张家口地区奶牛子宫内膜炎主要致病菌的分离鉴定及中药抑菌试验

３２　中国兽医杂志２０１５年（第５ｌ卷）第５期　张家口地区奶牛子宫内膜炎主要致病菌　的分离鉴定及中药抑菌试验　

王海凤　（河北北方学院动物科技学院，河北张家口０７５０００）　

摘要：本试验采集３０头来自张家口坝上地区淘汰奶牛的子宫分泌物，进行病原菌的分离鉴定和中药敏感性试验。　结果表明，主要致病菌大肠杆菌，葡萄球菌，链球菌，分泌属化脓菌，蜡样芽孢杆菌，沙门菌。中药药敏试验表明，多数　单味中药对６种细菌均有程度不同的抑制作用。其中以黄芩、硼砂、连翘、蒲公英、淫羊藿、大黄、丹参的抑菌效果较好。　关键词：子宫内膜炎；病原菌分离鉴定；中药药敏试验　

中图分类号：￥８５８．２３　文献标志码：Ａ　文章编号：０５２９—６００５（２０１５）０５—００３２—０２　近年来，张家口地区奶牛业生产态势良好，　带动了地方经济的快速发展，但奶牛生殖系统疾　病也随之增多，其中子宫内膜炎占相当大比例，　严重影响了奶牛的繁育性能和产奶量，严重者＿口『　因丧失经济价值而被淘汰，给养殖户造成的危害　非常严重，经济损失巨大。　国内外学者对患子宫内膜炎奶牛子宫内菌群的　分离鉴定研究表明，引起子宫内膜炎的主要原因是　病原微生物的感染ｎ　。包括细菌、真菌、支原体、病　毒和寄生虫等。临床上多使用抗菌药物进行治疗，　由于耐药菌株不断产生，不但疗效不佳，而且导致　用药量越来越大，后者又使治疗成本增加，还会引　起乳产品中药物残留超标、带来食品安全隐患。中　药在治疗奶牛疾病方面具有巨大的潜力，在奶牛饲　料中应尽量添加中药饲料添加剂，对影响牛奶质量　的主要疾病要进一步推广中药防治。　由于本病病原菌的种类随地域不同而有较大　差异，张家口及其周边地区奶牛子宫内膜炎发病　率及主要致病菌缺乏相关资料，给临床防治奶牛　子宫内膜炎造成很大难度。本试验针对在张家　口地区采集了疑似病例的奶牛子宫３０份（将３０　头疑似病牛屠宰后取出整个子宫）进行主要病原　菌的分离和鉴定，确定患病奶牛发生子宫内膜炎　后主要致病菌，然后测定中药对分离菌株的体外　抑制作用，筛选治疗奶牛子宫内膜炎敏感性的药　物，为有针对性地制定本地区奶牛子宫内膜炎的　防治措施提供参考。　收稿日期：２０１３—１２—２０　基金项目：张家口市科技局项目（１２１１００３７Ｃ一１）　作者简介：王海凤（１９８３～），女，助理研究员，硕士，从事临床兽　医学研究，Ｅ—ｍａｉｌ：ｗｈｆ８３１　１０２＠１２６．ｃｏｉｎ　１　材料与方法　１．１　中药制备中药黄芩、硼砂、连翘、蒲公英、　淫羊藿、益母草、红花、当归、金银花、板蓝根、苦　参、夏枯草等，购自张家口华佗药房。　中药煎液制备：各中药用水浸泡１２　ｈ后，将　以上每种单药加蒸馏水至中药完全浸没，置于电　炉上急火煮沸，沸腾后开始计时，文火煎熬３０　ｍｉｎ　后倒出药汁，再加水同样煮沸１次，将两次的煎液　混到一起，纱布过滤后浓缩至２０　ｍＬ，制成含药量　为１　ｇ／ｍＬ的煎剂，４℃储存备用。　１．２病料采集按照临床型奶牛子宫内膜炎的　诊断标准，在张家口坝上地区屠宰场将送去久配　不孕即将淘汰的奶牛选出３０头，经过问诊和直肠　检查暂定为子宫内膜炎。奶牛屠宰后立即将子　宫整体取出并采集子宫分泌物送实验室进行病　原菌培养鉴定。　１．３病原菌分离鉴定将采集的子宫分泌物逐　个接种于肉汤培养液，３７　ｑＣ增菌培养２４　ｈ；然后　将增菌培养液划线接种于普通琼脂培养基，３７　ｃｃ　培养２４　ｈ；挑取单菌落在普通琼脂培养基上划线　分离、培养。如此反复，直到培养基上的菌落特　征相同时，再挑取单个菌落涂片，革兰染色后镜　检；根据菌落形态、菌体大小和染色特征，分别接　种于鲜血培养基中进行纯培养，然后将菌株分别　接种于血琼脂和麦康凯培养基、伊红美蓝培养　基、Ｓ．Ｓ．琼脂培养基等鉴别培养基中进行纯培　养。长好后用塑料袋装好密封放于４℃冰箱中保　存，进行细菌的生化鉴定。菌种的保存则用含　２０％甘油的肉汤冷冻，一７Ｏ℃保存。　将分离到的菌株逐个进行生化反应试验　，　主要包括以下几方面试验内容：革兰染色、溶血　性、形态观察、糖发酵试验、吲哚试验、甲基红试　中国兽医杂志２０１５年（第５１卷）第５期　３３　验（Ｍ．Ｒ．试验）、乙酰甲基甲醇试验（Ｖ—Ｐ试验）、　硝酸盐还原试验、硫化氢试验。最后根据菌落形　态、革兰染色、镜检结果和生化反应结果综合分　析，鉴定各菌株。具体细菌的鉴定参照《常见革　兰阳性菌的简易鉴定方法》、《伯杰细菌鉴定手　册》和《临床细菌学》中的细菌分群方法进行。　１．４中药抑菌试验采用平板打孔法　。分别取　稀释待测菌液于少量生理盐水中制成０．５号麦氏　标准菌液，用灭菌棉球将待检细菌混悬液均匀涂　布于平皿培养基表面，再用直径５　ｍｍ的无菌打孔　器在每个平皿内均匀打５个孔，挑去孔内琼脂，火　焰加热封底后注入各中药液，以刚刚注满为准，　３７℃培养１８￣２４　ｈ后，测定抑菌圈直径。对于抑　菌圈直径过大的或是没有的进行补做。　判断标准：由于目前没有关于中药抑菌圈直径　同药物敏感性的关系，所以具体抑菌试验结果只能　用抑菌圈直径表示，根据国家药政管理局１９９５年制　定的中新药申报指南中规定，中药采用打孔法，中　药的抑菌圈直径超过８　ｍｍ者可判定为抑菌作用。　２　结果　种主要病原菌，９３株，分别为大肠杆菌，葡萄球　菌，链球菌，分泌属化脓菌，蜡样芽孢杆菌，沙门　菌。单一感染和混合感染同时存在，混合感染高　于单一感染（表１）。　表１　病原菌各分离菌株的种类及部分特－眭　细菌名称　数量／株比例／％　菌体形状　溶血性革兰染色　

