转基因食品的检测方法

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《 中国食品添加剂》 ! ! ! ! ! ! ! ! ! *0-G7 <..F (FF-8-S92! ! ! ! ! ! ! ! ! "$$D! ’.@ E
转基因食品的检测方法
曹泽虹! 高明侠
（ 徐州工程学院食品工程系，徐州 ""#$$% ）
! ! 摘! 要：目前，世界各国对转基因食品的检测主要从外源 &’( 和蛋白质两种生物大分子入手，所广泛采 用的方法有聚合酶链式反应（ )*+ ） 、生物芯片技术（ ,-./0-12 ） 、酶联免疫吸附测定（ 3456( ） 和侧流技术 （ 4789:7; <;.=） 等。本文综述了各种方法的原理以及这些方法用于检测转基因食品时的优缺点。 关键词：转基因食品；检测 中图分类号：>6"$?@ A! ! ! ! 文献标识码：(! ! ! ! 文章编号：#$$B C "D#A （ "$$D ） $E C $#$$ C $B
构调整和食品卫生监督管理的重大课题。"$$# 年
9: 引论
"$ 世纪 ?$ 年代以来，随着以基因工程为特 征的现代生物技术的飞速发展，转基因技术在食 品资源改造中得到广泛应用。目前转基因食品中 大多来源于转基因农作物，"$$" 年全球转基因作 物的种植总面积达 D%?$ 万 0M" 。转基因品种具有 抗病虫害、高产、减少劳动投入等优点，给人Байду номын сангаас 带来了巨大的社会经济效益，但由于转基因品种 对于人体影响未经过长期检验，其对于生物多样 性的影响也没有明确的结果，因此转基因产品在 许多国家受到一定的质疑和抵制。为了能够对植 物性转基因食品做出综合评价，建立合适的方法 对转基因作物及食品进行检测非常重要。 对转基因食品食用安全性和营养质量评价是 "# 世纪我国食物资源的开发利用、食品产业的结
《 中国食品添加剂》 W W W W W W W W W 63’&= XHHJ #JJ’+’O%)W W W W W W W W W 1@@LW "HG Y 转化株的基因组 !"# 中是 否 含 有 转 入 的 !"#。 $%&&’&() 等用核酸印迹法杂交判断 *+ 玉米中 ,-./ #0 基因的 1// 02 片段和玉米内源基因 )31 （ 编码 #!4 葡萄糖焦磷酸化酶） 的 1/5 02 片段的存在。 !" !# 外源基因的定量检测 !" !" $# 定量 467 法 尽管采用特异 !"# 片段的定性 467 筛选方 法已广泛应用于 89: 食品的检测，一些国家将 此作为本国有关食品法规的标准检测方法，但是 随着各国 有 关 89: 标 签 法 的 建 立 和 不 断 完 善， 对食品中的 89: 含量的下限已有所规定。定性 筛选 467 本身具有的局限性（ 如因其高敏感性常 伴有假阳性现象，而操作上的误差加上一些反应 抑制因素亦可带来假阴性现象） 显现出来，其最 大的不 足 是 无 法 对 89: 进 行 定 量 分 析。为 此， 研究者们在定性筛选 467 方法的基础上，发展了 不同的定量 89: 的 467 检测方法。研究人员在 实验设计中引入内部参照反应以消除检测时的干 扰，并与已知含量的系列 89: 标准样品的 467 结果进行比较，从而可以半定量地检测待测样品 中的 89: 含量。目前定量检测方法如竞争性定 量 467 方法（ ;6 < 467 ） 和实时定量 467 方法 （ -%=> < +’?% 467 ） 已 被 一 些 国 家 的 政 府 实 验 室 采用。 !" !" $" $# 竞争性定量 467 法 构建理想的内标 是 竞 争 性 定 量 467 法 的 关 键。前提是假定内标具有和靶基因相同的动力学 特点 和 扩 增 效 率， 并 且 要 求 !"# 片 段 大 于 /@@02。目前，内 标 法 构 建 的 方 法 有：靶 基 因 扩 增产物的突变；限制性片段的插入或缺失；含靶 基因引物结合位点的非同源性 !"# 序列等。其中 通过 467 方法构建的探针结合位点核苷酸直接突 变构建内标物是目前应用最多、最方便的方法。 单竞争性 467 因为没有考虑样品分析中可能发生 的 !"# 降解，通常被用来进行半定量测定，适合 于原材料和未加工食品的分析。双竞争性 467 法 则同时考虑了 !"