藻的生长周期比较复杂，包括无性繁殖阶段和有性繁殖阶段，其在不同阶段的生理形态不同，有时藻细胞会聚集在一起，以片状或团状形式存在，在显微镜下难以确定其所包含的细胞数量。
藻细胞中叶绿素的含量（特别是叶绿素a的含量）通常随与细胞的生长呈较好的线性关系，因此可通过测定藻细胞中叶绿素含量变化来反映微藻的生长情况。
叶绿素测定采用丙酮研磨提取法。
取适量藻液于10 mL离心管中在4000 rpm转速下离心10 min，弃去上清液，藻泥中加入适量的100 %的丙酮。
采用丙酮提取法时在试管研磨器中冰浴研磨5 min，4000 rpm离心后，上清液转入10 mL容量瓶中。
按上述方法对藻体沉淀进行萃取，直至藻体沉淀呈白色为止。
定容后，采用722S型可见分光光度计分别测定645 nm和663 nm下萃取液的吸光值，叶绿素含量用以下公式进行计算（Amon,1949）：叶绿素a含量用以下公式进行计算：Chlorophyll a (mg/L) = (12.7×A663 nm－2.69×A645 nm)×稀释倍数叶绿素b含量用以下公式进行计算：Chlorophyll b (mg/L) = (22.9×A645 nm－4.64×A663 nm)×稀释倍数叶绿素总含量用以下公式进行计算：Chlorophyll a＋b (mg/L) = (20.2×A645 nm＋8.02×A663 nm)×稀释倍数由于丙酮的沸点较低，较高温度下挥发很快。
此外，叶绿素稳定性较差，见光易分解，因此，本实验中叶绿素的提取和测定均在低温黑暗条件下进行，以减少提取过程中的损失。
叶绿素提取方法提取液：本试验用DMSO/80%丙酮(l/2，v/v)提取的叶绿素，谭桂英周百成底栖绿藻叶绿素的二甲基亚砜提取和测定法* 海洋与湖沼 1987 18（3）295--300.一、直接浸提法：1、准确量取10ml藻液,加到15ml离心管中，放在台式离心机离心，3500r/min （根据不同的藻选择不同那个的离心转速）离心5min倒上清；留藻泥。
分光光度法测定水中的叶绿素a
分光光度法测定水中的叶绿素a1 检出限水样体积300 mL、使用1 cm比色皿时，叶绿素a的检出限为0.11 μg/L，测定下限为0.5 μg/L；叶绿素b的检出限为0.25 μg/L，测定下限为1.0 μg/L；叶绿素c的检出限为0.25 μg/L，测定下限为1.0 μg/L。
2 方法原理将一定量水样用玻璃纤维膜过滤，收集藻类，使用反复冻融法对藻类细胞进行破碎，用90%丙酮溶液提取叶绿素，根据叶绿素光谱依次测定750 nm、664 nm、647 nm、630 nm波长下的吸光度，计算叶绿素含量。
3 试剂和材料3.1 碳酸镁悬浊液：ω（MgCO3）= 1%，1.0 gMgCO3 100 mL纯水3.2 丙酮溶液：ψ（C3H6O）= 90%，900 mL丙酮加100 mL纯水3.3 盐酸溶液：c（HCl）=0.1 mol/L。
8.5 mL浓盐酸加入500 mL纯水，冷却后稀释至1000 mL。
4 仪器和设备4.1 抽滤装置4.2 滤膜4.3 具塞玻璃离心管4.4 水浴锅4.5 离心机：转速3000 ~ 4000 r/min4.6 分光光度计4.7 比色杯：3 cm5 水样采集5.1 水样采集采集500 ~ 1000 mL 水样于棕色玻璃瓶或深色塑料瓶中。
5.2 保存避光保存，低温运输，在-20℃以下的冰箱内保存，在25 d 内分析测试。
6 分析步骤6.1 清洗玻璃仪器所有玻璃仪器应该清洗干净，尤其避免酸性条件下引起的叶绿素a 的分解。
6.2 滤膜过滤每种测定水样取300 mL ，加入0.6 mLMgCO 3悬浊液，用滤膜过滤。
6.3 提取将滤膜转移至具塞试管，加少量碳酸镁粉末和10 mL 已水浴加热至50℃的90%丙酮溶液。
塞紧塞子并在管子外部罩上遮光物，充分震荡，避光提取4 h 。
