合成利巴韦林的关键酶瞟呤核苷磷酸化酶的原核表达及活性分析

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生物化学综合题

(2) 丙氨酸→丙酮酸→乙酰辅酶A -------------→软脂酸脂肪酸合成酶系
16、试将下列左右两栏的内在联系（即那种中间产物属于哪种代谢途
径）标出
左栏（代谢途径）
右栏（中间产物）
（1）淀粉合成
A. 7－磷酸景天糖
（2）脂肪酸合成
B. 氨酰－tRNA
（3）嘌呤核苷酸合成
C. 乳清酸
- (4) HMP途径
一个大肠杆菌细胞质量等于V.ρ=1.57x10-12x1.2=1.88x10-12g 一个大肠杆菌内β-半乳糖苷酶的质量：1.88x1012x14%x1%=2.63x10-15g 一个大肠杆菌内β-半乳糖苷酶的分子个数： 2.63x10-15/450000 x6.023x1023=3520个
11、试计算1摩尔天冬氨酸经过联合脱氨基、有氧呼吸等彻底氧化后，
大肠杆菌DNA复制过程中需要如下酶类和蛋白质：DNA旋转酶、 DNA连接酶、单链结合蛋白、引物合成酶、DNA聚合酶Ⅲ全酶、 DNA聚合酶Ⅰ和DNA连接酶。（2）tRNA是运载各种氨基酸的特异工具，mRNA是蛋白质合成的模板，核糖体是蛋白质合成的场所。

4、简述乙酰辅酶A的来源和去路。葡萄糖
丙酮酸某些生酮及生糖兼生酮氨基酸
乙酸+辅酶A+ATP
乙酰辅酶A+H2O+Ppi+AMP
乙醛酸循环
乙酰辅酶A
柠檬酸
异柠檬酸
草酰乙酸
异柠檬酸裂解酶
琥珀酸
苹果酸合成酶
苹果酸
乙醛酸
乙酰辅酶A
可见，由于乙醛酸循环中有异柠檬酸裂解酶和苹果酸合成酶存在，可以不断地合成二羧酸和三羧酸，作为TCA循环的补充。
葡萄糖（2）

某大学生物工程学院《生物化学》考试试卷(1119)

某大学生物工程学院《生物化学》课程试卷（含答案）__________学年第___学期考试类型：（闭卷）考试考试时间：90 分钟年级专业_____________学号_____________ 姓名_____________1、判断题（95分，每题5分）1. 动物可利用葡萄糖合成维生素C。

（）答案：错误解析：2. 用碱水解核酸，可以得到2′核苷酸与3′核苷酸的混合物。

（）答案：正确解析：碱水解核酸时，先生成2′、3′环核苷酸，再水解为2′或3′核苷酸。

3. 蛋白质变性后，其构象发生改变而构型不变。

（）答案：错误解析：蛋白质变性后，构型也可能会发生改变。

构型是一个有机分子中各个原子特有的固定的空间排列。

这种排列不经过共价键的断裂和重新形成是不会改变的。

蛋白质变性中，可能会涉及二硫键的断裂，进而影响到蛋白质构型的变化。

4. D葡萄糖的对映体为L葡萄糖，后者存在于自然界。

（）答案：错误解析：5. 疏水作用是使蛋白质空间结构稳定的一种非常重要的次级键。

（）答案：正确解析：6. 维生素对人体有益，所以摄入的越多越好。

（）答案：错误解析：7. 多肽链能否形成α螺旋及螺旋是否稳定与其氨基酸组成和排列顺序直接有关。

（）解析：8. 磷脂和糖脂是构成生物膜脂双层结构的基本物质。

（）答案：正确解析：9. 当溶液的pH大于某一可解离基团的pKa值时，该基团有一半以上被解离。

（）答案：正确解析：10. 酶活性中心是酶分子的一小部分。

（）答案：正确解析：11. 竞争性可逆抑制剂一定与酶的底物结合在酶的同一部位。

（）。

解析：竞争性可逆抑制剂可以与酶的底物结合在酶的同一部位，也可以与酶的底物结合在酶的不同部位，由于空间位阻或构象改变的原因而不能同时结合。

12. 所有B族维生素都是杂环化合物。

（）答案：错误解析：B族维生素中维生素B3不含环状结构，其余都是杂环化合物。

13. 血红蛋白与肌红蛋白均为氧载体，前者是一个典型的别构（或变构）蛋白，因而与氧结合过程中呈现协同效应，而后者却不是。

滑液支原体GDPD基因的原核表达、酶活性分析及亚细胞定位

滑液支原体GDPD基因的原核表达、酶活性分析及亚细胞定位胡荣斌; 邢小勇; 武小椿; 张阳阳; 贺健; 张生英; 包世俊【期刊名称】《《中国畜牧兽医》》【年(卷),期】2019(046)008【总页数】8页(P2228-2235)【关键词】滑液支原体(MS); 甘油磷酸二酯磷酸二酯酶(GDPD); 原核表达; 酶活性测定; 亚细胞定位【作者】胡荣斌; 邢小勇; 武小椿; 张阳阳; 贺健; 张生英; 包世俊【作者单位】甘肃农业大学动物医学院兰州730070【正文语种】中文【中图分类】S852.62滑液支原体(Mycoplasma synoviae,MS)是禽类的主要致病性支原体之一，其可导致鸡的急性或慢性感染，主要表现为渗出性滑膜炎、腱鞘炎及跗关节和脚垫肿胀[1]。

各日龄鸡均易感，4～16周龄鸡常见急性感染，成年鸡常为隐性感染[2-3]。

虽然MS感染很少直接导致病鸡死亡，但其一旦感染便很难根除，进而造成感染鸡生长发育迟滞，产蛋下降及免疫抑制，给养鸡业带来巨大经济损失。

近年来，MS感染在中国鸡群中蔓延迅速，相关疾病的发病率和经济影响日益增加。

由于该病应用药物难以根除，因此，研发可有效预防MS感染的疫苗势在必行。

甘油磷酸二酯磷酸二酯酶(GDPD)是生物体内磷脂代谢通路上的关键酶，能水解多种甘油磷酸二酯生成甘油-3-磷酸及相应醇，对原核生物和真核生物的多种生理进程起重要作用[4]。

近年来，由于 GDPD家族成员催化活性和生理功能的多样性，在哺乳动物中涉及信号转导、神经分化与发育、细胞骨架调控与成骨细胞分化及骨骼肌发育等[5]。

Corda等[6]报道，在流感嗜血杆菌中，GDPD催化甘油磷脂产生的胆碱又用于细菌脂多糖层的合成。

目前GDPD的研究在细菌和哺乳动物中报道较多，在MS中鲜有报道，因此，本研究拟对MS GDPD基因进行PCR扩增和原核表达，在制备多克隆抗体的基础上应用Western blotting对GDPD在MS内的分布进行初步定位，以期为进一步研究GDPD的生物学功能提供依据。

