转基因烟草检测技术研究
转基因技术的研究报告综述及利弊关系
转基因技术的研究综述及利弊关系转基因技术作为生命科学的前沿技术之一，已经逐渐走入了人们的生活。
转基因技术可以认为是在一定程度上通过科学技术手段让其他生物、植物朝着对人类有利方向开展的技术。
通过对转基因技术的介绍，阐述了该技术的利弊关系，指出只有通过正确的引导和规管理，才能很好地利用该技术，使它为人类效劳。
关键词转基因技术开展历程利弊关系1 前言转基因技术是生命科学前沿的重要领域之一。
自从人类耕种作物以来，我们的祖先就从未停顿过作物的遗传改进。
过去的几千年里农作物改进的方式主要是对自然突变产生的优良基因和重组体的选择和利用，通过随机和自然的方式来积累优良基因。
遗传学创立后近百年的动植物育种则是采用人工杂交的方法，进展优良基因的重组和外源基因的导入而实现遗传改进。
因此，可以认为转基因技术是与传统技术一脉相承的，其本质都是通过获得优良基因进展遗传改进。
但在基因转移的围和效率上，转基因技术与传统育种技术有两点重要区别，第一，传统技术一般只能在生物种个体间实现基因转移，而转基因技术所转移的基因则不受生物体间亲缘关系的限制；第二，传统的杂交和选择技术一般是在生物个体水平上进展，操作对象是整个基因组，所转移的是大量的基因，不可能准确地对*个基因进展操作和选择，对后代的表现预见性较差。
而转基因技术所操作和转移的一般是经过明确定义的基因，功能清楚，后代表现可准确预期。
因此，转基因技术是对传统技术的开展和补充。
将两者严密结合，可相得益彰，大提高动植物品种改进的效率。
2 转基因技术的介绍转基因技术是指用人工别离和修饰过的外源基因导入生物体的基因组中，从而使生物体的遗传性状发生改变的技术，可分为转基因动物与转基因植物两大分支。
人们常说的"遗传工程〞、"基因工程〞、"遗传转化〞均为转基因的同义词。
2.1 转基因植物技术转基因植物是指利用重组DNA技术将克隆的优良目的基因整合到植物的基因组中，并使其得以表达，从而获得的具有新的遗传性状的植物。
人源抗狂犬病毒单克隆抗体载体的构建及烟草转基因研究(四)
人源抗狂犬病毒单克隆抗体载体的构建及烟草转基因研究(四)陈超;张铁钢【期刊名称】《生物学通报》【年(卷),期】2011(46)2【摘要】为了构建高效表达人源抗狂犬病毒单克隆抗体载体,首先对人源抗狂犬病毒抗体(SO57)重链和轻链编码基因的密码子进行偏好性改造,添加增强外源基因表达的控制元件,然后分别与花椰菜花叶病毒35s启动子和木薯叶脉花叶病毒启动子融合,连接至植物表达载体pBI121上,然后将构建好的载体转入农杆菌LB4404,采用叶盘法转化烟草叶片.用分子生物学技术,对6株转基因烟草进行检测,电泳检测结果均为阳性.用酶联接免疫吸附剂法,检测6株烟草叶片中人源抗狂犬病毒单克隆抗体的表达.结果表明,6株烟草均成功表达人源抗狂犬病毒抗体.【总页数】4页(P46-49)【作者】陈超;张铁钢【作者单位】北京师范大学珠海分校工程技术学院,广东珠海,519085;北京市疾病预防控制中心免疫预防所,北京,100013【正文语种】中文【中图分类】R-331【相关文献】1.双价抗虫植物表达载体p3300-bt-pta的构建及转基因烟草的初步检测 [J], 范媛媛;庞永珍;吴为胜;姚剑虹;唐克轩;武天龙2.抗草甘膦抗虫植物表达载体的构建及其转基因烟草的分析 [J], 谢龙旭;徐培林;聂燕芳;田颖川3.定量检测猕猴血清中重组人源化抗狂犬病毒单克隆抗体间接ELISA法的建立 [J], 刘晓雷;侯禹男;陈知航;单成启;车津晶;刘运龙;宋艳霞;苗小红;程远国4.重组人源抗狂犬病毒单克隆抗体SO57、SOJB对狂犬病毒G蛋白亲和力的比较研究 [J], 程立均;贾茜5.人源抗狂犬病毒单克隆抗体Fab段基因的获得和表达 [J], 张世珍;梁米芳;董关木;郑海法;侯云德因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
抗病毒病转基因烟草的培育方法及展望
状、 外源基 因的合成和导人途径、 载体 的构建 、 基因的 整合和表达、 转化细胞的培养和植株再生以及优 良株 系的选育等， 已经形成一套较为成熟 的技术流程， 获得 大批 抗病 、 虫 转 基 因 烟 草 品 种 （ ） 为 烟 草抗 病 育 抗 系 ， 种提 供 了新 的方 法 和途 径 Ｊ 。本 文 综 述 抗 病 毒 病 转 基 因烟草 的研究 现状 。
［］ ７ 耿华珠． 中国苜蓿 ［ ． Ｍ］ 北京 ： 中国农业大学 出版社 ，９ ５ １９ ．
博 士学位论文 ， 京 ： 北 中国农业大学 ，９ ７ １９ ． ［］ ２ 王成杰． 高水 分打捆贮 藏对 苜蓿干 草营养 价值 和组成 的影
响 ［ ］ 草业科学 ，０ ５ ２ （ ） ｌ ７ Ｊ． ２０ ，２ ４ ：４—１ ．
［ ］ ｕｋ ａｅ Ｄ Ｒ Ｈ ｉｉ ｓＡ Ｊ Ｌｓ ｓａｄｑａｔ ｃａｇ ８ Ｂｃｍ ｓ ｒ ， ｅ ｒｈ ． ｏｓ ｎ ｕｌｙ ｈ ￣ ｔ ｎｃ ｅ ｉ ｎ
ｄ ｒ ｇ ｈ ｒ ｅ ｔ ａ ｄ ｓｏ ａ ｅ ｏ ｒ ｓ ｒ ａ ｉｅ ｔ ａｅ ｌ ｌ ａ ｕ ｎ ａ ｖ ｓ ｎ ｔｒ ｇ ｆ ｐ ｅ ｅ ｖ ｔ ｒ ｔｄ ａｆ ｆ ｈ ｙ ｉ ｖ ｅ ａａ
国农业 出版社 ，９ １ １９ ．
［］ ４ 张秀芬． 压扁 苜蓿 茎秆 加快 干燥 速度的研 究 ［ ］ 中国草地 ， Ｊ．
１８ １ （ ） ２ ２ ． ９ ７，８ １ ：３— ９
［ ］ Ａ ｉ ａ Ｆ ｅ ｃｅｃ ｄＴ ｃｎｌ ｙ １８ ， ７—１． Ｊ ． ｎｍ ｅｄＳ ｉ ｅａ ｅｈｏ ｇ ，９ ６ １ ｌ ｎ ｎ ｏ ６： ５
ａ ｄ ｎ ｔ ｅ ｔ ｌｓ ｅ ｕ ｏ ｒ ｉｆ ｌ ｏ ｅｄ ｄ ｙｎ ｌ ｌ ａ ｎ ｕ ｒ ｎ ｏ ｓ ｓ ｄ ｅ ｔ ａ ｎａｌ ｎ ｆ ｌ ｒ ｉｇ ａｆ ｆ ｈ ｙ ｉ ｉ ａａ
luc双荧光素酶原理烟草
luc双荧光素酶原理烟草1. 引言luc双荧光素酶（luciferase）是一种广泛应用于生物学研究中的酶，其在烟草中的应用也得到了广泛关注。
luc双荧光素酶能够发出可见光，并且反应速度快、灵敏度高，因此被广泛用于检测和研究生物体内的活性物质。
2. luc双荧光素酶的原理luc双荧光素酶是一种催化荧光发光的酶，其底物是双荧光素（luciferin）。
当双荧光素与luc双荧光素酶结合时，酶催化荧光素氧化反应，产生光和二氧化碳。
这个反应需要三个物质：双荧光素、luc双荧光素酶和三磷酸腺苷（ATP）。
当这三个物质在合适的条件下混合时，就会发生发光反应。
3. luc双荧光素酶在烟草中的应用3.1 基因表达luc双荧光素酶被广泛用于研究基因表达。
研究人员可以将luc双荧光素酶基因导入烟草细胞中，使其与目标基因连接在一起。
当目标基因表达时，luc双荧光素酶也会被表达出来，从而产生荧光信号。
通过测量荧光信号的强度，可以间接地了解目标基因的表达水平。
3.2 转基因研究luc双荧光素酶在转基因研究中也扮演着重要角色。
研究人员可以将luc双荧光素酶基因导入烟草细胞中，使其与目标基因一起表达。
通过测量荧光信号的强度，可以了解目标基因的表达情况以及在不同条件下的变化。
这对于研究基因的功能和调控机制非常重要。
3.3 生物传感器luc双荧光素酶也可以被用作生物传感器。
研究人员可以将感兴趣的分子与luc双荧光素酶结合，当这些分子存在时，luc双荧光素酶会发出荧光信号。
通过测量荧光信号的强度，可以确定感兴趣分子的存在和浓度。
这种生物传感器可以应用于环境监测、食品安全、生物医学等领域。
4. 结论luc双荧光素酶作为一种重要的生物学工具，在烟草中的应用具有广泛的前景。
它可以用于基因表达研究、转基因研究以及生物传感器的开发。
通过利用luc双荧光素酶的荧光信号，研究人员可以更好地了解和研究生物体内的活性物质。
随着技术的不断进步，luc双荧光素酶在烟草中的应用将会越来越广泛，为生物学研究带来更多的可能性。
大豆叶绿体转化载体pJY系列的构建及其在烟草上的转化研究.