6.4 离心提取完毕后，离心管置于离心机上4000 r/min 离心20 min ，取出离心管，用移液管将上清液移入刻度离心管中，塞紧塞子，4000 r/min 再离心10 min 。
测定植物叶绿素含量的方法
测定植物叶绿素含量的方法
植物叶绿素是一种广泛存在于植物、藻类和一些细菌中的绿色色素，能够在吸收光子的过程中将光能转化为化学能。
因此，测定植物叶绿素含量是衡量植物光合作用效率的重要指标之一。
1. 乙醇提取法
将待测叶片粉碎后加入适量的95%乙醇中，放置于暗处浸泡数小时或过夜，然后离心收集上清液。
测定上清液吸光度，通过比较不同波长下的吸光度值，可计算出叶绿素a、叶绿素b和类胡萝卜素的含量。
将待测叶片粉碎后加入1.5mL 80%乙醇和0.5mL 1mol/L HCl的混合液中，振荡10分钟后加入玻璃珠摇匀，含有叶绿素的乙醇溶液将变为红褐色。
用0.22µm微孔滤纸过滤，取上清液，用分光光度计测定吸光度值后计算叶绿素含量。
3. 醋酸铜法
将待测叶片加入0.05%醋酸铜溶液中，用滚轴摇匀10分钟后过滤，取上清液后测定吸光度并计算叶绿素含量。
4. 液相色谱法
将待测叶片加入甲醇或乙腈中，使用高效液相色谱仪分析样品中的叶绿素和类胡萝卜素含量。
这种方法需要更为精确的仪器和技术，但可以同时测定多种色素。
无论使用哪种方法测定植物叶绿素含量，都需要注意以下几点：
1. 样品采集应在相同的时间、地点和光照条件下进行，以保证结果可比性。
2. 需要控制乙醇、醋酸铜等试剂用量、摇匀时间和过滤条件等因素，以获得准确的结果。
3. 对于不同种类和部位的植物，可能需要针对性地选择不同的测定方法，并对结果进行修正和比较。
叶绿素a和b含量的测定(分光光度法)
实验14 叶绿素a 和b 含量的测定（分光光度法）一、目的学会Chla 、b 含量的测定方法，了解叶片中Chla 、b 的含量。
二、材料用具及仪器药品菠菜叶片、721分光光度计、天平、研钵、剪刀、容量瓶（25ml ）、漏斗、滤纸、乙醇（95%）三、原理叶绿素a 、b 在波长方面的最大吸收峰位于665nm 和649nm ，同时在该波长时叶绿素a 、b 的比吸收系数K 为已知，我们即可以根据Lambert Beer 定律，列出浓度C 与光密度D 之间的关系式：D 665=83.31Ca+18.60C b (1)D 649=24.54Ca+44.24 C b (2)(1)(2)式中的D 665、D 649为叶绿素溶液在波长665nm 和649nm 时的光密度。
为叶绿素a 、b 的浓度、单位为每升克数。
82.04、9.27为叶绿素a 、b 在、在波长665nm 时的比吸收系数。
16.75、45.6为叶绿素a 、b 在、在波长649nm 时的比吸收系数。
解方程式(1)(2)，则得 ：C A =13.7 D 665—5.76 D 649 (3)C B =25.8 D 649—7.6 D 665 (4)G=C A +C B =6.10 D 665+20.04 D 649 (5)此时，G 为总叶绿素浓度，C A 、C B 为叶绿素a 、b 浓度，单位为每升毫克，利用上面（3）（4）（5）式，即可以计算叶绿素a 、b 及总叶绿素的总含量。
四、方法步骤1．称取0.1克新鲜叶片，剪碎，放在研钵中，加入乙醇10ml 共研磨成匀浆，再加5ml 乙醇，过滤，最后将滤液用乙醇定容到25ml 。
2．取一光径为1cm 的比色杯，注入上述的叶绿素乙醇溶液，另加乙醇注入另一同样规格的比色杯中，作为对照，在721分光光度计下分别以665nm 和649nm 波长测出该色素液的光密度。
计算结果：叶绿素a 含量（mg/g. FW ）=2.01100025⨯⨯A C 叶绿素b 含量（mg/g.FW ）=2.01100025⨯⨯B C 叶绿素总量（mg/g.FW ）=2.01100025⨯⨯G五、实验报告计算所测植物材料的叶绿素含量。
叶绿素a与叶绿素b含量的测定
CONSTRUCTION节能环保一、叶绿素的概念叶绿素是一类与光合作用有关的最重要的色素。