HPV23_L1蛋白的表达、纯化及活性鉴定

㊀第54卷第2期郑州大学学报(理学版)Vol.54No.2㊀2022年3月J.Zhengzhou Univ.(Nat.Sci.Ed.)Mar.2022收稿日期:2021-05-31基金项目:河南省高校科技创新团队计划项目(19IRTSTHN006)㊂第一作者:栗宁(1988 ),女,博士研究生,主要从事分子免疫学和免疫学检测技术研究,E-mail:815136892@㊂通信作者:王爱萍(1970 ),女,教授,主要从事分子免疫学和免疫学检测技术研究,E-mail:pingaw@㊂HPV23L1蛋白的表达㊁纯化及活性鉴定栗㊀宁,㊀陈玉梅,㊀周景明,㊀陈玉阁,㊀祁艳华,㊀殷佳佳,㊀李昱雅,㊀王爱萍(郑州大学生命科学学院㊀河南郑州450001)摘要:为了制备人乳头瘤病毒(human papillomavirus,HPV)23亚型的L1蛋白,结合大肠杆菌密码子偏好性,经密码子优化合成HPV23的L1蛋白编码区序列,并将其分别克隆至原核表达载体,成功构建了4种原核表达载体pET28a-23L1㊁pET30a-23L1㊁pET32a-23L1和pESUMO-23L1,随后转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,经SDS-PAGE 鉴定发现,pESUMO-23L1和pET32a-23L1均能表达可溶性重组蛋白,且pESUMO-23L1的可溶性表达量较高㊂利用Ni-NTA 亲和层析法纯化重组SUMO-23L1蛋白,纯度约为90%㊂血凝实验结果表明,重组SUMO-23L1蛋白具有类似天然病毒的血凝活性㊂关键词:人乳头瘤病毒23亚型;L1蛋白;原核表达;纯化中图分类号:Q786㊀㊀㊀㊀㊀文献标志码:A㊀㊀㊀㊀㊀文章编号:1671-6841(2022)02-0089-06DOI :10.13705/j.issn.1671-6841.2021224Expression ,Purification and Activity Identification ofHPV23L1ProteinLI Ning,CHEN Yumei,ZHOU Jingming,CHEN Yuge,QI Yanhua,YIN Jiajia,LI Yuya,WANG Aiping(School of Life Science ,Zhengzhou University ,Zhengzhou 450001,China )Abstract :In order to prepare the L1protein of human papillomavirus (HPV)23subtype,the coding re-gion of HPV23L1was synthesized through codon optimization combining the codon preference of E.coli and cloned into prokaryotic expression vectors.The four prokaryotic expression vectors,pET28a-23L1,pET30a-23L1,pET32a-23L1and pESUMO-23L1were constructed successfully.Subsequently,E.coliBL21(DE3)competent cells were transformed.The results of SDS-PAGE showed that the soluble re-combinant protein were expressed both in pESUMO-23L1and pET32a-23L1,and the soluble expression level of pESUMO-23L1was higher.The purity of recombinant SUMO-23L1protein was about 90%after purification by Ni-NTA affinity chromatography.The results of hemagglutination test showed that the re-combinant SUMO-23L1protein had hemagglutination activity similar to that of natural virus.Key words :human papillomavirus 23subtype;L1protein;prokaryotic expression;purification0㊀引言目前已经有300多种人乳头瘤病毒(human papillomavirus,HPV)被鉴定[1]㊂HPV 可分为α属㊁β属等㊂其中,α属HPV 也被称为黏膜HPV,主要感染生殖器和黏膜,导致良性皮肤疣和其他疾病;β属HPV 主要侵染部位是皮肤[2]㊂HPV23是最常见的β属HPV,其基因组是由7.3kb 的环状双链DNA 组成[3]㊂HPV 主要衣壳蛋白L1是可自组装的病毒样颗粒(VLPs)[4],具有类似天然病毒的血凝活性,是预防性疫苗研究的主要靶点[5]㊂研究发现,HPV23与皮肤鳞状细胞癌㊁非黑色素瘤皮肤癌㊁眼汗管瘤㊁乳腺癌㊁基底细胞癌㊁疣状表皮发育不良㊁郑州大学学报(理学版)第54卷非生殖性脂溢性角化病等有关[6]㊂目前,关于HPV23亚型L1蛋白的研究还比较少㊂本文尝试构建带有不同融合标签的原核表达载体,分析重组蛋白HPV23L1的表达情况及活性,旨在筛选HPV23L1蛋白高表达菌株,为HPV23亚型L1蛋白的结构和功能研究奠定基础㊂1㊀材料和方法1.1㊀菌种与载体pUC57-HPV23L1由上海生工生物工程有限公司合成;大肠杆菌感受态细胞DH5α㊁BL21来自TaKaRa 公司;原核表达载体pET28a㊁pET30a㊁pET32a和pESUMO 均由郑州大学生命科学学院分子免疫实验室保存㊂1.2㊀重组表达载体的构建1.2.1㊀目的基因及引物的设计与合成㊀根据NCBI 网站公布的HPV23L1蛋白序列(GenBank.ARA 71354.1)及大肠杆菌的密码子偏好性,利用生物信息学软件优化并送至上海生工生物工程有限公司合成HPV23L1基因㊂分别在其5 末端与3 末端加入Eco R I㊁Bas I㊁Xho I限制性酶切位点,设计合成相应的引物,引物列表如表1所示㊂表1㊀引物列表Table1㊀Primers list引物名称酶切位点引物序列(5 -3 )扩增片段/bp F-23-A Eco R I CGCGAATTCATGACCCTGTGGCTGCF-23-B Bas I TTGGTCTCTAGGTATGACCCTGTGGCTGC1521 R-23Xho I CCGCTCGAGTTACAGCTGCACTTTTTTACGTT1.2.2㊀重组蛋白的生物信息学分析及表达策略㊀用DNASTAR软件对HPV23L1蛋白二级结构及其亲水性和疏水性进行分析,选择pET28a(Kan+)㊁pET30a(Kan+)㊁pET32a(Amp+)和pESUMO(Amp+)用于构建原核表达载体㊂pET28a㊁pET30a和pET32a分别用Eco R I/Xho I进行双酶切,pESUMO 用Bas I/Xho I进行双酶切,回收双酶切产物,与含对应酶切位点的引物进行目的基因PCR扩增,再进行双酶切回收后的产物连接,构建HPV23L1蛋白重组表达载体,分别转化大肠杆菌感受态细胞DH5α,从经菌液PCR鉴定的阳性菌株中提取质粒,通过双酶切鉴定及测序,最终获得HPV23L1蛋白的4种带有不同融合标签的重组表达载体㊂重组表达载体构建策略如图1所示㊂1.3㊀重组表达载体的初步表达与鉴定将pET28a-23L1㊁pET30a-23L1㊁pET32a-23L1㊁pESUMO-23L1这4种重组表达载体阳性质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,挑取阳性克隆,经菌液PCR获得4种重组表达菌pET28a-23L1-BL21㊁pET30a-23L1-BL21㊁pET32a-23L1-BL21和pESUMO-23L1-BL21㊂将4种重组表达菌按1ʒ1000接种在加有Amp+或Kan+抗性的5mL