大豆叶绿体转化载体pJY系列的构建及其在烟草上的转化研究2010-07-06为解决杂交大豆(Glycine max)制种过程中不育系易与保持系混杂的问题,开展了大豆叶绿体转基因的研究.通过转基因方法在不育系的细胞质中植入筛选标记基因,以区分不育系和保持系.根据已发表的大豆叶绿体序列(GenBank X07675)设计引物,用PCR方法获得两段大豆叶绿体同源重组序列LHRR和RHRR,克隆到质粒pUC19中,并将来源于质粒pTF102的壮观霉素抗性基因aadA克隆到两段同源重组序列之间,以构建大豆叶绿体转化表达载体pJY01.aadA基因的启动子Prrn和终止子psbA基因3′序列,分别从烟草叶绿体基因组中扩增而来.在此基础上,将草丁膦抗性基因或绿色荧光蛋白与GUS的融合蛋白基因克隆到该载体上,得到pJY03与pJY04,并初步应用于烟草(Nicotiana tobacum)的叶绿体转化,获得了具壮观霉素抗性的绿色愈伤和幼苗,PCR扩增出aadA基因的'条带,并在激光共聚焦扫描下检测到GFP的表达.作者：陈飒李金耀吴平孙寰赵丽梅寿惠霞 CHEN Sa LI Jin-yao WU Ping SUN Huan ZHAO Li-mei SHOU Hui-xia 作者单位：陈飒,吴平,寿惠霞,CHEN Sa,WU Ping,SHOU Hui-xia(浙江大学生命科学学院,杭州,310029)李金耀,LI Jin-yao(浙江大学生命科学学院,杭州,310029;新疆大学生命科学学院,乌鲁木齐,830046)孙寰,赵丽梅,SUN Huan,ZHAO Li-mei(国家转基因植物中试与产业化基地,公主岭,136100)刊名：农业生物技术学报 ISTIC PKU英文刊名：JOURNAL OF AGRICULTURAL BIOTECHNOLOGY 年，卷(期)：2006 14(6) 分类号：S188 关键词：大豆叶绿体转化表达载体GFP。
说明科技论文的特点
1.说明科技论文的特点，科技论文写作与发表的意义。
答：科技论文是科学技术人员或其他研究人员在科学实验(或试验)的基础上，对自然科学、工程技术科学、以及人文艺术研究领域的现象(或问题)进行科学分析、综合的研究和阐述，进一步的进行一些现象和问题的研究，总结和创新另外一些结果和结论，并按照各个科技期刊的要求进行电子和书面的表达。
特点：一是学术性：学术性是科技论文的主要特征，它以学术成果为表述对象，以学术见解为论文核心，在科学实验（或试验）的前提下阐述学术成果和学术见解，揭示事物发展、变化的客观规律，探索科技领域中的客观真理，推动科学技术的发展。
学术性是否强是衡量科技论文价值的标准。
二是创新性：科技论文必须是作者本人研究的，并在科学理论、方法或实践上获得的新的进展或突破，应体现与前人不同的新思维、新方法、新成果，以提高国内外学术同行的引文率。
三是科学性：论文的内容必须客观、真实，定性和定量准确，不允许丝毫虚假，要经得起他人的重复和实践检验；论文的表达形式也要具有科学性，论述应清楚明白，不能模棱两可，语言准确、规范。
科技论文写作与发表的意义：1)科技论文的写作是科技工作者进行科学技术研究的重要手段。
科技论文的写作是科学技术研究的一种手段，是科学技术研究工作的重要组成部分。
2)科技论文的发表可以促进学术交流。
写作与发表的科技论文则正是科技工作者之间进行科学思想交流的永久记录，也是科学的历史，它记载了探索真理的过程，记载了各种观测结果和研究结果，而科学技术研究是一种承上启下的连续性的工作，一项研究的结束可能是另一项研究的起点；因此，科技工作者通过论文写作与发表形式进行的学术交流，能促进研究成果的推广和应用，有利于科学事业的繁荣与发展。
3)科技论文的写作与发表有利于科学积累。
科技论文写作是信息的书面存储活动，通过论文的写作与发表，信息的传递将超越时空的限制，研究成果将作为文献保存下来，成为科学技术宝库的重要组成部分，为同时代人和后人提供科学技术知识，由整个人类所共享。
转基因食品的检测方法材料
生命科学前沿讲座论文转基因食品的检测方法姓名：陈继款系别：生命科学学院专业：生物信息学年级：2008级学号：080567011指导老师：薛李春总成绩：2010年07月02日转基因食品的检测方法自1983年世界第一例转基因作物问世以来，目前全球转基因农作物种植面积已达到5 000万hm2以上，大量的转基因农产品被直接或间接的制成人类的食品，呈迅猛发展的趋势。
但是转基因作物作为一种新物种，其对人体健康、生态平衡是否具有危害还未确定。
许多国家以立法或其他形式要求对转基因产品进行标记。
我国于2001年5月23日颁布《农业转基因生物安全管理条例》，2002年3月20日开始实行的《农业转基因生物标识管理办法》规定，国家对农业转基因生物实行检验检疫和标识制度。
世界各国均对转基因食品及其加工产品出具是否为转基因产品的认定报告。
因此转基因产品的检测就显得尤为重要。
转基因食品的检测主要从两个方面人手，一是核酸水平，即检测遗传物质中是否含有插入的外源基因；二是蛋白质水平，即通过插入外源基因表达的蛋白质产物或其功能进行检测，或者是检测插入外源基因对载体基因表达的影响，主要检测外源基因对插入位点附近基因影响及对其代谢产物的影响，由于该类型检测成本高，所需时间长，且被认为重要性较低，目前该类检测实际工作中较少涉及。
本文分别对核酸和蛋白质两种水平上的检测方法进行综述。
1核酸水平主要检测报告基因、启动子和终止子，是当前转基因产品检测的重要手段。
椰菜花叶病毒(CaMV)35s启动子、胭脂碱合酶NOS终止子等10多种基因和基因片段广泛存在于转基因植物中，这就为检测转基因食品提供了便利。
核酸水平的检测可以分为定性和定量两种。