光合作用是通过合成一些有机化合物将光能转变为化学能的过程。
叶绿素实际上存在于所有能营造光合作用的生物体，包括绿色植物、原核的蓝绿藻（蓝菌）和真核的藻类。
叶绿素从光中吸收能量，然后能量被用来将二氧化碳转变为碳水化合物。
叶绿素是植物进行光合作用的主要色素，是一类含脂的色素家族，位于类囊体膜。
叶绿素吸收大部分的红光和紫光但反射绿光，所以叶绿素呈现绿色，它在光合作用的光吸收中起核心作用。
叶绿素为镁卟啉化合物，包括叶绿素a、b、c、d、f 以及原叶绿素和细菌叶绿素等。
去镁叶绿素。
叶绿素有造血、提供维生素、解毒、抗病等多种用途。
二、实验材料和方法1、实验材料使用韭菜叶片作为实验材料，测定其叶绿素含量，样品购自菜市场，仪器使用SPECORD ®50PLUS 型双光束分光光度计、高速电动匀浆机和电子天平。
药品：无水乙醇、石油醚、聚四氯乙烯、蒸馏水、丙酮（80%）、叶绿素a 和叶绿素b 标准品；用具：锥形瓶、超声波水浴锅。
2、实验方法（1）叶绿素提取提取前先进行提取试剂的优化选择，使用乙醇、丙酮和石油醚、异辛烷、正庚烷配制成2∶3的混合溶液。
从中选择出提取叶绿素含量最高的配比溶剂进行最终提取。
叶绿素含量根据朗伯.比尔定律进行计算，叶绿素含量测定结果用mg/kg 表示，使用如下公式：w=（kxA 校正xV）/mxl，其中A 校正=A665-（A705+A625）/2，w 为样品中叶绿素含量单位为mg/kg；A665为最大吸收665nm 的吸收值；A705为705nm 附近峰谷的吸收值；A625为625nm 附近峰谷的吸收值；k 为吸光常数取值13；l 为光程，指石英杯的厚度，单位为cm；m 为试样质量数值，单位为g；V 是提取试剂的体积，单位是ml。
称量定量切碎韭菜样品放入锥形瓶内，加入乙醇和石油醚混合浸提液（2：3，以上结果证明该配比提取含量最高），使用聚四氟乙烯密封带将瓶口密封，避免混合液挥发。
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藻类叶绿素a的测定一、实验名称藻类叶绿素a的测定二、实验目的——(水)环境化学中叶绿素a测定意义在地表水环境的富营养化的研究中，叶绿素a是表征浮游植物生物量的最常用的指标之一。
同时，叶绿素a也是用来衡量水体水质，评价水体富营养化水平的标准之一。
三、实验原理叶绿素介绍叶绿素是植物进行光合作用的主要脂溶性色素，它在光合作用的光吸收中起核心作用。
所有光合器官中都含有叶绿素。
叶绿素a和b都溶于乙醇、乙醚、丙酮等，难溶于石油醚，有旋光，主要吸收橙红光和蓝光。
因此，这两种光对光合作用最有效。
当植物细胞死亡后，叶绿素即游离出来，游离叶绿素不很稳定，光、热、酸、碱、氧、氧化剂等都会使其分解。
在酸性条件下，叶绿素中的镁原子很容易被其他酸代替，绿色消失而变黄，叶绿素生成绿褐色的脱镁叶绿素，加热时反应加速。
叶绿素的实验室测量方法有分光光度法、荧光法、色谱法，其中以传统的分光光度法应用最为广泛。
根据叶绿体色素提取液对可见光谱的吸收，利用分光光度计在某一特定波长下测定其吸光度，即可用公式计算出提取液中各色素的含量。
根据朗伯-比尔定律，某有色溶液的吸光度A与其中溶质浓度C和液层厚度L成正比，即：A =α•C•L式中：α为比例常数。
当溶液浓度以百分比浓度为单位，液层厚度为1cm时，α为该物质的吸光系数。
各有色物质溶液在不同波长下的吸光系数可通过测定已知浓度的纯物质在不同波长下的吸光度而求得。
如果溶液中有数种吸光物质，则此混合液在某一波长下的总吸光度等于各组分在相应波长下吸光度的总和，这就是吸光度的加和性。
（1）单色法已知叶绿素a的80％丙酮提取液在红光区的最大吸收峰分别为663nm，已知在波长663nm下，叶绿素a在该溶液中的比吸收系数分别为82.04，因此C A=A663/82，可以计算出叶绿素a的含量(mg/L)。
（2）三色法已知叶绿素a、b的80％丙酮提取液在红光区的最大吸收峰分别为663nm 和645nm，且两吸收曲线相交于652nm 处。