LB液体培养基中,37ħ摇床上220r/min过夜培养,以活化菌种;过夜活化的菌种再按1ʒ100接种于相应抗性的5mL LB液体培养基中,37ħ㊁220r/min培养至OD600约为0.6㊂加入0.3mmol/L的诱导剂IPTG, 16ħ㊁220r/min诱导18h㊂经12%SDS-PAGE鉴图1㊀重组表达载体构建策略Figure1㊀The construction strategy of recombinantexpression vector定,分析重组蛋白的表达情况㊂1.4㊀重组蛋白的可溶性分析诱导剂IPTG的浓度为0.3mmol/L,16ħ㊁220r/min诱导表达18h后收集表达菌体,4ħ㊁12000r/min离心2min,收集菌体,用5mL pH7.4的PBS重悬菌体㊂经超声破碎后4ħ㊁12000r/min 离心10min,得到超声上清液和超声沉淀,通过09㊀第2期栗㊀宁,等:HPV23L1蛋白的表达㊁纯化及活性鉴定12%SDS-PAGE分析重组目的蛋白的可溶性㊂1.5㊀重组蛋白的纯化及鉴定根据1.4小节的结果,选择高表达菌株进行后续实验㊂诱导剂IPTG浓度为0.3mmol/L,16ħ诱导表达18h后收集菌体,用pH8.0的含有250mmol/L NaCl的50mmol/L Tris-HCl缓冲液重悬菌体后超声破碎,取上清液,选择Ni-NTA亲和层析法纯化重组蛋白㊂用咪唑浓度梯度法(Wash Buffer,pH8.0的含有250mmol/L NaCl的50mmol/L Tris-HCl缓冲液+20mmol/L咪唑;Elution Buffer,pH 8.0的含有250mmol/L NaCl的50mmol/L Tris-HCl 缓冲液+200mmol/L咪唑)进行洗脱,纯化后收集各组分,用12%SDS-PAGE和Western blot进行鉴定㊂1.6㊀重组蛋白的活性分析与鉴定1.6.1㊀同源建模㊀利用SWISS-MODEL软件对HPV23L1蛋白进行同源建模,预测HPV23L1蛋白三维结构㊂1.6.2㊀血凝实验㊀取96孔微型血凝反应板,第1孔到第8孔均用25μL PBS铺底㊂吸取25μL纯化的HPV23L1重组蛋白加入第1孔,充分混匀后进行2倍倍比稀释,一直倍比稀释至第5孔,在第6㊁7㊁8孔中分别加入25μL PBS设置为阴性对照㊂将25μL1%小鼠红细胞悬液从第8孔倒加至第1孔,震荡混匀,室温静置40min,拍照并记录实验结果㊂2㊀实验结果分析2.1㊀重组表达载体的构建重组表达载体的菌液PCR及双酶切鉴定结果如图2所示㊂重组表达载体构建成功后,经菌液PCR鉴定发现,扩增产物条带出现在大约1521bp (图2A㊁2B㊁2C);Eco R I/Xho I或Bas I/Xho I双酶切鉴定显示重组表达载体构建成功(图2D)㊂将阳性质粒测序结果与合成的HPV23L1序列进行比对分析,结果显示,两序列完全一致,说明pET28a-23L1㊁pET30a-23L1㊁pET32a-23L1㊁pESUMO-23L1这4种重组表达载体构建成功㊂A为pET28a-23L1㊁pET30a-23L1的菌液PCR鉴定(M:Marker;1~5:pET28a-23L1扩增产物;6~10:pET30-23L1扩增产物);B为pET32a-23L1的菌液PCR鉴定(M:Marker;11~13:pET32a-23L1扩增产物);C为pESUMO-23L1的菌液PCR鉴定(M:Marker;1~5:pESUMO-23L1扩增产物);D为重组表达载体的双酶切鉴定(M:Marker;1:pET30a-23L1;2:pET30a空载;3:pET32a-23L1;4:pET28a-23L1;5:pESUMO-23L1)㊂图2㊀重组表达载体的菌液PCR及双酶切鉴定Figure2㊀The identification of recombinant expression vector by PCR and double enzyme digestion19郑州大学学报(理学版)第54卷2.2㊀原核表达载体的诱导表达及初步鉴定SDS-PAGE鉴定重组蛋白L1的表达情况如图3所示㊂经生物信息学预测发现,重组HPV23L1蛋白的相对分子质量约为57400,具有较多亲水性区域(图3A)㊂将4种重组表达菌pET28a-23L1-BL21㊁pET30a-23L1-BL21㊁pET32a-23L1-BL21和pESUMO-23L1-BL21进行诱导表达,经12%SDS-PAGE鉴定,结果显示,pET28a-23L1(HIS-23L1融合蛋白)和pET30a-23L1(HIS-S-23L1融合蛋白)几乎无目的蛋白表达,而pESUMO-23L1(SUMO-23L1)和pET32a-23L1(TRX-23L1)表达产物在大约80kD处有目的条带(图3B)㊂A为HPV23L1蛋白的二级结构;B为原核表达载体的诱导表达(M:Marker;1:pET32a-23L1未加诱导剂IPTG的对照;2:pET32a-23L1诱导表达产物;3:pET28a-23L1诱导表达产物;4:pET30a-23L1诱导表达产物;5:pESUMO-23L1未加诱导剂IPTG的对照;6:pESUMO-23L1诱导表达产物)㊂图3㊀SDS-PAGE鉴定重组蛋白L1的表达情况Figure3㊀The expression of recombinant protein L1identified by SDS-PAGE2.3㊀重组蛋白HPV23L1的可溶性分析诱导剂IPTG浓度为0.3mmol/L,16ħ诱导表达18h后收集pESUMO-23L1及pET32a-23L1的表达菌体,PBS重悬后经超声破碎处理,上清液和沉淀分别用12%SDS-PAGE进行鉴定㊂HPV23L1重组蛋白的可溶性分析及Western blot鉴定结果如图4所示㊂结果显示,pESUMO-23L1和pET32a-23L1的超声上清液和沉淀在大约80kD的位置均存在蛋白条带(SU-MO-23L1蛋白或TRX-23L1蛋白),而重组SUMO-23L1蛋白表达量整体高于TRX-23L1蛋白(图4A㊁4B);重组SUMO-23L1蛋白或TRX-23L1蛋白均可与HIS单抗发生反应(图4C㊁4D)㊂2.4㊀重组蛋白HPV23L1的纯化在pH8.0的含有250mmol/L NaCl的50mmol/L Tris-HCl缓冲液条件下,用Ni-NTA亲和层析法纯化重组SUMO-23L1蛋白,经12%SDS-PAGE鉴定,重组蛋白的纯化结果如图5所示㊂结果表明,纯化后目的蛋白的纯度约为90%㊂2.5㊀重组蛋白HPV23L1的活性鉴定利用SWISS-MODEL软件对HPV23L1蛋白进行同源建模,HPV23L1蛋白同源建模及重组蛋白血凝活性鉴定结果如图6所示㊂可以看出,HPV23 L1蛋白单体结构(图6A)和五聚体结构(图6B)与参考序列牛乳突瘤病毒(bovine papillomavirus type1,29㊀第2期栗㊀宁,等:HPV23L1蛋白的表达㊁纯化及活性鉴定㊀㊀A ~B 为SDS-PAGE(M:Marker;1:pET32a-23L1超声上清液;2:pET32a-23L1超声沉淀;3:pESUMO-23L1超声上清液;4:pESUMO-23L1超声沉淀);C ~D 为Western blot(5:pET32a-23L1超声上清液;6:pESUMO-23L1超声上清液)㊂图4㊀HPV23L1重组蛋白的可溶性分析及Western blot 鉴定Figure 4㊀Solubility analysis and Western blot identification of HPV23L1recombinantproteinM:Marker;1~2:纯化的SUMO-23L1蛋白㊂图5㊀SDS-PAGE 鉴定重组蛋白的纯化结果Figure 5㊀The purification results of recombinantprotein identified bySDS-PAGEA 为HPV23L1蛋白单体结构;B 为HPV23L1蛋白五聚体结构;C 为BPV1L1蛋白结构(PDB:3iyj);D 为重组蛋白血凝活性鉴定(1和2为重复实验,其中1ʒ2~1ʒ32为纯化的SUMO-23L1蛋白2倍倍比稀释的结果;PBS 