1．1定性检测1．1．1聚合酶链式反应(PCR)1996年德国伯恩斯坦大学的Meyer Rolf等论证了PCR检测转基因食品的可能性。
利用该方法在鉴定转基因抗除草剂大豆RoundUp ReadyTM Soybean(RRS)和转基因抗虫玉米系列标准品Btl76 Maxi maizer的实验中，可以检测到仅为0．5％转基因成分。
《利用CRISPR-Cas9系统对本氏烟草基因编辑的基础研究》范文
《利用CRISPR-Cas9系统对本氏烟草基因编辑的基础研究》篇一利用CRISPR-Cas9系统对本氏烟草基因编辑的基础研究一、引言基因编辑技术作为现代生物学领域的一项重要突破，为研究生物体的基因组成和功能提供了全新的工具。
其中，CRISPR/Cas9系统因其高效、精确的基因编辑能力，在植物学、医学和农业等多个领域得到了广泛应用。
本氏烟草作为一种常见的植物模型，其基因编辑研究对于理解植物基因功能、改良作物品质和抗性具有重要意义。
本文旨在探讨利用CRISPR/Cas9系统对本氏烟草进行基因编辑的基础研究。
二、CRISPR/Cas9系统概述CRISPR/Cas9系统是一种基于细菌免疫系统的基因编辑技术，通过将特定的RNA引导的Cas9蛋白切割DNA，实现精确的基因编辑。
该系统具有操作简便、效率高、成本低等优点，为植物基因编辑研究提供了强大的工具。
三、本氏烟草基因编辑的实验设计本实验以本氏烟草为研究对象，针对特定基因进行编辑。
首先，通过生物信息学分析，确定目标基因的序列和功能。
然后，设计并合成针对目标基因的CRISPR/Cas9系统组件，包括sgRNA和Cas9蛋白。
将sgRNA和Cas9蛋白共同导入本氏烟草细胞中，实现精确的基因切割和编辑。
四、实验过程与结果1. 实验材料与方法：本实验所使用的本氏烟草为常见品种，实验室自行培育。
CRISPR/Cas9系统组件通过体外合成和转基因技术导入本氏烟草细胞中。
2. 实验步骤：首先对目标基因进行生物信息学分析，确定其序列和功能。
然后设计并合成sgRNA和Cas9蛋白。
将sgRNA和Cas9蛋白共同导入本氏烟草细胞中，通过显微镜观察细胞内基因编辑过程。
最后，通过PCR、测序等分子生物学技术验证基因编辑效果。
3. 实验结果：成功将CRISPR/Cas9系统导入本氏烟草细胞中，实现了目标基因的精确切割和编辑。
通过PCR、测序等分子生物学技术验证，发现编辑后的基因序列与预期相符，证明了CRISPR/Cas9系统在本氏烟草基因编辑中的有效性。
过表达玉米Zmsh1基因提高转基因烟草的生物量
生物技术进展２０１７年㊀第７卷㊀第３期㊀２０３~２１０ＣｕｒｒｅｎｔＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ㊀ＩＳＳＮ２０９５￣２３４１研究论文Ａｒｔｉｃｌｅｓ㊀收稿日期:２０１７￣０２￣２１ꎻ接受日期:２０１７￣０３￣２０㊀基金项目:吉林省科技发展计划项目(２０１６０５２００６０ＪＨ)资助ꎮ㊀作者简介:顾韩雪ꎬ硕士研究生ꎬ研究方向为植物生物化学与分子生物学研究ꎮＥ￣ｍａｉｌ:ｇｕｈａｎｘｕｅ０１＠１６３.ｃｏｍꎮ∗通信作者:郝东云ꎬ研究员ꎬ研究方向为农艺性状相关基因挖掘ꎮＥ￣ｍａｉｌ:ｄｙｈａｏ＠ｃｊａａｓ.ｃｏｍ过表达玉米Ｚｍｓｈ１基因提高转基因烟草的生物量顾韩雪１ꎬ２ꎬ㊀刘㊀玥１ꎬ㊀陈子奇３ꎬ㊀刘艳芝２ꎬ㊀刘相国２ꎬ㊀郝东云１ꎬ２∗１.吉林农业大学生命科学学院ꎬ长春１３０１１８ꎻ２.吉林省农业科学院农业生物技术研究所ꎬ吉林省农业生物技术重点实验室ꎬ长春１３００３３ꎻ３.哈尔滨师范大学生命科学学院ꎬ哈尔滨１５００８０摘㊀要:蔗糖合成酶(ＳｕＳｙ)是调控植物体内蔗糖代谢的一类关键酶ꎬ而ＳＨ１是玉米ＳｕＳｙ的一种亚型ꎮ研究表明ꎬ玉米ＳｕＳｙ催化活性主要由ＳＨ１基因(Ｚｍｓｈ１)决定ꎬ该基因在玉米分子育种中的价值评估是人们关注的热点ꎮ利用农杆菌介导法将玉米Ｚｍｓｈ１转入模式植物烟草中ꎬ发现转基因烟草中ＳＨ１酶活力比野生型烟草平均提高了３５％ꎬ根和茎的糖代谢关键产物蔗糖和果糖的含量平均增加了２３％和２８％ꎻ同时ꎬＺｍｓｈ１的转入显著提高了转基因烟草的总生物量ꎮ研究结果为进一步在玉米中过表达Ｚｍｓｈ１ꎬ评估转基因玉米的产业化应用价值提供了重要的理论参考ꎮ关键词:蔗糖合成酶ꎻＺｍｓｈ１ꎻ转基因烟草ꎻ生物量ꎻ基因应用价值评估ＤＯＩ:１０.１９５８６/ｊ.２０９５￣２３４１.２０１７.０００８ＲｅｓｅａｒｃｈｏｎＥｎｈａｎｃｉｎｇｔｈｅＢｉｏｍａｓｓｏｆＴｒａｎｓｇｅｎｉｃＴｏｂａｃｃｏｂｙＯｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＺｍｓｈ１ＧｅｎｅｆｒｏｍＭａｉｚｅＧＵＨａｎｘｕｅ１ꎬ２ꎬＬＩＵＹｕｅ１ꎬＣＨＥＮＺｉｑｉ３ꎬＬＩＵＹａｎｚｈｉ２ꎬＬＩＵＸｉａｎｇｇｕｏ２ꎬＨＡＯＤｏｎｇｙｕｎ１ꎬ２∗１.ＣｏｌｌｅｇｅｏｆＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅｓꎬＪｉｌｉｎＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙꎬＣｈａｎｇｃｈｕｎ１３０１１８ꎬＣｈｉｎａꎻ２.ＪｉｌｉｎＰｒｏｖｉｎｃｉａｌＫｅｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙｏｆＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙꎬｌｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙꎬＪｉｌｉｎＡｃａｄｅｍｙｏｆＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＳｃｉｅｎｃｅｓꎬＣｈａｎｇｃｈｕｎ１３００３３ꎬＣｈｉｎａꎻ３.ＣｏｌｌｅｇｅｏｆＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅꎬＨａｒｂｉｎＮｏｒｍａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙꎬＨａｒｂｉｎ１５００８０ꎬＣｈｉｎａＡｂｓｔｒａｃｔ:Ｓｕｃｒｏｓｅｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ(ＳｕＳｙ)ｉｓａｃｒｕｃｉａｌｅｎｚｙｍｅｆａｍｉｌｙｒｅｇｕｌａｔｉｎｇｓｕｃｒｏｓｅｍｅｔａｂｏｌｉｓｍｉｎｐｌａｎｔｓ.ＳＨ１ｉｓｏｎｅｏｆｔｈｅｓｕｂｔｙｐｅｓｏｆＳｕＳｙｉｎｍａｉｚｅꎬａｎｄｉｔｓｅｎｃｏｄｉｎｇｇｅｎｅ(Ｚｍｓｈ１)ｐｌａｙｓａｍａｊｏｒｒｏｌｅｉｎｔｈｅｃａｔａｌｙｔｉｃａｃｔｉｖｉｔｙｏｆＳｕＳｙ.ＴｈｕｓꎬｔｈｅｅｖａｌｕａｔｉｏｎｏｆＺｍｓｈ１ｉｎｂｉｏｔｅｃｈｂｒｅｅｄｉｎｇｈａｓａｔｔｒａｃｔｅｄａｇｒｅａｔｄｅａｌｏｆａｔｔｅｎｔｉｏｎｉｎｒｅｃｅｎｔｙｅａｒｓ.ＩｎｔｈｉｓｓｔｕｄｙꎬｗｅｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄＺｍｓｈ１ｉｎｔｏｔｏｂａｃｃｏｂｙＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ￣ｍｅｄｉａｔｅｄｍｅｔｈｏｄ.ＴｈｅｒｅｓｕｌｔｓｓｈｏｗｅｄｔｈａｔꎬｅｎｚｙｍｅａｃｔｉｖｉｔｙｏｆＳＨ１ｉｎｔｈｅｔｒａｎｓｇｅｎｉｃｅｖｅｎｔｓｅｘｈｉｂｉｔｅｄａｎａｖｅｒａｇｅｏｆ３５％ｈｉｇｈｅｒｔｈａｎｔｈｅｗｉｌｄｔｙｐｅꎬａｎｄｃｏｎｔｅｎｔｓｏｆｔｈｅｋｅｙｍｅｔａｂｏｌｉｔｅｓｓｕｃｈａｓｓｕｃｒｏｓｅａｎｄｆｒｕｃｔｏｓｅｉｎｃｒｅａｓｅｄａｂｏｕｔ２３％ａｎｄ２８％ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙｉｎｔｈｅｒｏｏｔａｎｄｓｔｅｍｏｆｔｈｅｔｒａｎｓｇｅｎｉｃｅｖｅｎｔｓ.ＡｔｔｈｅｍｅａｎｔｉｍｅꎬｔｈｅｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｏｆＺｍｓｈ１ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｅｎｈａｎｃｅｄｔｈｅｂｉｏｍａｓｓｏｆｔｒａｎｓｇｅｎｉｃｔｏｂａｃｃｏ.ＴｈｉｓｐｒｅｌｉｍｉｎａｒｙｓｔｕｄｙｐｒｏｖｉｄｅｄｉｍｐｏｒｔａｎｔｒｅｆｅｒｅｎｃｅｆｏｒｐｒｏｖｉｎｇｃｏｎｃｅｐｔｏｆＺｍｓｈ１ｉｎｍａｉｚｅｂｉｏｔｅｃｈｂｒｅｅｄｉｎｇ.Ｋｅｙｗｏｒｄｓ:ＳｕＳｙꎻＺｍｓｈ１ꎻｔｒａｎｓｇｅｎｉｃｔｏｂａｃｃｏꎻｂｉｏｍａｓｓꎻｐｒｏｖｅｃｏｎｃｅｐｔｏｆｇｅｎｅ㊀㊀玉米是我国东北地区第一大作物ꎬ也是我国主要的粮食作物ꎮ玉米合成并在籽粒中大量积累淀粉是其主要的经济价值所在ꎬ蔗糖合成酶在这过程中起着关键作用ꎮ植物蔗糖合成酶(ｓｕｃｒｏｓｅｓｙｎｔｈａｓｅꎬＳｕＳｙ)是蔗糖进入淀粉代谢途径的首个关键酶ꎬ是１９９５年Ｃａｒｄｉｎｉ[１]首次在小麦胚芽中发现的ꎮ它是由分子量约为８３~１００ｋＤａ的亚基构成的四聚体[２]ꎮＳｕＳｙ由３个大家族组成ꎬ依次为单子叶植物ＳＵＳ族㊁双子叶植物ＳＵＳＹ１族和双子叶ＳＵＳＹＡ族[３ꎬ４]ꎮ玉米ＳｕＳｙ(即ＳＵＳ家族)包. All Rights Reserved.含３种亚型:ＳＨ１㊁ＳＵＳ１和ＳＵＳ３ꎬ其中ＳＨ１是３种亚型中的典型代表[５]ꎬ其编码基因为Ｚｍｓｈ１ꎮＺｍｓｈ１是由Ｃｈｏｕｒｅｙ[６]在玉米皱缩型胚乳突变体ｓｈ１(ｓｈｒｕｎｋｅｎ１)中发现的ꎬ其ｃＤＮＡ序列长度为２７４６ｂｐꎬＣＤＳ区序列长度为２４０９ｂｐꎬ编码８０３个氨基酸ꎬ蛋白分子量约为９１ｋＤａꎮ大多情况下ꎬＳｕＳｙ分解蔗糖(最适ｐＨ６.０~７.０)生成果糖和腺苷二磷酸葡萄糖(ＡＤＰＧ)ꎬ分解的产物参与植物淀粉合成以储存能量[７]ꎮ对于大多数植物来说ꎬ尤其是在以淀粉为主要储藏物质的组织器官中ꎬＳｕＳｙ的功能是非常重要的ꎮＢａｒｏｊａ￣Ｆｅｒｎｎｄｅｚ等[８]发现在马铃薯中过表达内源ＳｕＳｙ基因导致马铃薯块茎膨大ꎬＳｕＳｙ酶活升高ꎻＴａｎｇ等[９]在胡萝卜中反义表达内源ＳｕＳｙ基因ꎬ结果表明储藏组织中的蔗糖利用率显著下降ꎬ蔗糖大量积累ꎬ淀粉㊁葡萄糖㊁果糖和纤维素也有较少量的积累ꎬ转化植株表型也受到影响ꎬ表现为植株矮小㊁叶面积减少[１０]ꎮＷｏｒｒｅｌｌ等[１１]曾在番茄中过表达Ｚｍｓｈ１ꎬ发现转基因番茄果实中ＳｕＳｙ的活性提高ꎬ改变了碳水化合物的分配ꎬ果实重量增加ꎬ表明过表达Ｚｍｓｈ１可以改善作物品质ꎬ提高作物产量ꎮＺｍｓｈ１主要存在于发育的胚乳中ꎬ表达活跃时期与淀粉积累时期重合ꎬ并且ＳｕＳｙ９０％的活性主要由Ｚｍｓｈ１调控[１２ꎬ１３]ꎬ说明该基因在改变作物品质和增加作物产量方面具有潜在的应用价值ꎮ在不同植物中有关过表达Ｚｍｓｈ１的研究至今很少报道ꎬ然而ꎬ该基因在作物特别是玉米生物技术育种中的价值评估(ｐｒｏｖｅｃｏｎｃｅｐｔ)是人们关注的热点ꎮ依据转基因生物技术育种流程ꎬ特定基因的应用价值评估是首要环节ꎬ通常以模式植物为先行实验材料ꎮ本课题组在模式植物烟草中过表达Ｚｍｓｈ１ꎬ通过对转基因烟草进行分子检测和生理指标测定ꎬ研究转基因烟草生物量的变化ꎬ探讨该基因对烟草生长发育㊁碳水化合物代谢以及生物量的影响ꎬ为实验室评估该基因在转基因玉米增产和品质改良等方面的育种价值ꎬ研究该基因参与玉米籽粒淀粉合成代谢机制提供了理论参考ꎮ１㊀材料与方法１.