核苷酸类物质(精)

1.肌苷生产菌的选育
常用：枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）的腺嘌
呤缺陷型。
原因：
该菌磷酸酯酶活性强，有利于将IMP脱磷酸化 形成肌苷，分泌至胞外，而产氨短杆菌的磷酸酯酶 活性较弱。
因此，对B. subtilis 进行菌种改良，可大量
积累肌苷。
2.培养条件
（1）培养基： 碳源：淀粉水解糖或糖蜜 氮源：要充分（因肌苷含氮量高，20.9％） 无机盐：可溶性磷盐有抑制作用（胞外磷酸化） 生长因子：加适量含腺嘌呤的物质，如酵母膏。
干酵母片研碎，10%Nacl沸水浴浸提30min。 冰盐浴冷却，离心取上清夜。 等电点沉淀。 乙醇洗涤，离心，重复3次。 干燥，称重。
4.核酸酶解
核酸溶液 5 －磷酸二酯酶 5 －单核苷酸混合液
5. 5 －鸟苷酸的分离
离子交换树脂
特点：工艺简单，得率高，副产物也为医药产品。
核酸的降解过程
核酸
核酸酶（磷酸二酯酶）
核苷酸
核苷酸酶（磷酸单酯酶）
核苷
核苷磷酸化酶
磷酸
嘌呤或嘧啶
戊糖-1-磷酸
某些核酸外切酶对RNA、DNA均有作用：
牛脾磷酸二酯酶 3-核苷酸
蛇毒磷酸二酯酶 5-核苷酸
2.磷酸二酯酶的制备
（1）桔青霉（Penicillium citrinum）
毒和抗肿瘤的作用，受到医药界的普遍重视。
（二） 生产方法
1. 发酵法
（1）一步法：直接发酵法
（2）二步法（发酵转化法）
发酵法
核苷 磷酸化
核苷酸
2. 酶解法
酵母 提取 核糖核酸 酶解 核苷酸
二、核苷酸的生物合成途径及其代谢调控
（一） 生物合成途径
从头合成途径： 利用氨基酸等作为原料合成。 补救合成途径：利用体内游离的碱基或核苷合成。
微生物中普遍存在鸟苷酸的降解酶系（加高浓度磷 盐）,培养条件较复杂。 （2）直接发酵法产酸率不高，因GMP是嘌呤核苷酸生物 合成的终产物，使鸟苷酸的自身合成受阻。 （3）鸟苷的溶解度低，容易析出，相对减弱了反馈调 节的强度，使积累鸟苷成为可能。
2.鸟苷生产菌的选育（鸟苷高产菌株应具备的条件）
（1）丧失腺苷酸琥珀酸合成酶活性，即切断肌苷酸到腺 苷酸的通路。
腺嘌呤的最适浓度： 不影响菌体生长 使肌苷大量积累
（2）发酵条件 通气搅拌：供氧充足，促进肌苷生成，并可减少
CO2对肌苷生成的抑制。
（3）肌苷的提取
先过阳离子交换柱，再过活性炭柱（吸附），结晶。
3.肌苷的磷酸化
（1）酶法：
酶：核苷磷酸化酶（三叶草假单胞菌） 磷酸的供体：对硝基苯磷酸 难点：除5 －磷酸化产物外，还有3 -、2 -位异 构体，收率85％。
鸟苷酸的生产方法： （1）由酵母细胞提取出核酸，再以酶法降解； （2）直接发酵法生产鸟苷酸； （3）以化学法磷酸化发酵生产的鸟苷； （4）双菌混合发酵法。利用5 一黄苷酸或黄苷酸
生产菌与能将黄苷酸或黄苷转化为鸟苷酸的菌株 混合培养。
（一）二步法 （常用）
1.选用二步法的原因： （1）GMP的细胞膜透性很差（限Mn2+）
可用固体发酵（制曲、浸泡、抽提）
（2）金色链霉菌（Streptomyces aureus）
液体深层发酵，该菌不仅含有5 －磷酸二酯酶，同 时含有脱氨酶，使其中的5 －AMP脱氨后生成5 -IMP。
因此，使用该菌产生助鲜剂时，由于含有两种酶， 可同时得到IMP和GMP。
3.核酸提取
（1）鲜酵母制备 （2）提取核酸（RNA）
①腺苷酸代琥珀酸合成酶 ③IMP脱氢酶 ②腺苷酸代琥珀酸裂解酶 ④GMP合成酶
IMP
AMP-S XMP Gln
AMP GMP
激酶
AMP
激酶
ADP
ATP ADP
ATP ADP
GMP
激酶
激酶
GDP
ATP ADP
ATP ADP
ATP GTP
IMP合成途径的代谢调控
主要通过产物的负反馈调节 调节包括: 2个长反馈和2个短反馈
（2）鸟苷分解酶的活性微弱。 （3）解除鸟苷酸的反馈抑制与阻遏。 （4）由肌苷酸脱氢酶、鸟苷酸合成酶催化的反应，比核
苷酸酶催化的反应优先进行，从而抑制肌苷的产生。 按上述要求，利用枯草芽孢杆菌腺嘌呤缺陷型加以诱 变获得。
3.鸟苷Байду номын сангаас酵条件 （1）培养基
碳源：葡萄糖或麦芽糖 氮源：硫酸铵（氯化铵、大豆蛋白水
（2）腺嘌呤与1-磷酸核糖生成腺苷, 再生成腺嘌 呤核苷酸。
腺嘌呤+1-磷酸核糖 核苷磷酸化酶
腺苷+Pi
腺苷+ATP
腺苷激酶
腺苷酸+ADP
三、肌苷酸的生产 （一）一步法