为阴性对照)㊂图6㊀HPV23L1重组蛋白同源建模及血凝活性鉴定Figure 6㊀The homologous modeling and hemagglutinationactivity of HPV23L1recombinant proteinBPV1)的L1蛋白(PDB:3iyj)结构相似(图6C),二者序列同源性为49.39%㊂血凝实验结果显示,重组SUMO-23L1蛋白有凝集小鼠红细胞的能力(图6D),说明本研究制备的重组HPV23L1蛋白具有较高的活性㊂3㊀讨论目前商品化的HPV 疫苗主要基于用杆状病毒表达的HPV16㊁HPV18等α属高危型HPV 的L1蛋白[7-8]㊂有许多研究者利用GST 融合标签或者GST融合标签与伴侣蛋白共表达,成功实现α属高危型HPV L1蛋白在大肠杆菌中的可溶性表达[9-10];也有研究者利用SUMO 融合标签在原核表达系统中制备HPV16㊁HPV18等α属高危亚型HPV 的L1蛋白[11-12]㊂本研究主要通过构建4种原核重组表达载体pET28a-23L1㊁pET30a-23L1㊁pET32a-23L1和pESUMO-23L1,分析不同融合标签对重组蛋白表达情况的影响㊂经SDS-PAGE 分析发现,重组表达后,pET32a-23L1和pESUMO-23L1在大约80kD 处有一条明显的条带,比预测理论值(70kD)偏大,推测可能是由于标签中6个连续的带正电荷的碱性氨基酸造成HIS-tag 融合蛋白在SDS-PAGE 中迁移速率变慢[12]㊂随后的Western blot 鉴定结果也证实了80kD 处为重组目的蛋白㊂pET32a-23L1和pESUMO-23L1均有可溶性表达,且pESUMO-23L1的可溶性表达量较高,这与本课题组前期研究结果[12]一致㊂此外,用HIS 单抗进行Western blot 检测时发39郑州大学学报(理学版)第54卷现,pET32a-23L1和pESUMO-23L1均在约45kD处有一条明显的条带,推测可能是由于重组蛋白分子部分降解引起的㊂通过SWISS-MODEL软件同源建模发现,HPV23L1蛋白与BPV1L1蛋白的序列同源性为49.39%,并且HPV23L1蛋白与参考序列BPV1L1蛋白(PDB:3iyj)的结构极其相似,也可以形成五聚体结构㊂经血凝实验证实,该重组蛋白具有凝集小鼠红细胞的能力,说明所获得的HPV23L1蛋白具有较高的活性,为进一步研究HPV23L1蛋白的结构和功能奠定基础㊂参考文献:[1]㊀LI N,ZHANG G P,CHEN Y M,et al.Identification ofthe mimotopes within the major capsid protein L1of hu-man papillomavirus types18and45,using neutralizingmonoclonal antibodies[J].International journal of biolog-ical macromolecules,2021,174:587-595. [2]㊀KONING M N C,STRUIJK L,BAVINCK J N B,et al.Betapapillomaviruses frequently persist in the skin ofhealthy individuals[J].Journal of general virology,2007,88(5):1489-1495.[3]㊀ATKINSON K,BISHOP L,RHODES G,et al.Genomesequence of human papillomavirus23strain HPV-23/lan-caster/2015[EB/OL].[2020-12-21].https:ʊwww.re-/publication/317074600.[4]㊀WANG D N,LIU X L,WEI M X,et al.Rational designof a multi-valent human papillomavirus vaccine by cap-somere-hybrid co-assembly of virus-like particles[EB/OL].[2020-12-21].https:ʊ/articles/s41467-020-16639-1.[5]㊀CHEN Y M,LIU Y C,ZHANG G P,et al.Human pap-illomavirus L1protein expressed in Escherichia coli self-assembles into virus-like particles that are highly immuno-genic[J].Virus research,2016,220:97-103. [6]㊀MÜHR L S A,HULTIN E,DILLNER J.Transcription ofhuman papillomaviruses in nonmelanoma skin cancers ofthe immunosuppressed[J].International journal of canc-er,2021,149(6):1341-1347.[7]㊀YANG Y,CHE Y X,ZHAO Y,et al.Prevention andtreatment of cervical cancer by a single administration ofhuman papillomavirus peptide vaccine with CpG oligode-oxynucleotides as an adjuvant in vivo[J].Internationalimmunopharmacology,2019,69:279-288. [8]㊀MOREIRA E D,GIULIANO A R,DE HOON J,et al.Safety profile of the9-valent human papillomavirus vac-cine:assessment in prior quadrivalent HPV vaccine re-cipients and in men16to26years of age[J].Humanvaccines&immunotherapeutics,2018,14(2):396-403.[9]㊀BANG H B,LEE Y H,LEE Y J,et al.High-level pro-duction of human papillomavirus(HPV)type16L1inEscherichia coli[J].Journal of microbiology and biotech-nology,2016,26(2):356-363.[10]PAN D,ZHA X,YU X H,et al.Enhanced expressionof soluble human papillomavirus L1through coexpressionof molecular chaperonin in Escherichia coli[J].Proteinexpression and purification,2016,120:92-98. [11]陈玉梅.人乳头瘤病毒16亚型(HPV16)亚单位疫苗的初步研究[D].郑州:郑州大学,2017.CHEN Y M.Preliminary study on human papillomavirussubtype16(HPV16)subunit vaccine[D].Zhengzhou:Zhengzhou University,2017.[12]WANG A P,LI N,ZHOU J M,et al.Mapping the Bcell epitopes within the major capsid protein L1of humanpapillomavirus type16[J].International journal of bio-logical macromolecules,2018,118:1354-1361.49。

某大学生物工程学院《生物化学》考试试卷(1312)

某大学生物工程学院《生物化学》课程试卷（含答案）__________学年第___学期考试类型：（闭卷）考试考试时间：90 分钟年级专业_____________学号_____________ 姓名_____________1、判断题（95分，每题5分）1. 一个细菌只有一条双链DNA，人的一个染色体含有46条双链DNA。

（）[山东大学2016研]答案：错误解析：人的一个体细胞含有46条双链DNA，一个染色体仅含有1条双链DNA。

2. 沿糖酵解途径简单逆行，可从丙酮酸等小分子前体物质合成葡萄糖。

（）答案：错误解析：3. 腺嘌呤核苷酸循环不能脱去氨基。

（）[中国科学院水生生物研究所2013研]答案：错误解析：腺嘌呤核苷酸在腺苷酸脱氨酶作用下脱掉氨基又生成次黄嘌呤核苷酸。

4. 嘧啶核苷酸从头合成途径中的关键酶是天冬氨酸转氨甲酰酶（ATCase），它是一个变构酶。

（）答案：正确解析：5. 脂肪酸合成和β氧化过程底物的转运都需要柠檬酸穿梭系统。

（）答案：错误解析：脂肪酸β氧化过程，需要脂酰CoA向线粒体转运，长链脂酰CoA分子不能直接跨过线粒体内膜，需要借助肉碱穿梭系统进行转运。

6. 参与尿素循环的酶都位于线粒体内。

（）答案：错误解析：尿素循环中主要有5个酶的参与，其中氨甲酰磷酸合酶和鸟氨酸转氨甲酰酶存在于线粒体中，另外三个精氨琥珀酸合成酶、精氨琥珀酸裂解酶、精氨酸酶则位于细胞质中。

7. 基因转录的终止信号应位于被转录的序列以外的下游区。

（）答案：错误解析：8. 在生物圈内，能量只能从光养生物到化养生物，而物质却能在这两类生物之间循环。

（）答案：正确解析：9. 滚环复制不需要RNA作为引物。

（）答案：错误解析：滚环复制的后随链合成仍然需要RNA引物。

10. 高能磷酸键只能通过氧化磷酸化生成。

（）答案：错误解析：除了呼吸链的氧化磷酸化以外，底物水平磷酸化和代谢底物分子内能量的重新分布也都可以产生ATP。

11. 在丙酮酸经糖异生作用代谢中，不会产生NAD＋。

某理工大学《普通生物化学》考试试卷(5404)

某理工大学《普通生物化学》课程试卷（含答案）__________学年第___学期考试类型：（闭卷）考试考试时间：90 分钟年级专业_____________学号_____________ 姓名_____________1、判断题（275分，每题5分）1. α淀粉酶水解糖原的产物是混合物。

（）[华南师范大学2004研]答案：正确解析：α淀粉酶广泛地存在于动植物和微生物中，它是一种内切葡糖苷酶，随机作用于淀粉链内部的α1,4糖苷键。

α淀粉酶降解直链淀粉时生成葡萄糖、少量麦芽糖和麦芽三糖；降解支链淀粉或糖原，最终产物是葡萄糖、麦芽糖、麦芽三糖和α糊精。

2. 真核细胞内参与嘧啶核苷酸从头合成的酶都位于细胞质。

（）答案：错误解析：真核细胞参与嘧啶从头合成的二氢乳清酸脱氢酶位于线粒体内。

3. 一个蛋白质样品经酸水解后，能用氨基酸自动分析仪准确测定它的所有氨基酸。

（）答案：错误解析：酸水解时色氨酸和部分羟基氨基酸被破坏，谷氨酰胺和天冬酰胺分别变成谷氨酸和天冬氨酸，胱氨酸变成半胱氨酸，而半胱氨酸与茚三酮不发生颜色反应。

4. 凡有抑制剂存在都会降低酶与底物的亲和力。

（）答案：错误解析：非竞争性抑制剂和反竞争性抑制不会降低酶与底物的亲和力。

5. DNA复制时，前导链只需1个引物，滞后链则需多个引物。

（）答案：正确解析：滞后链的复制是不连续的，由多个冈崎片段组成，每个冈崎片段的复制都需要引物。

6. 蚕豆病是由于蚕豆中的物质抑制了人体6磷酸葡萄糖脱氢酶活性所致。

（）[复旦大学2009研]答案：错误解析：红细胞6磷酸葡萄糖脱氢酶显著缺乏所致的一组遗传性溶血性疾病，部分病例食用蚕豆后发病，俗称蚕豆病。

7. 脂肪酸经活化后进入线粒体内进行β氧化，需经脱氢、脱水、加氢和硫解等四个过程。

（）答案：错误解析：脂酰CoA的β氧化第一次脱氢后是加水过程。

加水后再脱氢，然后硫解生成乙酰CoA和比原来少两个碳原子的脂酰CoA。

8. ATP为GMP的合成提供能量，GTP为AMP的合成提供能量，缺乏ATP和GTP中的任何一种都会影响另一种的合成。

生物化学答案

生物化学答案第一章三、简答题1、写出a-氨基酸的结构通式，并根据其结构通式说明其结构上的共同特点。

组成蛋白质的氨基酸共有20种，除甘氨酸（无手性C原子）外都是L型氨基酸，就是都有一个不对称C原子，具有旋光性。

羧基和氨基连在同一个C原子上，另外两个键分别连一个H和R基团。

脯氨酸是亚氨基酸。

2、在PH6.0时，对Gly,Ala,Glu,Lys,Leu和His混合电泳，哪些氨基酸移向正极？哪些移向负极？哪些不移动或接近原点？3、什么是蛋白质的空间结构？蛋白质的空间结构与其生物功能有何关系？答：RNASE是一种水解RNA的酶，由124个氨基酸残基组成的单肽链蛋白质，其中含有4个链内二硫键。

整个分子折叠成球形的天然构象。

高浓度脲会破坏肽链中的次级键。

巯基乙醇可还原二硫键。

因此用脲和巯基乙醇处理RNaSe；蛋白质三维构象破坏，肽链去折叠成松散肽链，活性丧失。

淡一级结构并未变化。

除去脲和巯基乙醇，并经氧化形成二硫键。

RNaSe重新折叠，活性逐渐恢复。

由此看来，在一级结构未改变的状况下，其生物功能仍旧发生变化，说明是蛋白质的高级结构决定了蛋白质的功能。

（1）一级结构的变异与分子病蛋白质中的氨基酸序列与生物功能密切相关，一级结构的变化往往导致蛋白质生物功能的变化。

如镰刀型细胞贫血症，其病因是血红蛋白基因中的一个核苷酸的突变导致该蛋白分子中β-链第6位谷氨酸被缬氨酸取代。

这个一级结构上的细微差别使患者的血红蛋白分子容易发生凝聚，导致红细胞变成镰刀状，容易破裂引起贫血，即血红蛋白的功能发生了变化。

（2）一级结构与生物进化同源蛋白质中有许多位置的氨基酸是相同的，而其它氨基酸差异较大。

如比较不同生物的细胞色素C的一级结构，发现与人类亲缘关系接近，其氨基酸组成的差异越小，亲缘关系越远差异越大。

4、以细胞色素C为例简述蛋白质一级结构与生物进化的关系。

一级结构与生物进化同源蛋白质中有许多位置的氨基酸是相同的，而其它氨基酸差异较大。

某大学生物工程学院《生物化学》考试试卷(174)