１㊀材料受体材料:大叶烟草(ＮｉｃｏｔｉａｎａｔａｂａｃｕｍＬ.)ꎬ由吉林省农业科学院生物技术研究所保存ꎮ大肠杆菌(Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ)感受态细胞ＤＨ５α和克隆载体ｐＥａｓｙ￣Ｂｌｕｎｔ购自北京全式金生物技术有限公司ꎻ农杆菌ＥＨＡ１０５和植物表达载体ｐＣＡＭ￣ＢＩＡ１３０２￣３５Ｓ￣ｇｆｐ由吉林省农业科学院生物所保存ꎮ试验试剂:限制性内切酶ＳｐｅⅠ㊁Ｔ４连接酶㊁ＰｒｉｍｅＳＴＡＲＨＳＤＮＡ聚合酶㊁ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔＲＴｒｅａｇｅｎｔ(ｇＤＮＡＥｒａｓｅｒ)反转录试剂盒㊁ＲＮＡｉｓｏＰｌｕｓＲＮＡ提取试剂盒㊁ＤＮＡＭａｒｋｅｒ均购自ＴａＫａＲａ公司ꎮ主要仪器设备:ＴＣ￣５１２ＰＣＲ仪(英国ＴＥＣＨＮＥ公司)㊁ＤＹＹ￣１０Ｃ型电泳仪(六一仪器厂)㊁ＣＨＢ￣１００恒温金属浴(杭州博日科技有限公司)㊁２￣１６ＰＫ台式冷冻高速离心机(德国ＳＩＧＭＡ公司)ꎮ１.２㊀Ｚｍｓｈ１基因克隆和植物表达载体的构建１.２.１㊀基因克隆㊀根据ＧｅｎＢａｎｋ(ｗｗｗ.ｎｃｂｉ.ｎｌｍ.ｎｉｈ.ｇｏｖ/ｇｅｎｂａｎｋ)提供的Ｚｍｓｈ１的核酸序列(ＧｅｎｅＩＤ:５４２３６５)设计克隆ＰＣＲ引物ꎬ提取玉米Ｂ７３叶片总ＲＮＡꎬ具体方法参照ＲＮＡｉｓｏＰｌｕｓ试剂盒说明书ꎮ反转录得到ｃＤＮＡꎬ具体方法参照ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔＲＴｒｅａｇｅｎｔ(ｇＤＮＡＥｒａｓｅｒ)反转录试剂盒说明书ꎮ以反转录ｃＤＮＡ为模版扩增ꎬ设计以限制性内切酶ＳｐｅⅠ为酶切位点的引物Ｚｍｓｈ１￣Ｌ:５ᶄ￣ＧＧＡＣＴＡＧＴＡＴＧＧＣＴＧＣＣＡＡＧＣＴＧＡＣＴＣＧ￣３ᶄ和Ｚｍｓｈ１￣Ｒ:５ᶄ￣ＧＧＡＣＴＡＧＴＡＴＣＧＡＡＧＧＡＣＡＧＣＧＧ￣ＡＡＣＣＴＧ￣３ᶄꎬＰＣＲ反应体系:１μＬ模板ＤＮＡꎬ上㊁下游引物各０.５μＬꎬ酶１０μＬꎬｄｄＨ２Ｏ８μＬꎮ程序:９５ħ５ｍｉｎꎻ９５ħ３０ｓꎬ５８ħ３０ｓꎬ７２ħ４０ｓꎬ３０个循环ꎻ７２ħ１０ｍｉｎꎮＰＣＲ产物经过胶回收纯化后连入克隆载体ꎬ转化到大肠杆菌感受态细胞中ꎬ培养后得到的菌液送大连宝生物公司测序ꎬ以确定克隆序列的正确性ꎮ利用ＣｌｕｓｔａｌＸ在线程序(ｈｔｔｐ://ｗｗｗ.ｃｌｕｓｔａｌ.ｏｒｇ/)比对出烟草(ＮｉｃｏｔｉａｎａｔａｂａｃｕｍＬ.)和玉米(ＺｅａｍａｙｓＬ.)ＳｕＳｙ氨基酸序列同源性为７４.７８％ꎮ１.２.２㊀植物表达载体构建和遗传转化㊀利用限制性内切酶ＳｐｅⅠ分别切割已经纯化的含有Ｚｍｓｈ１基因的ＰＣＲ产物ꎬ以及拟连接的植物表达载体质粒ｐＣＡＭＢＩＡ１３０２￣３５Ｓ￣ｇｆｐꎬ用Ｔ４连接酶３７ħ共孵育连接并转化至ＤＨ５α中ꎬ筛选获得重组质粒ꎬ命名为ｐＣＡＭＢＩＡ１３０２￣３５Ｓ￣Ｚｍｓｈ１￣ｇｆｐꎮ体系和反应条件参照Ｔ４ＤＮＡ连接酶说明书ꎮ采４０２生物技术进展ＣｕｒｒｅｎｔＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ. All Rights Reserved.用农杆菌介导的遗传转化方法转入烟草植株ꎮ获得Ｔ０代转基因植株ꎬＴ０代自交得到Ｔ１代转基因植株ꎮ１.３㊀转基因烟草的分子检测采用ＣＴＡＢ法[１４]ꎬ提取烟草叶片中的基因组ＤＮＡꎮ根据Ｚｍｓｈ１序列ꎬ设计ＰＣＲ特异性引物Ｚｍｓｈ１￣Ｌ:５ᶄ￣ＡＴＧＣＣＴＣＣＴＴＴＣＣＴＣＧＴＣＣＴ￣３ᶄꎻＺｍｓｈ１￣Ｒ:５ᶄ￣ＣＴＣＡＣＧＴＡＣＴＴＣＣＡＧＡＡＣＣＣＧ￣３ᶄꎮＰＣＲ扩增体系和反应程序参考大连宝生物公司技术说明书ꎮ扩增产物进行１％的琼脂糖凝胶电泳(电压１３５Ｖ)ꎬ在紫外凝胶成像仪下观察ＰＣＲ电泳结果ꎮ１.４㊀ＲＴ￣ＰＣＲ分析设计ＲＴ￣ＰＣＲ引物ꎬ提取转基因烟草总ＲＮＡꎬ方法参照ＲＮＡｉｓｏＰｌｕｓ试剂盒说明书ꎬ将ＲＮＡ反转录为ｃＤＮＡꎬ方法参照ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔＲＴｒｅａｇｅｎｔ(ｇＤＮＡＥｒａｓｅｒ)试剂盒说明书ꎮ正反方向引物分别为:ＲＴ￣Ｚｍｓｈ１￣Ｌ:５ᶄ￣ＡＴＧＣＣＴＣＣＴＴＴＣ￣ＣＴＣＧＴＣＣＴ￣３ᶄ和ＲＴ￣Ｚｍｓｈ１￣Ｒ:５ᶄ￣ＴＣＧＴＣＧＴＧＣ￣ＣＣＴＴＧＴＡＧＴＴＡＴＧ￣３ᶄꎮ１.５㊀蔗糖合成酶酶活分析酶活测定方法采用蛋白计量方法ꎬ具体参照Ｚｈｕ等[１５]的方法ꎮ１.６㊀蔗糖含量测定蔗糖含量用比色法测定ꎬ具体步骤参照Ｒｏｅ等[１６]的方法ꎮ１.７㊀果糖含量测定果糖含量用比色法测定ꎬ具体步骤参照李合生等[１４]的方法ꎮ１.８㊀数据分析用ＳＰＳＳ１７.０软件对试验数据进行统计学分析[１７]ꎮ２㊀结果与分析２.１㊀转基因烟草的ＰＣＲ验证选取３株Ｔ１代转基因烟草(分别为转化事件９＃㊁转化事件４＃和转化事件７＃)作为实验对象ꎮ为验证经农杆菌转化获得的烟草植株是否为阳性转基因材料ꎬ提取Ｔ１代烟草叶片的基因组ＤＮＡꎬ以转化质粒为阳性对照㊁Ｚｍｓｈ１基因部分序列为目标产物㊁野生型烟草植株为阴性对照㊁水为空白对照ꎬ进行ＰＣＲ检测ꎬ产物经１％琼脂糖凝胶电泳检测(图１)ꎬ目标产物条带大小为４４６ｂｐꎬ与预期结果一致ꎬ初步表明获得转基因阳性烟草ꎮ图１㊀转基因烟草Ｚｍｓｈ１基因ＰＣＲ产物电泳结果Ｆｉｇ.１㊀ＥｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓｒｅｓｕｌｔｓｏｆＺｍｓｈ１ＰＣＲｐｒｏｄｕｃｔｓｉｎｔｈｅｔｒａｎｓｇｅｎｉｃｔｏｂａｃｃｏ.