滴金法检测幽门螺杆菌细胞毒素相关蛋白A抗体

滴金法检测幽门螺杆菌细胞毒素相关蛋白A 抗体试剂盒的研制及应用侯　瑜1,张　菊2,李质馨1,田洪艳1,刘晓冬1,徐　冶1(1.第四军医大学吉林军医学院组胚教研室,吉林　132013;2.第四军医大学全军基因诊断技术研究所,陕西西安　710033)摘要:目的　建立一种快速、简易的检测血清中抗幽门螺杆菌(Hp )细胞毒素相关蛋白A (CagA )抗体的胶体金免疫渗滤法(DIGFA )。

方法　采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金颗粒,标记葡萄球菌A 蛋白(SPA ),将重组的CagA 抗原固定于硝酸纤维素膜上,制成免疫渗滤试剂盒。

血清中抗CagA 抗体与试剂盒上金标记物及硝酸纤维素膜上的固相抗原结合后,形成肉眼可见的红色斑点。

结果　用DIGFA 与酶联免疫吸附试验(EL ISA )试剂盒对比检测了326份血清标本中抗CagA 抗体,本方法的特异性为95.8%,敏感性为97.3%,两种方法符合率为96.6%。

结论　DIGFA 检测血清中的抗CagA 抗体特异性强、灵敏度高、简便快速,无需特殊仪器设备,有广泛应用价值。

关键词:幽门螺杆菌;细胞毒素相关蛋白A ;胶体金;渗滤法;抗体中图分类号:R573 文献标识码:B 文章编号:176128259(2003)0520520202收稿日期:2002210216 修回日期:2003201202作者简介:侯瑜(19642),女(汉族),学士,实验师. 幽门螺杆菌(helicobacter pylori ,Hp )的发现是20世纪80年代医学史的重大事件,它为认识某些胃肠疾病的病因及发病机制带来了新的概念。

现已确认HP 是慢性胃炎的主要致病因子,与消化性溃疡的发生密切相关1,世界卫生组织已将其列为一类致癌因子。

目前,根据HP 菌株是否产生细胞空泡毒素(vaculating cytotoxinA ,VacA ),将HP 分为毒性株与非毒性株两大类。

产毒株HP 除产生VacA 外,还往往含有细胞毒素相关蛋白基因A (cytotoxin associated gene A ,CagA ),CagA 可能与VacA 的转录、折叠、运转及功能有关2,3。

Ca 2gA +HP 菌株占HP 的50%以上,它与消化性溃疡病的发生密切相关,与胃癌的关系也很密切。

目前国内尚缺乏CagA 阳性感染的流行病学资料,HP 感染的治疗方案复杂,早期诊断治疗效果好。

因此,早期诊断CagA +HP 感染具有重要意义,而建立CagA +HP 阳性感染的准确检测方法更显得十分必要。

1　材料和方法1.1　材料　氯金酸(HAuCl ·Cl 3·4H 2O ,成都化学试剂厂产品);葡萄球菌A 蛋白(SPA ,上海申索生物制品公司);细胞毒素相关蛋白A (CagA ,本所制备的基因工程产品);酶联免疫吸附试验检测抗CagA 2IgG 试剂盒(上海晶莹生物制品公司);血清标本(第四军医大学西京医院消化科门诊及西安市中心医院消化内科提供);低温高速离心机(德国Z323K );点膜器(美国bio 2Dot 公司)。

1.2　方法1.2.1　15nm 胶体金的制备　参照文献4\〗进行。

步骤为:去离子水溶解氯金酸,使其终浓度为0.2g ·L -1,煮沸后每100mL 加入10g ·L -1柠檬酸三钠水溶液4mL ,继续煮沸7min ,待冷却后电镜观察胶体金的颗粒直径和形状。

1.2.2　免疫胶体金的制备　取粒直径为15nm 的胶体金溶液100mL ,用0.1m ol ·L -1K 2CO 3调至pH6.2,在搅拌状态下加入SPA (1g ·L -1)0.6mL ,继续搅拌10min ;加入50g ·L -1BSA 10mL ,继续搅拌5min 。

4℃下3000r ·min -1离心5min ,弃沉淀,上清液以12000r ·min -1离心15min ,小心吸弃上清液,沉淀即为制备的胶体金。

用20mL 悬浮液悬浮沉淀,4℃保存待用。

1.2.3　免疫渗滤试剂盒的制备　试剂盒由吸水材料、硝酸纤维膜和渗滤装置三部分组成。

在硝酸纤维素膜上固相CagA 抗原,待干后用50g ·L -1BSA 封闭2h ,用0.01mol ·L -1PBS 洗涤3次,干燥后依次(吸水材料、滤纸、硝酸纤维素膜)装入自制的渗滤装置,加干燥剂封闭,4℃保存。

1.2.4　抗HP 2CagA IgG 的检测　以新鲜血清最好,用0.01mol ·L -1PBS 先将硝酸纤维素膜活化,再将0.015～0.03mL血清滴加在硝酸纤维素膜上,待完全渗入后,用0.01m ol ·L -1PBS 洗涤三滴,将已标记好的胶体金滴加在硝酸纤维素膜上,待完全渗入,再用0.01mol ·L -1PBS 洗涤三滴即可。

结果判定:以试剂盒硝酸纤维素膜上出现红色致密斑块且边缘清晰者为阳性,反之则为阴性。

结果确定时间为3～5min 。

2　结 果2.1　胶体金直径的电镜观察　用预先处理好的覆盖有For 2mvar 膜的镍网浸入胶体金溶液中,取出放置空气干燥,然后在透射电镜下观察,可见胶体金颗粒大小均匀一致,颗粒直径为15nm 。