某大学生物工程学院《生物化学》课程试卷（含答案）__________学年第___学期考试类型：（闭卷）考试考试时间：90 分钟年级专业_____________学号_____________ 姓名_____________1、判断题（100分，每题5分）1. 高能磷酸键只能通过氧化磷酸化生成。

（）答案：错误解析：除了呼吸链的氧化磷酸化以外，底物水平磷酸化和代谢底物分子内能量的重新分布也都可以产生ATP。

2. DNA的复制过程同时需要DNA聚合酶和RNA聚合酶参与。

（）[浙江大学2010研]答案：正确解析：DNA复制时需要RNA引物，RNA引物由RNA聚合酶合成。

3. 如果在DNA连接酶比正常水平高5倍的大肠杆菌中快速标记新合成的DNA，那么从这种突变株中得到的冈崎片段比从通常的野生型得到的冈崎片段要长。

（）答案：正确解析：4. 丙酮酸脱氢酶复合体与α酮戊二酸脱氢酶复合体有相同的辅因子。

（）答案：正确解析：5. 生物体编码20种氨基酸的密码子数共有64个。

（）[山东大学2017研]答案：错误解析：生物体编码20种氨基酸的密码子数为61个，还有三个为终止密码子，不编码任何氨基酸。

6. 体内嘌呤核苷酸和嘧啶核苷酸的从头合成场所主要是肝脏组织。

（）答案：正确解析：7. 线粒体DNA的复制需要使用DNA引物。

（）答案：错误解析：线粒体DNA为双链环状分子（纤毛虫的线粒体DNA除外），其复制方式为D环式，复制的引物为RNA。

8. 反密码子GAA只能辨认密码子UUC。

（）答案：错误解析：9. 所有核酸的复制都是在碱基互补配对的原则下进行。

（）答案：正确解析：10. 催化三磷酸核苷如ATP等分子中的磷酰基转移到受体上的酶均为激酶。

（）答案：正确解析：11. 利用限制性片段长度多态性可构建基因组的物理图谱。

（）答案：正确12. 线粒体内以FAD作为辅基的脱氢酶产生的FADH2经复合体Ⅱ进入呼吸。

（）答案：错误解析：13. 新陈代谢是生命的重要特征，新陈代谢一旦停止生物就会死亡。

葡萄糖胺-6-磷酸合成酶的异源表达及其酶学性质表征

第 35 卷第 3 期
王涛等：葡萄糖胺-6-磷酸合成酶的异源表达及其酶学性质表征
501
同功能的结构域组成：转氨酶结构域和异构酶结构域[4-5]。通过抑制葡萄糖胺-6-磷酸合成酶的活性，能够导致相关糖蛋白及几丁质的生物合成受阻，致使致病菌无法合成细胞壁而死亡[6]。但在哺乳动物中，该酶被抑制短时间内不会对个体造成严重的伤害，其所造成的结果因组织不同而异。因此， GFA 也被认为将成为抗细菌和抗真菌新药研发中极具前景的潜在靶点[7-8]。
WANG Tao1, FENG Jun-rui1, LI Shu-xuan1, DU Xiang1, LIU Xiao-huan1, WU Mian-bin2 (1. School of Biological Science, Jining Medical University, Rizhao 276826, China; 2. Key Laboratory of Biomass Chemical Engineering of Ministry of Education,
的应用提供基础。
2 实验部分
2.1 试剂与仪器
(1) 本实验使用的菌种主要有：实验室保藏的大肠杆菌 BL21(DE3) Codon plus，大肠杆菌 DH5α 白色念珠菌(Candida albicans ATCC 64548)。
(2) 主要试剂有：1 mmolL1 的 GLUPA(γ-谷氨酰对硝基苯胺)；pH 7.2 的磷酸盐(PBS)缓冲液； LB(Luria-Bertani)培养基(pH 7.2，胰化蛋白胨 10 gL1、酵母提取物 5 gL1 和 NaCl 10 gL1)；对硝基苯胺 (天津大茂化学试剂厂)；Bacilysin(实验室保存)。质粒提取试剂盒(Solarbio，D1100)，琼脂糖凝胶回收试剂盒(Omega，D2500-01)。 2.2 实验过程 2.2.1 对硝基苯胺标准曲线的绘制

某大学生物工程学院《生物化学》考试试卷(3535)

某大学生物工程学院《生物化学》课程试卷（含答案）__________学年第___学期考试类型：（闭卷）考试考试时间：90 分钟年级专业_____________学号_____________ 姓名_____________1、判断题（95分，每题5分）1. fMettRNAmefMet与MettRNAmMet的合成由同一种氨酰tRNA合成酶催化。

（）答案：正确解析：fMettRNAfMet与MettRNAmMet的合成由同一种氨酰tRNA合成酶催化。

2. ATP在高能化合物中占有特殊的地位，起着共同中间体的作用。

（）答案：正确解析：3. 缺氧条件下丙酮酸还原为乳酸的意义是使NAD＋再生。

（）答案：正确4. 单细胞生物体内的端粒酶活性比多细胞生物中体细胞内的端粒酶活性高。

（）答案：正确解析：单细胞生物体内的端粒酶活性很高，否则将导致物种灭绝。

5. 在NDP转变为脱氧核糖核苷二磷酸（dNDP）的过程中硫氧还蛋白和谷氧还蛋白起电子载体的作用。

（）答案：正确解析：6. 嘌呤核苷酸和嘧啶核苷酸的生物合成过程相同，即先合成碱基再与磷酸核糖连接生成核苷酸。

（）答案：错误解析：7. 琥珀酸脱氢酶是三羧酸循环中唯一掺入线粒体内膜的酶。

（）答案：正确8. 缩短磷脂分子中层脂酸的碳氢链可增加细胞膜的流动性。

（）[山东大学2016研]答案：正确解析：磷脂分子中脂酸的碳氢链长与细胞膜的流动性相关，碳氢链越长，细胞膜的流动性增加。

9. 蛋白质合成过程中，mRNA由3′端向5′端进行翻译。

（）答案：错误解析：10. 线粒体DNA的复制需要使用DNA引物。

（）答案：错误解析：线粒体DNA为双链环状分子（纤毛虫的线粒体DNA除外），其复制方式为D环式，复制的引物为RNA。

11. DNA复制时，前导链按5′→3′合成，滞后链则按3′→5′合成。

（）[厦门大学2015研]答案：错误解析：DNA复制时，以5′→3′走向为模板的一条链合成方向为5′→3′，与复制叉方向一致，称为前导链；另一条以5′→3′走向为模板链的合成链走向与复制叉移动的方向相反，称为滞后链，其合成是不连续的，先形成许多不连续的片段（冈崎片段），最后连成一条完整的DNA链，前导链与滞后链的合成方向都是5′→3′。

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５３０　技术通讯…２０　Ｎｏ．－ｔ　１　２００９ＲＳ　ＩＮ　ＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ　Ｖｏｌ　２０　４　Ｊｕｌｙ，２０ｌｙ．）　Ｕ　ｒｒｒＥ　·　