Ｍ:Ｍａｒｋｅｒ(ＤＬ２０００)ꎻ１:转化质粒(阳性对照)ꎻ２:野生型烟草(阴性对照)ꎻ３~５:转化事件９＃ꎻ６~８:转化事件４＃ꎻ９ꎬ１０:转化事件７＃ꎻ１１:水(空白对照)ꎮ２.２㊀Ｚｍｓｈ１基因表达分析为分析Ｚｍｓｈ１基因在转基因烟草植株中是否转录表达ꎬ提取Ｔ１代转Ｚｍｓｈ１基因烟草植株叶片总ＲＮＡꎬ将ＲＮＡ反转录成ｃＤＮＡꎬ进行ＲＴ￣ＰＣＲ分析ꎮ以烟草保守基因Ｌ２５作为内参基因ꎬＺｍｓｈ１为目的基因ꎬ野生型烟草植株为阴性对照ꎬ水为空白对照ꎮ结果(图２)表明ꎬ转基因烟草和野生型烟草的内参基因均具有较好的扩增效率ꎬ图２㊀转基因烟草中Ｚｍｓｈ１(Ａ)和内参Ｌ２５(Ｂ)基因的ＲＴ￣ＰＣＲ产物Ｆｉｇ.２㊀ＲＴ￣ＰＣＲｐｒｏｄｕｃｔｓｏｆＺｍｓｈ１(Ａ)ａｎｄｉｎｔｅｒｎａｌｃｏｎｔｒｏｌｇｅｎｅＬ２５(Ｂ)ｉｎｔｈｅｔｒａｎｓｇｅｎｉｃｔｏｂａｃｃｏ.Ｍ:ＤＬ２０００Ｍａｒｋｅｒꎻ１:转化事件９＃ꎻ２:转化事件４＃ꎻ３:转化事件７＃ꎻ４:野生型烟草ꎻ５:水(空白对照)５０２顾韩雪ꎬ等:过表达玉米Ｚｍｓｈ１基因提高转基因烟草的生物量. All Rights Reserved.说明ＲＮＡ质量完好(图２Ｂ)ꎮ阴性对照和空白对照均无条带ꎬ１~３泳道为转基因烟草ꎬ能扩增出４４６ｂｐ的目标片段(图２Ａ)ꎬ与目的基因理论片段大小一致ꎬ表明玉米Ｚｍｓｈ１基因在烟草植株中能够正常转录表达ꎮ进一步证明获得转基因阳性烟草ꎮ２.３㊀转基因烟草中蔗糖合成酶活力测定为验证转基因烟草中的蔗糖合成酶具有生物学活性ꎬ本实验结合前人蔗糖诱导光敏色素相互作用因子的表达实验[１８]ꎬ选取光合作用的主要场所 叶片(采摘自苗期Ｔ１代烟草)为实验对象ꎬ采用紫外分光光度法测定ＯＤ值ꎬ对照标准曲线ꎬ由公式计算得到蔗糖合成酶活力ꎮ结果表明:转基因烟草中蔗糖合成酶活力均比野生型烟草高ꎬ转化事件９＃的蔗糖合成酶活力最高ꎬ约为野生型烟草的１.５倍(图３)ꎮ２.４㊀转基因烟草中蔗糖含量测定植物中蔗糖合成酶催化反应的底物是蔗糖ꎬ为探究转基因烟草中蔗糖合成酶活力升高对蔗糖含量的影响ꎬ以进一步验证Ｚｍｓｈ１在转基因烟草中的功能ꎬ本研究应用比色法测定现蕾期和开花期Ｔ１代转基因烟草不同部位的蔗糖含量ꎮ结果表明ꎬ转基因烟草与野生型烟草的叶和叶脉中蔗糖含量均高于根和茎ꎮ现蕾期的转基因烟草根中的蔗糖含量高于野生型烟草ꎬ在叶和叶脉中蔗糖含量低于野生型烟草ꎻ开花期的转基因烟草根㊁茎㊁叶㊁叶脉中蔗糖含量均高于野生型烟草(表１)ꎮ２.５㊀转基因烟草中果糖含量测定为验证蔗糖合成酶活力升高能否促进植物中蔗糖代谢ꎬ生成果糖ꎮ本研究应用比色法测定现蕾期和开花期Ｔ１代烟草根㊁茎㊁叶㊁叶脉中果糖的图３㊀蔗糖合成酶的活性测定Ｆｉｇ.３㊀Ａｃｔｉｖｉｔｙｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｏｆｓｕｃｒｏｓｅｓｙｎｔｈａｓｅ.ＷＴ:野生型烟草ꎻ９＃ꎬ４＃ꎬ７＃:转基因烟草ꎮ表１㊀转基因烟草蔗糖含量Ｔａｂｌｅ１㊀Ｓｕｃｒｏｓｅｃｏｎｔｅｎｔｉｎｔｈｅｔｒａｎｓｇｅｎｉｃｔｏｂａｃｃｏ.野生型烟草(ｍｇ/ｇ)转基因烟草９＃(ｍｇ/ｇ)４＃(ｍｇ/ｇ)７＃(ｍｇ/ｇ)现蕾期根５８.３ʃ３.２７６.７ʃ５.６∗５９.６ʃ２.４６３.１ʃ６.１茎６１.９ʃ１１.８９５.４ʃ１５.３∗５２.３ʃ９.７７２.３ʃ４.４∗叶３１９.５ʃ１１.９２７０.５ʃ１４.８∗３００.３ʃ１５.９２９８.３ʃ８.７∗叶脉１５６.６ʃ１.６１３４.３ʃ４.３１３６.８ʃ８.２１４１.２ʃ７.４开花期根５８.０ʃ２.６６８.７ʃ１０.５６０.１ʃ８.１６５.９ʃ７.７茎４２.３ʃ１０.４６５.７ʃ６.６∗４６.１ʃ４.２４８.９ʃ７.６叶２８９.８ʃ６.６３７２.６ʃ３.１∗３１０.６ʃ８.５３２９.９ʃ４.６叶脉１９３.７ʃ１１.５２０５.０ʃ４.３２００.６ʃ６.１２０１.５ʃ５.２㊀注:数据为平均值ʃ标准误ꎬ∗表示与野生型相比在Ｐ<０.０５水平上差异显著ꎮ６０２生物技术进展ＣｕｒｒｅｎｔＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ. All Rights Reserved.含量ꎮ结果表明(表２)ꎬ现蕾期的野生型烟草和转基因烟草植株中ꎬ茎>叶脉>根>叶ꎬ转基因烟草相比野生型烟草ꎬ各部位果糖含量均较高于野生型烟草ꎬ茎中相差较大ꎻ开花期时ꎬ野生型烟草植株中果糖含量:叶>茎>根>叶脉ꎻ在转基因烟草中:茎>叶>叶脉>根ꎮ２.６㊀转基因烟草的生理指标观测为检验Ｚｍｓｈ１对烟草生长和发育的影响ꎬ本研究对Ｔ１代转基因烟草的生物量积累和与光合作用有关的生理指标进行观察ꎮ分别以转化事件４＃㊁７＃㊁９＃为观察对象ꎬ连续测量烟草整个生长期的株高变化ꎬ结果表明:转基因烟草生长表现为苗期生长缓慢ꎬ株高比野生型烟草矮ꎬ营养期和生殖期生长迅速ꎬ到生殖生长结束时株高比野生型烟草高(图４)ꎮ由于农杆菌介导法将外源基因转入烟草基因组时插入位点的随机性ꎬ导致３个转化事件９＃㊁４＃㊁７＃烟草的株高等表型出现差异ꎮ比较转基因烟草和野生型烟草生物量ꎬ结果表明ꎬ转基因烟草较野生型烟草生物量显著增加(表３和图６ꎬ彩图见图版二)ꎮ连续观测其生长期内１２０ｄ的叶绿素含量ꎬ结果表明ꎬ转基因烟草的叶绿素含量较野生型在生长初期含量较低ꎬ两个月后叶绿素含量持续升高并最终高于野生型(图５)ꎮ３㊀讨论本研究在烟草中过表达了玉米蔗糖合成酶基因Ｚｍｓｈ１ꎬ该基因的转入增加了转基因烟草中蔗表２㊀转基因烟草果糖含量Ｔａｂｌｅ２㊀Ｆｒｕｃｔｏｓｅｃｏｎｔｅｎｔｉｎｔｈｅｔｒａｎｓｇｅｎｉｃｅｖｅｎｔｓ.野生型烟草(ｍｇ/ｇ)转基因烟草９＃(ｍｇ/ｇ)４＃(ｍｇ/ｇ)７＃(ｍｇ/ｇ)现蕾期根５５.４ʃ６.６７９.３ʃ８.７∗５６.２ʃ３.７６８.７ʃ４.２茎１６０.７ʃ１０.７２４９.