1.肌苷酸生产菌选育 （1）解除微生物自身的反馈调节 a.解除AMP、GMP对PRPP转酰胺酶的反馈抑制。 b.切断5 -IMP继续代谢生成GMP和AMP的途径。
（二）酶法（又称核酸水解法）
起始于日本，50－60年代研制成功，技 术关键是筛选到产生5 －磷酸二酯酶（核酸 外切酶）的菌株。
1.原理
5 －磷酸二酯酶能水解核糖上3 －碳原子羟 基与磷酸形成的二酯键，生成4种5 －单核苷酸， 即：从游离3 －羟基端开始，逐个水解下5 －单 核苷酸。
因此，选择可能产生核苷酸的产氨短杆菌
（Brevibacterium ammoniagene）为出发菌株，
诱变为腺嘌呤缺陷型突变株，再诱变为鸟嘌呤 缺陷型突变株。
IMP的阻遏如何解决？ （2）改变核苷酸对细胞膜的渗透性
核苷或碱基容易透过细胞膜，而核苷酸难于透过 细胞膜。
日本科学家发现，Mn2+对于产氨短杆菌核苷酸的 膜透性起着关键作用， Mn2+限量的情况下，菌体产生 膨胀异常现象，细胞膜允许IMP渗透到胞外，积累IMP。
Mn2+限量与生物素亚适量结果相同，但机制不同。
Mn2+亚适量：培养后期，细胞形态异常（伸长、膨胀、 不规则）
生物素亚适量：为乙酰CoA羧化酶的辅基，影响脂肪酸 生物合成，间接影响细胞膜磷脂合成，从而影响细胞膜 透性。
2.培养条件
（1）因所用菌株为腺嘌呤缺陷型，所以添加适量腺嘌 呤（加0.5%酵母膏或酵母水解液）。 （2）Mn2+亚适量
第二节 核酸与核苷酸发酵
一、概况
核酸由众多的单体核苷酸通过3 ,5 －磷 酸二酯键聚合而成。
核苷酸由碱基、核糖、磷酸组成。 脱去磷酸后的碱基称为核苷。
（一）呈味核苷酸
核苷酸类中的肌苷酸（IMP）、鸟苷酸（GMP）、 黄苷酸（XMP）呈强鲜味。如：肌苷酸钠比味精鲜40倍， 鸟苷酸钠比味精鲜160倍。
5 －鸟苷酸 5 －肌苷酸 5 －黄苷酸
（guanylic acid）（inosinic acid） （xanthylic acid）
5 -GMP > 5 -IMP > 5 -XMP
碱基 鸟嘌呤
次黄嘌呤
黄嘌呤
AMP
GMP
鲜味剂的协同效应
当核苷酸与氨基酸类物质混合使用时， 鲜味不是简单的叠加，而是成倍地提高。
工业原料和工业用水含较多的Mn2+，难于控制Mn2+ 亚适量,有两条途径：
a.筛选对Mn2+不敏感的突变株 b.加抗生素或表面活性剂以解除过量Mn2+的影响。 （3）添加较高浓度的磷盐。
（二）二步法（肌苷酸生产主要方法）
发酵法 肌苷 磷酸化 肌苷酸 原因： •IMP对细胞膜的透性很差。 •微生物中普遍存在使IMP脱磷酸化的酶类。
（2）化学法：用不同的磷酸化试剂。
4.肌苷酸的提取
除菌体 除对硝基酚
（过滤、离心）
柱层析
离子交换法 活性炭吸附
加乙醇沉淀
精制（结晶）
粗制品
肌苷酸
四、鸟苷酸的生产
•鸟苷酸由鸟嘌呤、核糖和磷酸三部分组成。 •1960年，日本科学家发现5‘－鸟苷酸钠具有强烈的 鲜味。1961年又证实了香味极浓的著名菇类－香菇含 有大量的鸟苷酸，从此开始研究GMP的生产方法。
PRPP
酰胺
R-5-P 合成酶
转移酶
PRPP
PRA
ATP
AMPS AMP ADP ATP IMP
XMP GMP GDP GTP
2个长反馈
2个短反馈
AMPS
AMP
ADP
ATP
IMP
XMP
GMP
ATP
GDP
GTP
2.补救合成途径（salvage synthesis）
微生物从培养基中取得完整的嘌呤、戊糖、 磷酸，直接合成单核苷酸。
当全生物合成途径受阻时，微生物可通过 此途径合成核苷酸。
有两条合成途径：
（1）嘌呤碱与PRPP直接合成嘌呤核苷酸
次黄嘌呤
次黄嘌呤核苷酸
90% 嘌呤碱
次黄嘌呤-鸟嘌呤
PRPP
磷酸核糖转移酶
(HGPRT)
PPi
HGPRT活性高
鸟嘌呤
鸟嘌呤核苷酸
腺嘌呤
腺嘌呤磷酸核糖转移酶
（APRT）
APRT活性低
腺嘌呤核苷酸
解液）、流加氨水 无机盐：磷、镁、铁、锰 嘌呤前体物：L-谷氨酸钠 营养缺陷型菌株的营养物质
（2）发酵条件 温度：36℃（0~24h） 36.5~37.5 ℃ （24h后） pH值：pH值下降，流加氨水。 溶氧： 发酵周期：48h左右
（3）鸟苷的分离提取
灭菌后发酵液→除菌体→一次结晶→过滤→ 鸟苷粗品→脱色→过滤→二次结晶→过滤→鸟苷 →烘干→磨粉→ 包装
1.从头合成途径（denovo synthesis） 由氨基酸、磷酸戊糖、CO2和NH3合成核苷酸。