因此测定提取液在645nm、663nm、652nm 波长下的吸光值，根据经验公式便可分别计算出叶绿素a、叶绿素b和总叶绿素的含量。
已知在波长663nm下，叶绿素a、b在该溶液中的比吸收系数分别为82.04 和9.27，在波长645nm下分别为16.75和45.60，可根据加和性原则列出以下关系式：A663=82.04Ca +9.27Cb (1)A645=16.75Ca+45.6Cb (2)式中A663、A664分别为波长663nm和645nm处测定叶绿素溶液的吸光度值；Ca、Cb分别为叶绿素a、b的浓度(g/L)。
解联立方程(1)、(2)可得以下方程：Ca=0.0127A663-0.00269A645 (3)Cb=0.0229A645-0.00468A663 (4)如把叶绿素含量单位由g/L改为mg/L，(3)、(4)式则可改写为：Ca(mg/L)=12.7A663-2.69A645 (5)Cb(mg/L)=22.9A645-4.68A663 (6)叶绿素总量CT(mg/L)=Ca+Cb=20.2A645+8.02A663 (7)叶绿素总量也可根据下式求导A652=34.5×CT由于652nm为叶绿素a与b在红光区吸收光谱曲线的交叉点(等吸收点)，两者有相同的比吸收系数(均为34.5)，因此也可以在此波长下测定一次吸光度(A652)求出叶绿素总量：CT(g/L)=A652/34.5CT(mg/L)=A652×1000/34.5 (8)因此，可利用(5)、(6)式可分别计算叶绿素a与b含量，利用(7)式或(8)式可计算叶绿素总量。
从上可见，叶绿素提取后测定又可以分为两种：单色法(663nm)与三色法(645nm、663nm、652nm)。
具体使用单色法还是三色法将依据测定对象而定。
在标准方法、超声波法、反复冻融法、延时提取法、热丙酮法、丙酮加热法、热乙醇法、混合溶剂法等多种常见浮游植物叶绿素a测定方法中，针对实验室培养的微囊藻（Microcystis aeruginosa）水华样品为研究对象进行的叶绿素a含量测定。
不管是从叶绿素a提取的完全性、测定数据的稳定性、试验操作的简便性考虑等方面来看，包括国家标准方法在内的大多数方法，存在操作耗时长、过程复杂、叶绿素提取不完全的缺点；而以丙酮加热法测量叶绿素a的提取效率高、数据稳定性好，操作耗时短、简便，可推荐作为一种常用的浮游植物叶绿素a的测量方法，尤其是应急监测或大批量水环境样品测定时更显现优势(表1)。
表1 不同提取方法实验耗时情况测定方法标准方法延时提取法热丙酮法反复冻融法超声提取法丙酮加热法热乙醇法混合溶剂法ρ/(µg·L-1) 0.974 1.011 1.216 1.435 1.517 1.635 1.026 1.397 标准方差0.149 0.163 0.157 0.064 0.253 0.072 0.077 0.126 变异系数15.7 16.0 14.7 3.91 16.5 3.26 5.24 9.42 实验耗时/h 8-8.5 7-7.5 9-9.5 24 21 1.5-2 8-9 8-9 丙酮加热法测定的注意事项：随着水浴加热过程温度的升高，丙酮的萃取能力得到增强，而且提取过程耗时短、操作简单，样品基本没有损失。
但在实验过程中，加热的时间与温度控制很重要，且需要采取避光措施。
温度过高、有光照条件以及加热时间过长，均可能破坏叶绿素a的稳定性。
四、材料、仪器设备及试剂材料：待测浮游藻；本实验采用蓝藻——产毒铜绿微囊藻（左）与绿藻——蛋白核小球藻（右）。
仪器设备：5mL或1mL移液枪、5mL或1mL枪头、10mL离心管、离心机、锡箔纸、水浴锅、温度计、10mL刻度试管、比色皿、分光光度计。
试剂：80％丙酮。
五、实验步骤实验一、确定藻密度的蓝藻藻液。
用移液枪吸取2mL蓝藻液置于10mL离心管中，于12000rpm离心5min，用移液枪吸去上清液。