３ʃ１４.２∗１７１.３ʃ１３.５１８０.５ʃ９.１∗叶５０.６ʃ１.０８５.０ʃ５.１∗６０.１ʃ６.５７２.１ʃ５.１∗叶脉８２.７ʃ７.５１１１.１ʃ８.４∗８３.７ʃ６.２８９.６ʃ８.９开花期根３０.１ʃ１.０５９.４ʃ１０.５∗３２.６ʃ４.２４０.２ʃ６.５∗茎８９.４ʃ６.４１５９.５ʃ９.６∗９６.３ʃ１０.１９９.５ʃ７.９叶９３.９ʃ０.４８０.３ʃ１.０∗９０.１ʃ８.７８７.６ʃ８.１叶脉４１.１ʃ６.５６５.１ʃ０.６∗４６.８ʃ４.７４９.２ʃ６.４㊀注:数据为平均值ʃ标准误ꎬ∗表示与野生型相比在Ｐ<０.０５水平上差异显著ꎮ图４㊀转基因烟草株高Ｆｉｇ.４㊀Ｐｌａｎｔｈｅｉｇｈｔｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔｉｎｔｈｅｔｒａｎｓｇｅｎｉｃｅｖｅｎｔｓ.ＷＴ:野生型烟草ꎻ９＃ꎬ４＃ꎬ７＃:转基因烟草ꎮ７０２顾韩雪ꎬ等:过表达玉米Ｚｍｓｈ１基因提高转基因烟草的生物量. All Rights Reserved.图５㊀转基因烟草叶绿素含量Ｆｉｇ.５㊀Ｃｈｌｏｒｏｐｈｙｌｌｃｏｎｔｅｎｔｉｎｔｈｅｔｒａｎｓｇｅｎｉｃｅｖｅｎｔｓ.ＷＴ:野生型烟草ꎻ９＃ꎬ４＃ꎬ７＃:转基因烟草ꎮ图６㊀转基因烟草与野生型烟草植株的对比Ｆｉｇ.６㊀Ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉｃａｌｃｏｍｐａｒｉｓｏｎｂｅｔｗｅｅｎｔｈｅｔｒａｎｓｇｅｎｉｃｅｖｅｎｔｓａｎｄｉｔｓｗｉｌｄｔｙｐｅ.ＷＴ:野生型烟草ꎻ９＃ꎬ４＃ꎬ７＃:转基因烟草ꎮＡ:转基因烟草和野生型烟草植株比较ꎻＢ:９＃转基因烟草根部以上长５ｃｍ茎段ꎻＣ:野生型烟草根部以上长５ｃｍ茎段ꎮ(彩图见图版二)表３㊀转基因与非转基因烟草生物量相关生理指标对比Ｔａｂｌｅ３㊀Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎｏｆｂｉｏｍａｓｓ￣ｒｅｌａｔｉｎｇｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓｂｅｔｗｅｅｎｔｈｅｔｒａｎｓｇｅｎｉｃｅｖｅｎｔｓａｎｄｉｔｓｗｉｌｄｔｙｐｅ.千粒重(ｇ)茎秆粗(ｃｍ)鲜重(ｇ/株)根茎叶干重(ｇ/株)根茎叶株高(ｃｍ)叶绿素(ＰＡＤ)９＃１.２ʃ０.２∗１.２ʃ０.１∗６.８ʃ０.２∗３２.３ʃ２.９∗１０５.３ʃ７.９∗１.１ʃ０.１∗４.４ʃ０.６∗８.１ʃ０.８∗４４.４ʃ８.８∗１８０２.４ʃ９.５４＃０.９ʃ０.１０.８ʃ０.１５.０ʃ０.４２４.３ʃ３.８７４.２ʃ９.３∗０.７ʃ０.１２.７ʃ０.３５.０ʃ１.３３７.２ʃ４.３１７４２.３ʃ７.９７＃０.９ʃ０.２０.９ʃ０.１５.５ʃ０.５２５.１ʃ３.４∗８５.１ʃ８.４∗０.８ʃ０.３２.９ʃ０.２５.３ʃ０.６３６.９ʃ６.６１７９０.１ʃ１２ＷＴ０.８ʃ０.１０.７ʃ０.１４.１ʃ０.１２０.４ʃ１.６６８.７ʃ４.５０.７ʃ０.１２.２ʃ０.１４.７ʃ０.３３０.３ʃ４.３１７０６.３ʃ９.３㊀注:９＃㊁４＃㊁７＃:转基因烟草ꎻＷＴ:野生型烟草ꎮ数据为平均值ʃ标准误ꎬ∗表示与野生型相比在Ｐ<０.０５水平上差异显著ꎮ８０２生物技术进展ＣｕｒｒｅｎｔＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ. All Rights Reserved.糖合成酶的活性ꎬ在不同转化事件中该酶的活性表现程度有所不同ꎮ这可能是由于外源基因插入烟草基因组的位置不同所致ꎬ也可能由于玉米Ｚｍｓｈ１基因的表达通过某种机制影响了烟草内源ＳｕＳｙ等酶的活性ꎮ然而ꎬ外源基因是否影响植物內源基因的表达ꎬ还需要进一步实验证明ꎮ蔗糖作为主要的能量来源和调控植物生长发育的信号分子ꎬ在植物生长发育中起着举足轻重的作用[４ꎬ１９]ꎮ蔗糖作为光合作用的终产物ꎬ被蔗糖酶水解为单糖而参加器官建成[２０]ꎮＱｕｙｎｈ等[２１]研究表明:光合作用增强和光合性蔗糖的合成增加驱动了蔗糖含量增加ꎬ可能导致光合作用固定碳的增加ꎮＢａｒｏｊａ￣Ｆｅｒｎｎｄｅｚ等[８]研究发现:在马铃薯中过表达ＳＵＳ４ꎬ导致块茎中果糖增加１２％ꎮ本实验研究结果与前人研究结果相似ꎮ本研究数据表明:与野生型烟草相比ꎬ开花期的转基因烟草根㊁茎㊁叶的蔗糖含量均有显著升高ꎬ整株蔗糖含量平均升高１７％ꎮ转基因烟草果糖含量测定结果表明:转基因烟草不同部位中的果糖水平均显著高于野生型烟草ꎬ整株果糖含量平均升高２５％ꎮ在胡萝卜[９]㊁马铃薯[１８]㊁番茄[２２]中ꎬ抑制ＳｕＳｙ酶活性可能会导致叶片和根变小㊁块茎干重降低ꎬ植株矮小等不利表型ꎮ本研究过表达Ｚｍｓｈ１基因后ꎬ转基因烟草生长发育也会受到影响ꎮ转基因烟草苗期生长缓慢ꎬ较之野生型烟草矮ꎻ营养期和生殖期生长迅速ꎬ在生殖生长结束后ꎬ株高均高于野生型烟草ꎮ除此之外ꎬ本研究还发现过表达Ｚｍｓｈ１基因后ꎬ转基因烟草除株高外其他生物量也显著增多ꎬ如:转基因烟草的千粒重增加ꎻ茎秆更粗壮ꎻ根㊁茎㊁叶的干重增多ꎮ这可能是由于细胞中的蔗糖被ＳＨ１分解为淀粉合成底物ＡＤＰＧꎬ促进了各器官中淀粉的生成[２３]ꎮ在马铃薯中过表达ＳＵＳ４导致ＳｕＳｙ酶活增加ꎬ马铃薯干重增多[８]ꎮＷａｎｇ等[２４]在番茄中过表达ＳｕＳｙ基因增加了番茄果实鲜重ꎬ提高了产量ꎮ本研究发现ꎬ与野生型烟草相比ꎬ转基因烟草根㊁茎㊁叶的干重分别平均增加了２３％㊁５５％和４０％ꎬ千粒重增加了３３％ꎮ实验结果与前人研究相似ꎬ并且转Ｚｍｓｈ１烟草的生物量积累更多ꎮ上述研究为进一步应用Ｚｍｓｈ１基因改良玉米㊁大豆㊁甘蔗等经济作物ꎬ提高产量ꎬ优化果实糖分㊁淀粉等生物性状提供了重要的理论数据参考ꎮ参㊀考㊀文㊀献[１]㊀ＣａｒｄｉｎｉＣＥꎬＬｅｌｏｉｒＬＦꎬＣｈｉｒｉｂｏｇａＪ.Ｔｈｅｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓｏｆｓｕ￣ｃｒｏｓｅ[Ｊ].Ｂｉｏｌ.Ｃｈｅｍ.ꎬ１９５５ꎬ２１４(１):１４９－１５５. 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All Rights Reserved.。