# 的断裂和扩增两个因素，并且 有应用设备成本相对较低的优点。其主要问题是 异源双链核酸分子的构成会改变 467 反应中靶基 因和内标扩增产物的比率，而异源双链核酸分子 有相似的电泳特性也会使随后的扩增产物的电泳 分析复杂化。5 个欧洲食物控制实验室在确认这 万方数据 /@1 些方法时比较了定量 467 检测方法的实验操作特 性。用 ;6 < 467 测定 *+/AB 玉米，平均值偏离真 实值的 < AC D /EC 左右。平均偏离 1C F /@C 。 能够确定大豆 !"# 中 @G 5C D 5BC 7HI&JI2 7%=J. 大豆的含量，7K! 为 1LC 左右。 !" !" $" !# 实时定量 467 法 来自日本、韩国和美国等的 /5 个实验室参加 的 针 对 L 个 品 种 转 基 因 玉 米 *+// 、 M1L 、 9:"E/@ 、8#1/ 、 NO%&+ /AB 和 / 种 转 基 因 大 豆 7HI&JI2 7%=J. 的研究结果显示，实时定量 467 方法能特异定量检测 89:，测定限 *+// 、 M1L 和 9:"E/@ 为 @G LC ， 而 对 8#1/ 、 NO%&+ /AB 和 7HI&JI2 7%=J. 大豆的为 @G /C ；盲样测试结果表 明这种方法可以应用于转基因作物标识制度的实 际检测。P=’+’>’&(H? 9 等应用实时定量 467 方法 可以在 !"# 抽提出 53 后检测出含 12( 的基因修 饰物质或 /( 待测样品中的基因组 !"#，并可以 在已确认的代表性的食物产品中检测出“ 9=Q’?’R S%-” 玉米和“ 7HI&JI2 7%=J. ” 大豆的含量。在 实时定量 467 方法检测 7HI&JI2 7%=J. 大豆加工 食品的实验中，/AT 个含大豆的不同的加工食品 如婴儿食品、减肥食品中有 5@ 个样品检出 89:， 其中 E 个 89: 的含量超过了 /C 。实时定量 467 特异测定 89: 的检测限（ U:; ） ，在实验上达到 了 5@ D L@ 个 目 的 分 子，接 近 理 论 预 期 值。 用 1@@( 植物基因组 !"# 为模板的 467，其测定限 从大米的 @G @1C 到小麦的 @G AC ，主要取决于目 的植物基因组的大小。实时定量 467 方法的主要 缺点是荧光标记探针会在一些食物基质中水解。 另外，操作的仪器较贵。 !" !" $" %# 467 < NUVK# 这是一种将 467 的高效性与 NUVK# 高特异性 结合在一起的检测方法，它利用地高辛或生物素 等标记引物，将 467 扩增产物与固相板上特异的 探针结合，再加入抗地高辛或生物素的酶标抗体 < 辣根过氧化物酶结合物，最后使底物显色，在 酶标仪上读取数值。利用 467 < NUVK# 法对转基 因大豆检测，灵敏度比欧盟推荐的 467 方 法 高 L D /@ 倍C 。它快速方便，避免了有毒物质 N* 的 使用，适合大批量自动检测。 !" !" $" &# 基因芯片（ (%&% ,3’2） 技术 基因芯片，又称 !"# 微阵列，是指将许多特
;: 外源基因的检测
目前对于外源基因的检测主要是通过对转入
作者简介：曹泽虹（ #TBA C ! ） ，女，副教授，研究方向：食品生物技术。
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万方数据
《 中国食品添加剂》 R R R R R R R R R "/01- S’’9 &99040T+.R R R R R R R R R ;<<6R %’J > 的外源基因进行 !"# 扩增，然后进行紫外或荧光 检测。!"# 技术全称“ 聚合酶链反应技术” ，是一 种在体外由引物介导的 $%& 聚合酶催化的聚合反 应，能在短时间内准确地将目的序列大量复制。 在转基因食品检测方面，主要是用于从 $%& 即基 因水平来鉴定被测食品。由于它的快速、灵敏、 费用低、检测仅需微量的 $%& 并且可以同时检测 多个 样 品， 正 成 为 这 一 领 域 日 趋 成 熟 的 方 法 之一。 !" #$ 外源基因的定性检测 !" #" #$ 聚合酶链式反应（ !’()*+,-.+ "/-01 #+-23 40’1 !"#） 目前对于外源基因的检测主要是通过对转入 的外源基因进行 !"