试验表明，葡萄球菌、链球菌和大肠杆菌为　奶牛子宫内膜炎的主要致病菌。且从病料来源　看（３０头淘汰奶牛全部来自张家口市坝上周边地　区），该结论可以代表张家口市坝上周边地区奶　牛子宫内膜炎的真实性。　２．２病原培养特性、染色特性和生化鉴定经无　菌方式采取的不同奶牛子宫内容物样品，经实验　室初步分离、纯化后，涂片，镜检，根据菌落的培　养时的形态特征，显微镜下细菌的形态特征，初　２．１　患病奶牛病原分布和感染情况本试验对　步确定的细菌是革兰阳性或阴性细菌，然后进行　３Ｏ个奶牛子宫分泌物进行细菌分离，共分离出６　生化鉴定，６种病原菌生化鉴定结果见表２。　表２生化鉴定结果　

病原菌　葡萄糖乳糖麦芽糖甘露醇蔗糖吲哚试验甲基红试验（Ｍ．Ｒ．试验）乙酰甲基甲醇试验（ｖ—Ｐ试验）硝酸盐还原试验硫化氢试验　大肠杆菌　金黄色葡萄球菌　链球菌　分泌属化脓菌　蜡样芽孢杆菌　沙门茵　（＋）　一　（＋）　（＋）　一　一　注：糖发酵试验中，＋：该菌发酵此糖产酸；（＋）细菌发酵该糖产酸产气；　隐性反应；＼：未进行该试验　２．３　中药的抑菌效果采用打孔法进行单昧中药　的药物敏感性试验，对于不同的细菌，根据其不同　的培养特性，采用不同的培养基，在其培养基上打　孔后，注入药液后，按照其特性，严格进行培养，对　６种细菌进行ｌ３种单味中草药的体外抑菌试验，结　果见表３。多数单味中药对６种细菌均有程度不同　的抑制作用。其中以黄芩、硼砂、连翘、蒲公英、淫　羊藿、大黄、丹参的抑菌效果较好。以单味药对各　种细菌抑菌圈直径的平均值比较，排在前６位的是　淫羊藿（９．９７）、硼砂（９．６２）、黄芩（９．５５）、蒲公英（９．５）、　丹参（９．０７）、连翘（８．９８）。　＋　＼　＋　＋　该菌不发酵此糖。吲哚、Ｍ．Ｒ、Ｖ—Ｐ、硝酸盐还原及硫化氢试验中，＋：阳性反应　