烟草种间叶肉原生质体融合方法的研究
烟草种间叶肉原生质体融合方法的研究烟草（NicotianatabacumL.）是众多烟草品种中最重要的一种，在植物学上它以高产量、易于栽培和高品质等特点被广泛应用。
烟草叶肉原生质体（NT-L-protoplasts）被认为是一种重要的转基因工具，可以用来引入预定遗传物质到植物，从而调控和定向改变植物形态和性状。
最近研究发现，不同烟草品种之间的叶肉原生质体融合技术可用于合成叶肉原生质体和类似细胞，可用于植物转基因研究以及开发植物新品种。
一般来说，烟草种间叶肉原生质体融合分为三个步骤，即叶肉原生质体浓缩分离、原生质体融合、重组叶肉原生质体复制并诱导逆境基因表达。
首先，在烟草叶片表皮层下细胞悬浮液中，可以通过低温及抗菌剂（如多甲唑酮）的处理，制备能够分离的烟草叶肉原生质体。
在处理过程中，悬浮液中的植物细胞会受到压力，细胞膜上的抗压蛋白会被激活，促使细胞膜发生融合，从而得到原生质体。
其次，利用浓缩后的原生质体和不同品种烟草叶肉细胞悬液，进行叶肉原生质体融合，从而获得重组叶肉原生质体。
最后，利用原生质体复制系统，可得到大量细胞复制物，即原生质体复制体，用以实现烟草种间叶肉原生质体的快速复制和广泛应用。
烟草种间叶肉原生质体融合技术可以获得新的烟草品种，它可以实现新品种的调控、改良和识别，为烟草科植物遗传改良提供了新方法。
因此，为了探索烟草种间叶肉原生质体融合技术的机理，并有效地应用烟草叶肉原生质体技术，未来研究将继续探究叶肉原生质体融合的机制，并且通过这些方法持续改良烟草种间叶肉原生质体的性能，期望获得更高品质的烟草新品种。
因此，研究烟草种间叶肉原生质体融合技术，将有助于提高烟草品种的品质和产量，为烟草科植物遗传改良、生物质能利用及烟草品种改良等提供新的途径。
未来，可以通过进一步开展烟草种间叶肉原生质体融合方法的研究，以及开发新方法和技术，以改善烟草品种品质，为烟草行业发展带来新的变化。
综上所述，烟草种间叶肉原生质体融合技术的研究具有重大的意义，它不仅可以提高烟草品种的品质和产量，而且还可以为烟草科植物遗传改良、生物质能利用和烟草品种改良提供新的方法。
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摘 要 ： 本 研 究建 立 了转 基 因烟 草 常 用 调 控 基 因 ３ Ｓ启 动 子 和 ， 终 止 子 、 标 记 基 因 ｎ ｔ ５ ｐ －Ｈ和 目的 基 因 Ｔ － Ｐ的 ＭＶ Ｃ
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中图 分 类 号 ：Ｑ ８ ；Ｑ ８ ７ １ ７４
文 献 标 识 码 ：Ａ
Ｓｔ ｙ ｏ ｄｅ ｅ ｔｖ ｔ ｃ ｕｄ ｎ ｔ ｃ ｉ ｅ ｅ ｈｎｉ ｑｕｅ ｆ ｒ ｎ ｇ ｎ ｃ ｔ ｂａ ｃ ｏｒ ｔ ａ ｓ ｅ ｉ ｏ ｃ ｏ
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转 基 因研 究 已成 为现 代 分 子生 物 学 最 为 活跃 的 领 域 之一 ， 以抗 病 、 虫 等 为 目的 的转 基 因 烟草 研 究 抗 已取 得 丰 硕 成 果 ，有 的 品种 已 商业 化 或 大 田种 植 ，
Ｚ ＨＯＵ Ｌ － ｉ ｇ ，ＸＵ Ｚ － ｈ ｎ ｉ ｂｎ ｉｚ ｏｇ
（．ｕ ｎ ｎ Ｅ ｉ ａ ｄ Ｅ ｔ ｎｐ ｃｏ ｎ ａａｔ ｅ Ｂ ｒａ ， ｕ ｍｉｇ６ ０ ２ ； １ ｎ ａ ｘｔ ｎ ｎｒ Ｉｓｅ ｔ ｎ ａｄ Ｑｕｒ ｉ ｕｅｕ Ｋ ｎ ｎ ５ ２ ８ Ｙ ｙ ｉ ｎ ｎ
ｓ ｃ ｅ ｓｕ ｙ ａ ｃ ｍｐ ｉｈ ｄ ｐ ｂ ｎ ｅ ｅ ｔ ｎ ｂ ｓｎ ｏ ｓ ｕ ｔｄ ｐ Ｃ１ ｐ ａ ｍｉ ｅ ｌｔ ｓ ｆｒ ３ Ｓ ａ ｄ ／ ￥ Ｔ ｅ ｕ ｃ ｓ ｆ ｌ ｃ ｏ ｌ ｅ ｒ ｉ ｇ ｄ ｔ ｃｉ ｙ ｕ ｉ ｇ ｃ ｎ ｔ ｃｅ Ｕ ８ ｌｓ ｄ ａ ｔ ｍｐ ａ ｅ ５ ｎ ｌ ． ｓ ｏ ｏ ｒ ｓ ｏ Ｏ ｈ
研 究 报 告
转 基 因烟 草 检 测 技 术 研 究
贾建 军 ，周 晓黎 ，董俊 ，花群 义 ，李 文贵 ，周 力 兵 ，徐 自忠
（ ．云 南 出入 境 检 验 检 疫 局 ，昆明 ６ ０ ２ １ ５ ２ ８；
２ ．云 南农 业 大 学 动 物 科 学技 术 学 院 ，昆明 ６ ０ ０ ） ５２ １
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文 章 编 号 ： ０ － ０ ２２ ０ ）４ ０ ５ — ４ １ ９ ００ （０ ２ — ２ ７ ０ ０ ０
立 了检 测 ３ Ｓ启 动 子 和 ， 终 止 子 的 分 子 杂 交技 术 。 交试 验 证 明 ， Ｃ 扩 增 的 ３ Ｓ启 动 子和 ， 终 止 子 为特 异 性 扩 ５ 杂 ＰＲ ５
增 产 物 。 此 项 检 测 技 术 具 有 快速 、 异 、 感 、 济 以 及 可 重 复 性 强 等优 点 。 特 敏 经 关 键 词 ： 转 基 因 烟 草 ；Ｐ Ｒ； 核 酸探 针 ； 检 测 技 术 Ｃ