2.2　试剂盒的特异性及敏感度　采用本实验所建立的DIG 2FA 与EL ISA 试剂盒对比检测西京医院及市中心医院326例患者血清中的抗HP 2CagA IgG ,结果见表1。

第24卷第5期2003年10月西安交通大学学报(医学版)J our nal of Xi πan J iaot ong U niversity (Medical Sciences )V ol.24N o.5Oct.2003表1　DIGFA与EL ISA检测结果比较Table1　The comparison of testing results between DIGFA and EL ISADIGFAEL ISA+-Total+1786184-5137142Total183143326 由表1可见,若以EL ISA检测HP2CagA抗体试剂盒作为参照标准,则DIGFA的特异性为95.8%,敏感度为97.3%,总符合率为96.6%。

2.3　稳定性试验　DIGFA试剂盒于4℃下放置6个月,每月检测抗HP2CagA IgG阳性及阴性血清各50份,该试剂盒的各种性能指标均稳定。

将DIGFA试剂盒于37℃恒温箱内放置6d,做热稳定性试验,与放置4℃的试剂盒对照,结果无显著差异。

3　讨 论研究表明,CagA阳性HP感染与上消化道疾病的关系更为密切,来自亚太地区的研究提示,HP感染者中,CagA阳性HP感染率相当高5。

目前公认的细菌培养、呼气试验(UBT)、组织染色等创伤性检测方法虽具有高的敏感性与特异性,可作为感染诊断标准6,7。

但上述各种方法均有患者痛苦大、所需仪器昂贵、操作步骤烦琐费时、需要专业人员等不足。

其中呼气试验对患者和医务人员以及周围环境的污染尚未解决8。

为此无创伤性检测HP感染是诊断该疾病的发展方向。

近几年,CagA阳性HP感染的诊断方法已有很大进展,特别是血清学检测方法,因其为非侵入性检测手段并且经济、简便、快速而倍受重视。

E L ISA法虽有较高的特异性和敏感性被临床认可,但仍需要专业人员和仪器,且操作时间长。

为适应大范围的CagA阳性HP感染的早期诊断,建立经济、高效、特异性强、敏感性高的检测方法已迫在眉睫。

而我们研制的该方法,经过临床检测具有以下特点:①敏感性高:由于该实验中所有样品均是逐滴滴加在硝酸纤维素膜上,使抗原、抗体充分结合从而提高了敏感度,与E L ISA法的敏感度相近。

②特异性强:本试剂盒采用高活性的重组CagA纯品做抗原,极大地提高了检测的特异性。

胶体金及免疫胶体金的性能,也是影响特异性的一个重要因素。

我们结合有关文献9,10,经过不断的试验,制备了适合本方法的直径为15nm的胶体金颗粒,并最大限度地提高标记效率。

③稳定性及重复性好:免疫胶体金的稳定性是影响试剂盒质量的一个重要因素。

免疫胶体金的制备,是金颗粒表面吸附蛋白质以形成牢固结合的过程。

该过程受酸碱度、离子强度、免疫胶体金的浓度、温度等因素的影响,其中主要取决于pH值。

为此,我们优化了胶体金标记的最佳条件和免疫胶体金悬浮的最佳配方。

④操作快速、简便:该试剂盒结构简单,易于判断结果,检测时间仅需3～5min,无需任何设备。

鉴于该方法的诸多优点,因而具有广泛的应用价值,值得推广。

参考文献:[1]庄小强,林三仁.幽门螺杆菌与胃癌的研究进展J.世界华人消化杂志,2000,8(2):2206-2207.[2]韩锋产,阎小君,侯瑜,等.定量检测HP2cagA基因内参标膜板构建及测序J.世界华人消化杂志,2000,8(2):131-134.[3]周建嫦,徐采朴,张建中.幽门螺杆菌cagA/CagA分子生物学研究进展J.世界华人消化杂志,2001,9(5):560-562.[4Roe CD,Court o y PJ,Baudhui m P.A model of p rotein colloidal gold interaction J.J Hist oche m C yt oche m,1987,35:1191-1198.[5Maeda S,O gura K,Yoshida H,et al.Major virulence f act ors, VagA a nd CagA,are commonly p ositive in Helicobacter p ylori isolates in J apa n J.Cut,1998,42:338-343.[6]陈敏章,胡伏莲,周殿元.幽门螺杆菌感染的基础与临床M.北京:中国科学技术出版社,1997.393-402.[7]吕宗舜,黄乃侠,吴琳,等.试条法监测幽门螺杆菌感染J.中华医学检验杂志,1999,22(3):169-170.[8]李冰根.检测幽门螺杆菌感染只需验血J.世界华人消化杂志,2000,8(1):103.[9Wa n g BL,Scopsi L,Martvig M,et al.Si mplified p urificationa nd testing of colloridal gold p robes J.Hist oche mist r y,1985,83:109-115.[10Seno S,A kite M,Hsuch CL.A new met hod of t he i mmunoc yt o2 che mical detection of cellular a ntigens f or light a nd elect ron mi2 croscop y J.Hist oche mist r y,1989,91:449-454.(编辑　邱　芬)(上接第512页)作用有一定的方向性,即朝近中方向,与牙齿在无近远中邻牙的情况下牙齿向近中移动的发生密切相关;同时牙移动路径上有无阻力及越隔纤维对牙齿的牵拉,对牙齿的移动方向也起着关键作用。