３讨论　普遍认为子宫内膜炎的直接病因是产后各种病　原微生物的感染所引起的，奶牛子宫内膜炎病原微　生物比较复杂，不同地区不同情况下分离到的细菌　

种类和比例也有差异　。本试验对疑似子宫内膜炎　奶牛病原细菌进行分离，张家口地区奶牛子宫内膜　炎的主要病原菌为大肠杆菌，葡萄球菌，链球菌，分　泌属化脓菌，蜡样芽孢杆菌，沙门菌等。分离到的　细菌大多为广泛存在于环境中及畜体内的常见菌，　其中有些是条件性致病菌，可见子宫内膜炎是因奶　牛产后体质虚弱、免疫力下降，环境中及畜体内病　原微生物乘机侵入所致，这与我们进行的病因学调　查中发现奶牛场中存在的接产或人工授精时消毒　不严及牛场卫生条件较差的状况相吻合。在所检　验的３０头患病奶牛中，单一感染和混合感染同时存　在，主要为多种细菌的混合感染，这与地区性饲养　管理水平、环境因素有极大的关系，同时也与没有　及时进行早期诊断治疗有关。一旦一种病原微生　物感染后，由于未能及时采取措施和早期治疗，造　成子宫内膜和机体的抵抗力下降，极易诱发各种条　３４　中国兽医杂志２０１５年（第５１卷）第５期　Ｃｈｉｎｅｓｅ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ　４种禽源病毒感染ＣＥＦ后　１３一ｃａｔｅｎｉ　ｎ基因的动态表达　

傅安静　，黄名英　，高　艳　，文　红　（１．成都农业科技职业学院，四川成都６１１１３０；２．西南民族大学，四川成都６１００４１；　３．成都温江区农法局动物检疫疾病控制中心，四川成都６１　１　１３０）　

摘要：旨在建立鸡ｐ连环蛋白（ｐ—ｃａｔｅｎｉｎ）ｍＲＮＡ的实时荧光定量ＲＴ—ＰＣＲ方法，检测ＮＤＶ、ＡＩＶ、ＲＥＶ、ＡＬＶ四种病毒　感染鸡胚成纤维细胞（ＣＥＦ）后Ｂ—ｃａｔｅｎｌｎ　ｍＲＮＡ的动态表达水平；运用建立的Ｒｒｔ—ＰＣＲ方法，检测ＮＤＶ　Ｆ４８Ｅ９、ＡＩＶ　Ｈ５Ｎ１、ＡＬＶ和ＲＥＶ病毒感染后ｐ—ｃａｔｅｎｉｎ　ｍＲＮＡ的动态表达水平。研究结果：（１）ＮＤＶ　Ｆ４８Ｅ９感染ＣＥＦ后３　ｈ诱导８一　ｃａｔｅｎｉｎ　ｍＲＮＡ的表达，而在感染后６　ｈ至２４　ｈ抑制Ｂ—ｃａｔｅｎｉｎ　ｍＲＮＡ的表达。其中接毒后的９、２４　ｈ，接毒组Ｂ—ｃａｔｅｎｉｎ　ｍＲＮＡ的表达量分别是对照组的０．２２倍和０．２５倍，差异显著（Ｐ＜０．０５）；（２）ＡＩＶ　Ｈ５Ｎ１感染ＣＥＦ后３、６　ｈ，接毒组Ｂ—　ｃａｔｅｎｉｎ　ｍＲＮＡ的表达水平高于对照组，其中３　ｈ时接毒组是对照组的３．１４倍，差异极显著（Ｐ＜０．Ｏ１）；在感染后９、１２、２４　ｈ　抑制Ｂ—ｃａｔｅｎｉｎ　ｍＲＮＡ的表达，接毒组分别是对照组的０．５、０．０３、０．３倍，其中１２　ｈ时差异极显著（Ｐ＜０．０１）；（３）ＲＥＶ感染　ＣＥＦ后诱导Ｂ—ｃａｔｅｎｉｎ　ｍＲＮＡ表达，接毒后２４　ｈ、３、５、７、８　ｄ，接毒组分别是对照组的２．３８、２．７１、２．０５、２．６４、２．７９倍，差异均　显著（Ｐ＜０．０５）；（４）ＡＬＶ感染ＣＥＦ后诱导ｐ～ｃａｔｅｎｉｎ　ｍＲＮＡ的表达，其中接毒后３、５、７　ｄ时，接毒组细胞ｐ—ｃａｔｅｎｉｎ　ｍＲＮＡ　的表达水平分别是对照组的６．２０、３．Ｉ１、６．７０倍，３、７　ｄ时差异极显著（Ｐ＜Ｏ．ＯＩ），５　ｄ时差异显著（Ｐ＜０．０５）。研究结论：Ｂ—　ｃａｔｅｎｉｎ参与这四种病毒的感染应答，且表达模式不同。Ｂ—ｃａｔｅｎｉｎ动态表达为研究病毒感染致病与机体相互作用的分　子机制提供了有价值的参考。　关键词：荧光定量ＲＴ—ＰＣＲ；新城疫病毒；禽流感病毒；禽白血病病毒；网状内皮组织增生症病毒；ｐ连环蛋　白；鸡胚成纤维细胞