ｄｏｉ：１０．３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ．１００９—０００２．２００９．０４．０２２　研究报告　合成利巴韦林的关键酶瞟呤核苷磷酸化酶的原核表达及活性分析　邢晨光，吴飞，王光路，谢希贤，徐庆阳，陈宁　天津科技大学生物工程学院，天津３００４５７　

［摘要］　目的：在枯草芽孢杆菌中表达嘌呤核苷磷酸化酶（ＰＮＰａｓｅ）并分析其活性。方法：将ＰＮＰａｓｅ的编码基因ｄｅｏＤ克隆　入ｐＤＧ１４８表达载体，构建原核穿梭型表达载体ｐＤＧ１４８一ｄｅｏＤ，采用电转化方法将表达载体转入枯草芽孢杆菌ＷＢ６００后　诱导表达重组ＰＮＰａｓｅ；研究重组ＰＮＰａｓｅ的活性。结果与结论：获得的重组ＰＮＰａｓｅ活性较对照提高了１９３．９％，其最适催化　条件为６５℃、ｐＨ７．５、５００　Ｉｘｍｏｌ／Ｌ底物浓度和１％１，２，４一三氮唑一３一羧甲酰胺；对重组菌的发酵条件进行了初步优化，ＩＰＴＧ　诱导６　ｈ后在发酵液中添加０．５％的＿ｒＷｅｅｎ一８０能大幅度提高重组ＰＮＰａｓｅ的酶活力。　［关键词］　嘌呤核苷磷酸化酶；原核表达；活性分析；利巴韦林　［中图分类号】Ｑ７８　［文献标识码］　Ａ　［文章编号］　１００９一ｏ００２（２００９）０４—０５３Ｏ一０４　

Ｐｒｏｋａｒｙｏｔｉｃ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ａｎｄ　Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ　Ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　Ｐｕｒｉｎｅ　Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ　Ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｓｅ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｋｅｙ　Ｅｎｚｙｍｅ　ｆｏｒ　Ｒｉｂａｖｉｒｉｎ　Ｐｒｏｄｕｃｅｄ　

ＸＩＮＧ　Ｃｈｅｎ－Ｇｕａｎｇ，ＷＵ　Ｆｅｉ，ＷＡ　ＮＧ　Ｇｕａｎｇ－Ｌｕ，ＸＩＥ　Ｘｉ－Ｘｉａｎ，ＸＵ　Ｑｉｎｇ－Ｙａｎｇ，ＣＨＥＮ　Ｎｉｎｇ　Ｃｏｌｌｅｇｅ　ｏｆ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｔｉａｎｊｉｎ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｏｆ　Ｓｃｉｅｎｃｅ　ａｎｄ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｔｉａｎｊｉｎ　３００４５７，Ｃｈｉｎａ　

［Ａｂｓｔｒａｃｔ］Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ：Ｔｏ　ｅｘｐｒｅｓｓ　ｐｕｒｉｎｅ　ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ　ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｓｅ（ＰＮＰａｓｅ）ｉｎ　Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｕｂｔｉｌｉｓ　ａｎｄ　ｔｏ　ａｎａｌｙｚｅ　ｉｔｓ　ａｃｔｉｖｉｔｙ．　Ｍｅｔｈｏｄｓ：Ｔｈｅ　ｇｅｎｅ　ｄｅｏＤ　ｅｎｃｏｄｉｎｇ　ＰＮＰａｓｅ　ｗａｓ　ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ　ａｎｄ　ｃｌｏｎｅｄ　ｉｎｔｏ　ｖｅｃｔｏｒ　ｐＤＧ１４８，　ａｎｄ　ｔｈｅ　ｐｒｏｋａｒｙｏｔｉｃ　ｓｈｕｔｔｌｅ　ｖｅｃｔｏｒ　ｐＤＧ１４８－ｄｅｏＤ　ｗａｓ　ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄ　ａｎｄ　ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ　ｔｏ　Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ　ＷＢ６００，ａｎｄ　ｔｈｅ　ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　ＰＮＰａｓｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｗａｓ　ｉｎｄｕｃｅｄ．Ｔｈｅ　ａｃｔｉｖｉｔｙ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　ＰＮＰａｓｅ　ｗａｓ　ａｎａｌｙｚｅｄ　ｂｙ　ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ　ａｎｄ　ｐＨ　ｐｅｒｔｕｒｂａｔｉｏｎ　ｄｉｆｅｒｅｎｃｅ　ｓｐｅｃｔｒａ．Ｒｅ－　ｓｕｉｔｓ　ａｎｄ　Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ：Ｔｈｅ　ｒｅｓｕｌｔｓ　ｓｈｏｗｅｄ　ｔｈａｔ　ｔｈｅ　ｅｎｚｙｍｅ　ａｃｔｉｖｉｔｙ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　ＰＮＰａｓｅ　ｗａｓ　ｉｎｃｒｅａｓｅｄ　ｂｙ　１９３．９％．　ａｎｄ　ｔｈｅ　ｏｐｔｉｍｕｍ　ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ　ｗａｓ　６５℃。ｔｈｅ　ｏｐｔｉｍｕｍ　ｐＨ　Ｗａｓ　７．５，ｔｈｅ　ｏｐｔｉｍｕｍ　ｓｕｂｓｔｒａｔｅ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ　ｗａｓ　５００　Ｕｍ０Ｌ／Ｌ　ａｎｄ　ｔｈｅ　ｏｐｔｉｍｕｍ　ｆｏｒｍａｍｉｄｅ　ｗａｓ　１％．Ｔｈｅ　ｅｎｚｙｍｅ　ａｃｔｉｖｉｔｙ　ｏｆ　ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　ＰＮＰａｓｅ　ｗａｓ　ｉｎｃｒｅａｓｅｄ　ｗｉｔｈ　Ｔｗｅｅｎ一８０　ｔｒｅａｔｍｅｎｔ　ａｆｔｅｒ　ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　ｂａｃｔｅｒｉａ　ｗａｓ　ｉｎｄｕｃｅｄ　ｂｙ　ｔｈｅ　ａｄｄｉｔｉｏｎ　ｏｆ　ＩＰＴＧ．　［Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ］ｐｕｒｉｎｅ　ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ　ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｓｅ；ｐｒｏｋａｒｙｏｔｉｃ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ；ｅｎｚｙｍｅ　ａｃｔｉｖｉｔｙ　ａｎａｌｙｓｉｓ；ｒｉｂａｖｉｆｉｎ　

利巴韦林是一种广谱抗病毒药物，对ＤＮＡ和ＲＮＡ病毒均　有抑制作用１　７１，被广泛用于医约领域。口前，利巴韦林的牛产方　法主要有化学合成法、酶促法和发酵法㈣。化学法的小足之处是　步骤多、反应条件苛刻、周期长、需要进行异构体的分离。酶促法　合成利巴韦林的产率往往受核苷磷酸化酶活性的限制，而且酶　源较少。发酵法是将嘌呤核苷的发酵生产过程与核苷转化合成　利巴韦林的过程相偶联，利用嘌呤核苷磷酸化酶（ｐｕｒｉｎｅ　ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ　ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｓｅ，ＰＮＰａｓｅ，ＥＣ２．４．２．１）催化可逆反应（嘌呤　核苷＋磷酸　嘌呤碱基＋１一磷酸核糖）Ｉ９－１ｏ］，实现一步法牛物合成　利巴韦林，避免核苷的分离和纯化过稃，有单降低生产成本。该　方法具有原料成本低且来源』　泛、能耗低等优点，有ｌ：业化生产　潜力，但在国内仍属空白。　我们克隆获得枯草芽孢杆菌嘌呤核：苷磷酸化酶基因ｄｅｏＤ，　并将其构建到穿梭表达载体ｐＤＧ１４８中，在枯草芽孢杆菌　ＷＢ６００中诱导表达了重组ＰＮＰａｓｅ，有效地提高了宿主菌中的　ＰＮＰａｓｅ酶活，为进一步研究利巴韦林等核苷类物质的发酵法生　产创造了条件。　