# 扩增，然后进行紫外或荧光 检测。!"# 是在 $%& 聚合酶、引物及模板 $%& 存在的条件下对离体 $%& 进行扩增的一种方法。 要进行 !"# 扩 增 必 须 知 道 待 扩 增 $%& 的 序 列。 转基因食品中的外源基因不仅仅包括外源蛋白编 码序列，还包括选择性标记基因和对于外源基因 发挥作用所必须的功能基因。根据所选择的用作 模板的外源基因的不同，!"# 实验可分为不同的 类型。如果所选择的 $%& 序列是广泛存在于转基 因植物中的序列，如 567 启动子和 %87 终止子， 则这种实验将不具有专一性，这种扩增能检测出 多种不同的转基因食品。但如果所选择的扩增靶 序列既包括启动子又包括特定的外源基因，或者 是既包括特定的外源基因又包括终止子则 !"# 实 验将具有专一性。 !" #" !$ 巢式和半巢式 !"# （ 1+.4+9 !"# -19 .+*0 : 1+.4+9 !"#） 巢式 !"# （ 1+.4+9 !"#） 是在普通 !"# 基础 上发展起来的一种 !"# 技术，分子生物学研究和 医学检 测 方 面 研 究 较 多。其 原 理 是 设 计 两 对 引 物，其中一对引物在另一对引物扩增产物的片段 上，通过二次 !"# 反应对某个基因进行检测。通 常第一次采用能扩增较大片段的引物，经过 ;< : 5< 次循环扩增后，将第一次扩增的产物作为模板 进行 第 二 次 扩 增。 半 巢 式 !"# （ .+*0 : 1+.4+9 !"#）的原理与巢式 !"# 基本相同，只是半巢式 !"# 只有 一 对 半 引 物，有 一 个 引 物 被 用 于 二 次 !"# 反应中。这两种方法不但可以减少假阳性的 出现，而且可以使检测的下限下降几个数量级。 万方数据 因此，可以应用于对转基因食品进行 !"# 检测。 巢式 !"# 和半巢式 !"# 以其的特异性和灵 敏性已广泛应用于疾病的检测，以及许多分子生 物学的研究领域。从理论上来说，用巢式和半巢 式 !"# 可以检测到低于 =< : => ? @ !A 的 $%& 模板 量，但实际上由于食品中 $%& 的破坏，可供利 用的有效模板可能会远远低于其通过紫外分光光 度计测定的 $%& 模板量。但这并不影响巢式 !"# 和半巢式 !"# 对转基因食品的扩增。研究结果表 明，在 $%& 受 到 严 重 破 坏 的 大 豆 加 工 品 豆 油、 大豆磷脂以及其它产品中，用普通 !"# 不能完全 检出是否含有大豆成分和转基因大豆的成分，即 使检出，其重复性也不好。而利用巢式 !"# 和半 巢式 !"# 可以克服普通 !"# 的这一缺陷。在用 巢式和半巢式 !"# 对市场的食品原料和深加工食 品进行检测时，可以从大豆油、酱油、面酱、大 豆磷脂、豆腐、豆浆等食品原料和深加工食品的 =B 个品牌的食品中检测出大豆内标基因（ /’C.+3 D++E01? ?+1+ ） A+2401。其中，; 种食品原料和 深 加工食品的 == 个品牌的食品中检测出外源基因 "-FG567 : "H!> 基因片段，说明这些食品中含有 转基因大豆成分，占被检测食品的 BIJ 6K 。 在研究中 还 发 现，不 同 公 司 和 不 同 批 次 的 H-L $%& 聚合酶对普通 !"# 的扩增效率和检测下 限有较大的影响，而对巢式 !"# 和半巢式 !"# 的扩增反应影响相对较小。因此，巢式 !"# 和半 巢式 !"# 技术抗干扰性也是比较好 的。一 般 来 说，巢式 !"# 和半巢式 !"# 具有高度的特异性， 其结果一般不需要再用其他方法来验证 MN"G。 这是巢式 !"# 和半巢式 !"# 用于检测深加工转 基因食品的另一优点。 !" #" %$ 复合扩增 !"# （ FC(40E(+O !"#） 复合扩增 !"# 是在同一反应管中含有一对以 上引物，可 以 同 时 针 对 几 个 靶 位 点 进 行 检 测 的 !"# 技术。该技术不仅效率高，而且因为它是针 对多个靶位点进行同时检测，所以其检测效果较 之普通 !"# 更为可信。陶震、刘光明等人就利用 该方 法 同 时 检 测 待 测 大 豆、 马 铃 薯 等 样 品 的 "-FG567 启动子和 %87 终止子，均取得了满意的 结果。 !" #" &$ 核酸印迹法（ 7’C4/+,1 P(’4） QC 等人用核酸印迹法判断西红柿的假定的 =<=