藻饼于2mL 80%丙酮中重悬浮，后用锡箔纸完全包裹10mL离心管，并置于光线较暗处55ºC水浴放置30min，后于12000rpm离心5min，吸出上清液转移至10mL刻度试管中，并用80%丙酮定容于5mL，测定663nm处的光吸收值，测定结果按照C A=OD663/82，计算出叶绿素的含量(mg/L)。
实验二、确定藻密度的绿藻藻液。
用移液枪吸取2mL绿藻液置于10mL离心管中，于12000rpm离心5min，用移液枪吸去上清液。
藻饼于2mL 80%丙酮中重悬浮，后用锡箔纸完全包裹10mL离心管，并置于光线较暗处55ºC 水浴放置60min ，后于12000rpm 离心5min ，吸出上清液转移至10mL 刻度试管中，并用80%丙酮定容于5mL ，测定663nm 处的光吸收值，测定结果按照C A =A663/82，计算出叶绿素a 的含量(mg/L)。
用移液枪吸取2mL 绿藻液置于10mL 离心管中，于12000rpm 离心5min ，用移液枪吸去上清液。
藻饼于2mL 80%丙酮中重悬浮，后用锡箔纸完全包裹10mL 离心管，并置于光线较暗处55ºC 水浴放置30min ，后于12000rpm 离心5min ，吸出上清液转移至10mL 刻度试管中，并用80%丙酮定容于5mL ，测定663nm 、645nm 、652nm 处的光吸收值，测定结果按照三色法公式，可计算出叶绿素a 、叶绿素b 与总叶绿素的含量(mg/L)。
根据下式，计算出原藻液中各叶绿素的含量(mg/L)：C mg L L Chl mg/L L ⨯(/)提取液总量()（)=初始体积()根据下式，计算出不同藻液中单个细胞各叶绿素的含量(g/个细胞)：()-1C mg L L Chl g/⨯(/)提取液总量()（细胞)=藻细胞总数个 六、实验数据处理 在不同波长下分别测蓝藻和绿藻的吸光度，数据记录如下表：对蓝藻的叶绿素计算用公式C A =OD 663/82，计算结果见下表45.6对绿藻的叶绿素a 、叶绿素b 与总叶绿素分别用公式：Ca(mg/L)=12.7A 663-2.69A 645Cb(mg/L)=22.9A 645-4.68A 663CT(mg/L)=A 652×1000/34.5计算结果如下表：根据下式，计算出原蓝藻和绿藻溶液中各叶绿素的含量(mg/L)：C mg L L Chl mg/L L ⨯(/)提取液总量()（)=初始体积()结果见下表：根据下式，计算出蓝藻和绿藻中单个细胞各叶绿素的含量(g/个细胞)：()-1C mg L L Chl g/ (/)提取液总量()（细胞)=藻细胞总数个 蓝藻藻液密度为3.3x107个/mL ，即每毫升蓝藻藻液中含有3.3x107个蓝藻细胞。
绿藻藻液密度为8.4x107个/mL ，即每毫升绿藻藻液中含有8.4x107个绿藻细胞。
结果见下表：七、 结果与讨论（1）请说明蓝藻只采用单色法测定叶绿素的原因。
单色分光光度法测定叶绿素含量时，要测定665和750nm 处的吸光度。
蓝藻只含有叶绿素a ，不含有叶绿素b ，所以只采用单色法测定叶绿素。
（2）请比较绿藻单色法与三色法测定结果的差异，并说明理由。
从单色法与三色法的测定结果比较得出，一般单色法测定的Chl-a 的数值要高于三色法。
因为，单色法计算所得的叶绿素a 的含量是在663nm 处所有吸光的叶绿素含量，不仅仅包括叶绿素a ，还有部分叶绿素b ，而三色法计算所得的叶绿素a 减去了在663nm 处吸光的叶绿素b 的含量，计算所得的是纯叶绿素a 的含量，所以单色法的测定结果要高于三色法的测定结果。
（3）试分析叶绿素含量单位mg/L 与g/个细胞的意义，与可能适用的情况。
叶绿素含量以mg/L 为单位时表示的是每升藻液中叶绿素的含量，而以g/个细胞为单位时表示的是藻液每个细胞内含有的叶绿素的含量，后者体现了藻密度对叶绿素含量的影响。
当需要表示藻类叶绿素的总体含量时用mg/L 为单位，要表示藻类单个细胞中叶绿素含量高低时用g/个细胞。