１材料和方法　１．１　材料　大肠杆菌ＸＬ—Ｂｌｕｅ、枯草芽孢杆菌Ｗｌ６８和ＷＢ６０ｏ由本实　验窄保藏；测序载体ｐＭＤ１８－Ｔ购自ＴａＫａＲａ公司；表达载体　ｐＤＧ１４８由天津科技大学代谢工程研究室保藏；Ｔ４　ＤＮＡ连接酶、　ＤＮＡ聚合酶、限制性内切酶购自ＴａＫａＲａ公司；ＰＣＲ引物由　上海生工生物Ｉ＝程公司合成；ＤＮＡ片段玻璃奶纯化回收试剂盒、　质粒小样快速提取试剂盒购于北京博大泰克生物公司；ＩＰＴＧ、Ｘ—　ｇａｌ、蛋白分子量标准、溶菌酶及卡那霉素购自北京索莱宝科技有　限公司；ＳＤＳ为日本进口分装产品；３－巯基乙醇为Ｅｉｍｅｒｋ公司　产品；Ｎ，Ｎ　一亚甲基双丙烯酰胺为Ｆｌｕｋａ公司产品；蛋白胨、酵母　粉为Ｏｘｏｉｄ公司产品；肌苷购自浙江诚意药业公司；山梨醇、甘露　醇购于天津博美科生物技术有限公司；其余试剂均为国产分析　纯产品。　

［收稿日期］２ｏ０８一ｌ２—２９　［基金项目］天津市高等学校科技发展基金计划（２００７０９０３）　［作者简介］邢晨光（１９８１一），男，硕士研究生　［通信作者］陈宁，（Ｅ—ｍａｉｌ）ｎｉｎｇｃｈ＠ｔｕｓｔ．ｅｄｕ．ｃｎ　邢晨光等：合成利

巴韦林的关键酶嘌呤核苷磷酸化酶的原核表达及活性分

析

531

12PCR

扩增目的片

段如

参考G

Bank中枯草芽孢杆菌W168的

PNP

ase的氨基酸

序歹U设计正向

弓I物(5GAGAAGCTTATl’．11

ACAGGAGGATATG

AGA

TG3

)

和反向

弓l物

(5GAGGTCGACATGATGG

TACATATA

GGTGCT3)引物的5端和3端分别引入Hindm和so／I

位

点20斗L反应体系PCR扩增程序为

：95℃3

min然

后以94

℃

1mi

n58℃1min720C1min反应30个循环72℃延伸

min将PCR产物酶切

回收与pMDl8T载体

连接常规CaCl

：

法转化大肠杆菌

XLBlue感受态在含IPFG和Xgal的氨苄青

霉素抗性(A

)LB平板上于37℃过夜培养挑取单个白色菌

落小量提取质粒酶切及测序鉴定将重组质粒命

名为

pMDl8

eoD

1-3

穿

梭表

达载

体的构

建

将pMDl8Td

eoD与

pDGl48

分别进

行

dⅢ／5以I

双酶

切低熔点琼脂糖

电泳回收目的片段按质粒DNA

与

目的基因

为1：5的比例混合在T4DNA连接酶作用下连接过夜

(16

℃

)

；

连接产物转化大

肠杆菌XLBlue感受态筛

选Amp阳性重组

子提取质粒分别

进行Hindm／so／I双酶切分析；将插入正确

片

段的重组质粒

通过电击转化的方

法(采用1mm的电击杯电

压

2000V脉冲时间5ms)转入预先处理过的枯草杆

菌

WB600

37℃振荡培养3h涂布卡那霉素抗性(Kan)平板筛选阳性转化

子；小量提

取枯

草杆菌中的质粒酶切鉴定验

证质粒是否转

入

受体

菌将重组质粒命

名为

pDGl48d

eoD

14蛋白SDSP

AGE

采用

BioRad公司的小型垂直式电泳模具分离胶为12％

浓缩胶为5％电泳开始电压为

80V待

样品变成条线进入分

离胶后改为120V电泳结束后

经考

马斯亮蓝染色用乙酸：异丙

醇：水

(10：125：775)的脱色液脱色约5h

酶

活性检测

取适量发酵液于4℃8000

r／min离心10min弃

上

清

收集菌体并称

重然后把菌体悬浮在磷酸缓冲液中加

入肌

苷和

124三氮唑3羧甲酰胺65℃220#mi

n反应2h通

过测定

利巴韦林的生成量间接测定酶活力个酶单位(U)的定义为

：

在最适反应条件下单位时间内催化肌苷转化生成利巴韦林的酶

量

2结果

21PNP

ase编码基因deoD的P

扩增

和测

序

以枯草芽孢杆菌W168的基因组为模板进行PCR扩增得到约700bp的特异性条带

(图1)扩增片段经乙醇沉淀后

与

pMDl8T载体连接连接产物转化大肠杆菌XLBlue感受态细

胞通过蓝白斑筛选重组子用试剂盒提取质粒酶切鉴定

(图

1)将经酶切验证的重组质粒pMDl8TdeoD交由天津生物j妄

片公司测序(图略)结果表明本实

验所获得的PNPase基因deoD

由702个碱基组成是包括起始密码子ATG和终止密码子TAA

的完整阅读框架且与

GenBank中所报道的枯草芽孢杆菌W168

deoD基因序列完全相同证实了克隆基因的正确性

22穿梭表

达栽体的构建筛选

和鉴

定

用HindllI和SalI切下连在载

体

pMDl8T上的如扣

基因

将目的基因与同

样经Hindm／SalI双酶切的表达载

体

pDG

l48

的回收产物于16

℃过夜连接连接产物转

化大肠杆菌

XLBl

感受态筛

选Amp阳性重

组子电转化WB600感受

态细

胞将

转化子涂布Kan平板37

℃过夜培养从

an平板上随机挑取

定数量的转化子进行菌落

R双

酶切

鉴定结果与预期致

(图1)23重组PNPase的SDSPAG

将重组菌转接于5mLLB培养基(含Kan20I~g／mL)中

220r／min37℃培养16h后以1％的接种量转接至新鲜L

培

养基中37％培养至菌体光密度值

。约为06时加入终浓度

为08mmoL／L的IPTG以空质粒pDGl48转化的W

B600

作为

对照继续培养8h取适量菌液

进行S

DSPAGE(图2)

结果表

明重组菌诱导后在相对分子质